多糖技術(shù)路線圖

1、Molish反應(yīng)Fehling反應(yīng)鄰苯二甲酸-苯胺顯色反應(yīng)間苯二胺試驗(yàn)3,5-二硝基水楊酸顯色法Somogyi-Nelson顯色法比阿耳（Bial）反應(yīng)本尼迪克（Benedict）試驗(yàn)謝里萬(wàn)諾夫（CenHB）HOB試驗(yàn)J分光光度法離子交換色譜氣相色譜法曰J凝膠電泳法高效液相色譜法r苯酚一硫酸反應(yīng)顯色劑法，與慈酮-硫酸反應(yīng)水提醇沉高溫水提取法堿提取法超臨界提取法4酶提取法超聲波提取法微波提取法超高壓提取法工復(fù)合提取法溶劑處理法sevag法、三氟三氯乙烷法,蛋白質(zhì)去除三氯醋酸法吸附劑離子交換柱氧化劑卜色素去除透析法J除無(wú)機(jī)鹽、單糖分化，鉛鹽沉淀法沉淀法，銅鹽沉淀法鈣、鍋及鋼鹽沉淀法A1r活性炭柱層

2、析纖維素柱層析柱層析分離法彳離子交換柱層析凝膠柱層析季俊鹽沉淀純化金屬絡(luò)合物法體內(nèi)外抗氧化性、免疫調(diào)節(jié)活性抗腫瘤活性酶抑制活性物理常數(shù)抗菌活性抗凝血活性甲基化法、高碘酸氧化反應(yīng)smith降解酸水解紫外、紅外、核磁共振波譜,化學(xué)分析法測(cè)定分子量測(cè)定場(chǎng)解吸質(zhì)譜廣電噴霧質(zhì)譜電子轟擊質(zhì)譜化學(xué)電離質(zhì)譜快原子轟出質(zhì)譜動(dòng)態(tài)滲透壓法光散射法端基法粘度法凝膠電泳法凝膠色譜HPLCI,法、HPLC質(zhì)譜法電泳儀器分析法酶法、免疫學(xué)法：生物分析法核磁共振波譜法、圓二色譜法結(jié)構(gòu)分析色譜鑒別薄層層析色譜鑒別,凝膠層析電泳超離心法提取方法：1水提醇沉2高溫水提取法3堿提取法4超聲波提取法5酶提取法6復(fù)合提取法7微博提取法8

3、超高壓提取9超臨界提取法水提取法：常用溫度7090度，每次回流提取2h酸提取：將植物用品浸泡在稀酸水溶液中，再調(diào)節(jié)溶液PH至中性，用水提醇沉得到多糖超聲波提?。哼m用超筆技術(shù)江植物樣品浸泡一段時(shí)間，再熱水浸提超高壓提?。合葘?duì)物料加壓再泄壓，細(xì)胞內(nèi)外形成壓力差，植物細(xì)胞壁在高壓下破裂，釋放多糖。將植物樣品加入水中，攪拌，調(diào)節(jié)PH,裝入聚乙烯袋中在高壓容器中進(jìn)行高壓處理，過(guò)濾減壓濃縮得到多糖提取時(shí)間遠(yuǎn)少于熱水提取，操作簡(jiǎn)單，提取率高微波提?。和ㄟ^(guò)微波熱效應(yīng)及產(chǎn)生的電磁波效應(yīng)，加快分子的運(yùn)動(dòng)，迅速釋放多糖復(fù)合提取法：纖維素酶輔助超聲提取糖類分離方法：1溶劑處理法2沉淀法（鉛鹽沉淀法、銅鹽沉淀法、鈣、鋸

4、及砌復(fù)鹽形成法）3大孔樹(shù)脂處理法4柱層析分離法（活性炭柱層析、纖維素柱層析、離子交換柱層析、淀粉柱層析、凝膠柱層析)5陰離子交換色譜法蛋白質(zhì)的去除：用分級(jí)沉淀法得到的多糖，?；煊休^多的蛋白質(zhì)，必須予以去除。一般選擇那些使蛋白質(zhì)沉淀而使多糖不沉淀的試劑來(lái)處理，如酚、三氯乙酸、鞍酸等。但必須處理時(shí)間短，溫度低，避免多糖降解。而要達(dá)到除盡游離蛋白質(zhì)的目的仍需反復(fù)多次處理。除去蛋白質(zhì)的常用方法有：(1) .Sevag法：根據(jù)蛋白質(zhì)在氯仿CHC3等有機(jī)溶劑中變性的特點(diǎn)，用氯仿：戊醇或丁醇5:1或4:1混合液與糖提取物混合，劇烈震蕩2030min,蛋白質(zhì)與氯仿-戊醇或丁醇溶液形成凝膠而分離，離心，分去水層

5、和溶劑層交界處的變性蛋白質(zhì)。這種方法在避免糖降解上有較好的效果，但效率不高，如能配合加入蛋白質(zhì)水解酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶等)，使蛋白質(zhì)大分子進(jìn)行一定程度降解，再用Sevag法處理，效果會(huì)更好。(2) .三氟三氯乙烷法F3C-CCI3：按多糖提取液：三氟三氯乙烷1：1混合，在低溫下攪拌約10min,離心得上層水溶液，水層反復(fù)用上述方法處理幾次，即得無(wú)蛋白質(zhì)的多糖溶液。此法效率高，但溶劑沸點(diǎn)低，易揮發(fā)，不宜大量使用。(3) .三氯醋酸法F3CCOOH在多糖水溶液中滴加3獷氯醋酸,直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，在510放置過(guò)夜，離心除去沉淀，即得純的多糖溶液。此法會(huì)引起某些多糖的降解。色素的

