楊榮武生物化學(xué)原理第四章蛋白質(zhì)的性質(zhì)分類及研究方法

1、1第四章第四章 蛋白質(zhì)的性質(zhì)及研究方法蛋白質(zhì)的性質(zhì)及研究方法肌紅蛋白晶體2第一節(jié)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)紫外吸收：最大吸收峰為280nm兩性解離：蛋白質(zhì)的pI值不能直接計算，只能使用等電聚焦等方法進(jìn)行測定膠體性質(zhì)沉淀反應(yīng)：鹽析、pI 沉淀、有機(jī)溶劑引起的沉淀和重金屬鹽作用造成的沉淀變性、復(fù)性水解顏色反應(yīng)3蛋白質(zhì)變性L 蛋白質(zhì)受到某些理化因素的作用，其高級結(jié)構(gòu)受到破壞、生物活性隨之喪失的現(xiàn)象。L 導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性的物理因素有：加熱、冷卻、機(jī)械作用、流體壓力和輻射；化學(xué)因素有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高濃度鹽、尿素、重金屬鹽、疏水分子和有機(jī)溶劑。L 蛋白質(zhì)變性以后，其理化性質(zhì)發(fā)生一系列的變化。這些

2、變化可以作為檢測蛋白質(zhì)變性的指標(biāo)。主要的變化包括：（1）溶解度降低。（2）粘度增加。（3）生物活性喪失。（4）更容易被水解。（5）結(jié)晶行為發(fā)生變化。4蛋白質(zhì)的水解L 蛋白質(zhì)在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或蛋白酶的催化下均能夠發(fā)生水解。但需要注意的是，酸水解會破壞幾種氨基酸，特別是Trp幾乎全部被破壞，其次是三種羥基氨基酸。另外Gln和Asn在酸性條件下，容易水解成Glu和Asp。酸水解常用硫酸或鹽酸，使用最廣泛的是鹽酸；堿水解會導(dǎo)致多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，并且產(chǎn)生消旋現(xiàn)象，但不會破壞Trp；酶水解效率高、不產(chǎn)生消旋作用，也不破壞氨基酸，但由于不同的蛋白酶對肽鍵特異性不一樣，因此，由一種酶水解獲得的通常是蛋

3、白質(zhì)的部分水解產(chǎn)物。5四種羧肽酶來源和特異性四種羧肽酶來源和特異性6幾種蛋白酶特異性的比較幾種蛋白酶特異性的比較7反應(yīng)名稱反應(yīng)試劑顏色用處雙縮脲反應(yīng)硫酸銅，堿性溶液紫紅色（540nm）定量測定蛋白質(zhì)黃色反應(yīng)硝酸先產(chǎn)生白色沉淀，加熱變黃，再加堿呈橙黃色鑒定含有芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)米倫氏反應(yīng)硝酸、硝酸汞、亞硝酸、亞硝酸汞混和液先是白色沉淀，加熱后變成紅色鑒定含有Tyr殘基的蛋白質(zhì)乙醛酸反應(yīng)乙醛酸、濃硫酸紫色環(huán)鑒定含有Trp殘基的蛋白質(zhì)坂口反應(yīng)次氯酸鈉、-萘酚、氫氧化鈉紅色鑒定含有Arg的蛋白質(zhì)福林反應(yīng)磷鉬酸、磷鎢酸藍(lán)色Lowry法鑒定含有Tyr殘基的蛋白質(zhì)醋酸鉛反應(yīng)醋酸鉛黑色含有Cys的蛋白質(zhì)考馬

4、斯亮藍(lán)結(jié)合反應(yīng)考馬斯亮藍(lán)G-250酸性溶液藍(lán)色Bradford法定量測定蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)的各種顏色反應(yīng)蛋白質(zhì)的各種顏色反應(yīng)8蛋白質(zhì)研究方法假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)假定你發(fā)現(xiàn)一種新的蛋白質(zhì)：蛋白質(zhì)X1. 如何得到這種蛋白質(zhì)? 蛋白質(zhì)的分離、純化技術(shù)2. 這種蛋白質(zhì)的大小？ （SDS-PAGE）3.它的pI是多少？ （等電聚焦）4. 其他細(xì)胞或其他生物體內(nèi)是否存在？ （Western印跡）5. 其一級結(jié)構(gòu)如何？ （序列分析）6.其三維結(jié)構(gòu)又如何？ X-射線衍射和核磁共振9蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化一、準(zhǔn)備工作 要解決三個問題：（1）純化蛋白質(zhì)的目的；（2）目標(biāo)蛋白的測活方法；（3）純化蛋白質(zhì)的原料。

5、二、純化步驟：（1）破碎細(xì)胞或組織（混合和勻漿）；（2）去除殘渣（離心）；（3）沉淀/濃縮（硫酸銨或聚乙二醇）；（4）純化（層析）；（5）鑒定1011等電聚焦需要在凝膠中加入兩性電解質(zhì)，以在陽極和陰極之間建立遞增的pH梯度，處在其中的蛋白質(zhì)分子在電場的作用下遷移，最后各自移動到并聚焦于與其pI相當(dāng)?shù)膒H位置上。于是通過等電聚焦，不僅可以實現(xiàn)pI不同的蛋白質(zhì)之間的分離，而且還可以測定出各種蛋白質(zhì)的pI12蛋白質(zhì)的雙向電泳蛋白質(zhì)的雙向電泳13Western印跡14第二節(jié) 蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 直接測定法 間接測定法。 先得到某一種蛋白質(zhì)基因的核苷酸序列，然后根據(jù)通用的遺傳密碼表間接推導(dǎo)出由其決定的

6、氨基酸序列。15測定步驟主要試劑和方法備注1詳見蛋白質(zhì)的純化2極端pH；8mol/L 尿素；6mol/L 鹽酸胍；高鹽 (常用硫酸氨)。如果肽鏈之間以二硫鍵相連，可使用步驟3的方法進(jìn)行拆分。3過甲酸氧化法；巰基類還原劑還原法：巰基乙醇；二硫蘇糖醇（DTT）或二硫赤蘚糖醇。第二種方法需要使用烷基化試劑，如碘代乙酸，防止二硫鍵從新形成。4氨基酸自動分析儀為步驟6和7選擇合適的裂解法提供有用的信息。5N-端測定：Sanger試劑法；丹磺酰氯法；PTIC或其衍生物測定法。C-端測定：肼解法；還原法：使用硼氫化納將C-端氨基酸殘基轉(zhuǎn)變成氨基醇，而將它與其它氨基酸區(qū)別開來。羧肽酶法（羧肽酶A、B，參考表4-2）如果N-端氨基被封閉，不能直接使用表中的方法，需要根據(jù)可能的封閉類型，區(qū)別對待。如果氨基是被甲酰或乙?；忾]的，需要先將甲酰基或乙?；狻Ｈ绻被潜唤构劝滨；忾]的，可以使用專門水解焦谷氨酸殘基的焦谷氨