6、去除植物多糖提取物中含有酚類化合物而使其顏色較深，可用吸附劑（纖維素、硅藻土、活性炭等）、離子交換柱（DEAE一纖維素）、氧化劑（H2O2）等脫除。活性炭比表面積大，吸附能力強(qiáng)，在進(jìn)行當(dāng)歸多糖的提取時(shí)只向多糖液中加入了0.1%左右的活性炭，煮沸后濾過(guò)即完成了脫色操作。此法成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。（3）透析法除無(wú)機(jī)鹽、單糖、多糖（4）季錢鹽沉淀純化（5）金屬絡(luò)合物法三定性反應(yīng)試驗(yàn)：（1） Molish反應(yīng)（2） Fehling反應(yīng)：+a-秦酚-濃硫酸-紫紅色環(huán)（3）鄰苯二甲酸-苯胺顯色反（4）間苯二胺試驗(yàn)（1）a祭酚試驗(yàn)（Molisch紫環(huán)反應(yīng)）：取檢品的水溶液1ml,加5%禁酚試液數(shù)滴振搖后

7、，沿管壁滴入56滴濃硫酸，使成兩液層，待2-3分鐘后，兩層液面出現(xiàn)紫紅色環(huán)（糖、多糖或就類）。多糖類遇濃硫酸被水解成單糖，單糖被濃硫酸脫水閉環(huán)，形成糠醛類化合物，在濃硫酸存在下與a茶酚發(fā)生酚醛縮合反應(yīng)，生成紫紅色縮合物?！咀ⅰ烤偷姆肿咏Y(jié)構(gòu)中含有糖基，一般屬于單糖類，如葡萄糖，鼠李糖、半乳糖，但也有含二分子糖（雙糖）或多分子糖（多糖）。在上述反應(yīng)條件下，就被水解成單糖，因此就茶酚試驗(yàn)，系分子中糖部分的反應(yīng)。由于此反應(yīng)較為靈敏，如有微量濾紙纖維或中草藥粉末存在于溶液中，都能產(chǎn)生上述反應(yīng)。故濾過(guò)時(shí)應(yīng)加注意。（2）堿性酒石酸銅試液：取檢品的水溶液12ml（如為醇溶液須將醇蒸發(fā)除去），加入堿笥酒石酸銅試

8、液1ml,于沸水浴上加熱5分鐘，產(chǎn)生棕紅色或傳紅色氧化亞銅沉淀，示有還原糖。還原糖能使二價(jià)銅鹽（藍(lán)色）還原成氧化亞銅，醛糖的醛基氧化成竣基：【注】如檢液呈酸性，應(yīng)先堿化。此反應(yīng)所產(chǎn)生的沉淀由于條件不同，其顏色也不同，質(zhì)點(diǎn)上的呈黃色，質(zhì)點(diǎn)大的呈紅色。有保持性膠體存在時(shí)，也常產(chǎn)生黃色沉淀。職樣品中含有其他醛、酮及還原較強(qiáng)的其他成分，或中劃藥制劑中附加的抗氧劑、；葡萄糖等均可顯陽(yáng)性反應(yīng)。（3）鄰苯二甲酸-苯胺顯色反應(yīng)：用毛細(xì)管將樣品提取液點(diǎn)于濾紙上，溶劑揮干后，置于展開(kāi)缸中，以甲醇為展開(kāi)劑展開(kāi)。展開(kāi)后取出濾紙，揮干溶劑，噴鄰苯二甲酸-苯胺試劑。104c烘10分鐘，顯紅色棕色斑點(diǎn)，表明有還原糖存在。(

9、4)見(jiàn)苯二胺試驗(yàn)：取水提樣點(diǎn)在濾紙上，噴灑間二苯胺試劑，在105c加熱5min,如呈現(xiàn)黃色熒光，表明可能含有糖。定量(1)與慈酮-硫酸反應(yīng)：糖類與濃硫酸脫水生成糠醛或糠醛衍生物，可與慈酮試劑縮合成有色物質(zhì)，反應(yīng)后呈藍(lán)綠色溶液。方法是：取樣品熱水提取液1mL置于小試管中，加入24mL；1酮試劑，在沸水浴中加熱，沸騰10分鐘后，若溶液呈藍(lán)綠色，表明有糖存在。慈酮-硫酸顯色反應(yīng)非常靈敏，樣品中切勿混入塵埃等雜質(zhì)，要用高純度硫酸。不同糖類與慈酮的顯色有差異，穩(wěn)定性也不同，顯色后應(yīng)及時(shí)觀察。測(cè)定總糖含量。【注意】當(dāng)樣品中含有色氨酸含量較高的蛋白質(zhì)存在時(shí)，溶液呈紅色而干擾反應(yīng)。四多糖分子量測(cè)定：凝膠柱、質(zhì)譜分析、化學(xué)電離質(zhì)譜、場(chǎng)解析質(zhì)譜、快原子轟出質(zhì)譜、電噴霧質(zhì)譜、鑒定：紙色譜、薄層色譜、氣相色譜、離子交換色譜、液相色譜五純度的檢驗(yàn)方法：1總糖、糖醛酸含量：比色法分析了多糖的總糖、糖醛酸含單。2雜質(zhì)的含量測(cè)定一一紫外光譜UV法：紫外檢測(cè)顯示多糖在260nm和280nm無(wú)核酸和蛋白特征吸收峰。色素：多糖外觀為白色粉末，不含核酸、蛋白、多肽等雜質(zhì)3多糖的官能團(tuán)特征2構(gòu)的確證一一IRIR:紅外檢測(cè)顯示多糖具有多糖類物