蛋白濃度測定的方法說課材料

1、蛋白質含量測定蛋白質含量測定(cdng)的方法的方法 1、微量凱氏定氮法2、雙縮脲法（Biuret）3、Folin-酚試劑(shj)法（Lowry）4、紫外吸收法5、考馬斯亮藍法（Bradford）6、BCA比色法第一頁，共7頁。1、微量凱氏（、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法）定氮法 原理：含氮有機物與濃硫酸共熱分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫原理：含氮有機物與濃硫酸共熱分解產生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸銨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和酸銨。經強堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。的

2、程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應式如下：若以甘氨酸為例，其反應式如下：H2NCH2COOH+ 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)為了加速消化，可以加入為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強酸。可用硼酸溶液，滴定則用強酸。計算所得結果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白計算所得結果為樣品總氮量，如欲求

3、得樣品中蛋白含量，應將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以氮即得。如欲進一步求得樣品中蛋白質的含量，即用樣品中蛋白氮乘以6.25即得。即得。 靈敏度：低。靈敏度：低。0.2 1.0mg氮，誤差為氮，誤差為 2 時間：費時時間：費時 810小時小時 說明：用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長說明：用于標準蛋白質含量的準確測定；干擾少；費時太長 干擾物質干擾物質(wzh)：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離）：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質而分離） 第二頁，共7頁。2、雙縮脲法（、雙縮脲法（Biuret法）法） 原理：蛋白質含有兩個以上的肽

4、鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中，原理：蛋白質含有兩個以上的肽鍵，因此有雙縮脲反應。在堿性溶液中，蛋白質與蛋白質與Cu2+形成紫色絡合物，此紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質含量成形成紫色絡合物，此紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質含量成正比，而與蛋白質的相對分子量及氨基酸成分正比，而與蛋白質的相對分子量及氨基酸成分(chng fn)無關，故可用來無關，故可用來測定蛋白質含量。測定蛋白質含量。多肽鍵堿性多肽鍵堿性Cu2紫色絡合物紫色絡合物 靈敏度：低。靈敏度：低。120mg時間：中速，時間：中速，2030分鐘分鐘優(yōu)點：較快速，不同的蛋白質產生顏色的深淺相近，以及干擾物質少。優(yōu)點：較快速，不同的蛋白質產生

5、顏色的深淺相近，以及干擾物質少。缺點：靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的缺點：靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質測定。蛋白質測定。干擾物質：硫酸銨、干擾物質：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等緩沖液和某些氨基酸等說明：用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似說明：用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質顯色相似 第三頁，共7頁。3、Folin酚試劑酚試劑(shj)法（法（Lowry法）法） 顯色原理：與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，顯色原理：與雙縮脲方法相同，只是加入了第二種試劑，F(xiàn)olin酚，以增加顯色量提高靈酚，以增加顯色量提

6、高靈敏度。這兩種顯色反應產生深藍色，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。敏度。這兩種顯色反應產生深藍色，在堿性條件下，蛋白質中的肽鍵與銅結合生成復合物。Folin酚試劑中的磷鉬酸鹽酚試劑中的磷鉬酸鹽磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深磷鎢酸鹽被蛋白質中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產生深藍色（鉬藍和鎢藍的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的含量成正比。藍色（鉬藍和鎢藍的混合物）。在一定的條件下，藍色深度與蛋白的含量成正比。干擾物質：硫酸銨；干擾物質：硫酸銨； Tris緩沖液；甘氨酸；各種硫醇緩沖液；甘氨酸；各種硫醇 ；酚類、檸檬酸、糖類、甘油等。濃；酚類、檸檬酸

7、、糖類、甘油等。濃度較低的尿素（度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（），三氯乙酸（0.5%），乙醇），乙醇（5%），乙醚（），乙醚（5%），丙酮（），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須）等溶液對顯色無影響，但這些物質濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉氫氧化鈉溶液的濃度氫氧化鈉溶液的濃度12倍。倍。靈敏度：

8、高，靈敏度：高， 5mg 。20250mg。時間：慢速，時間：慢速，4060分鐘分鐘優(yōu)點：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。優(yōu)點：靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多。缺點：費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，缺點：費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質較多。干擾物質較多。說明：顏色深淺隨不同蛋白質變化。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。加說明：顏色深淺隨不同蛋白質變化。也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。加Folin酚試酚試劑時要特別小心，該試劑僅在酸性劑時要特別小心，該試劑僅在酸性(sun xn)pH條件下穩(wěn)定，但上述

9、還原反應只在條件下穩(wěn)定，但上述還原反應只在pH=10的情況下發(fā)生，故當?shù)那闆r下發(fā)生，故當Folin一酚試劑加到堿性的銅一酚試劑加到堿性的銅蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸在磷鉬酸磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發(fā)生。第四頁，共7頁。4、紫外吸收、紫外吸收(xshu)法法原理：由于蛋白質分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收原理：由于蛋白質分子中，酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度與蛋白質含量成

10、正比，可用作定量測定處，其吸光度與蛋白質含量成正比，可用作定量測定(cdng)。靈敏度：較高，靈敏度：較高，50100mg時間：時間：510分鐘分鐘干擾物質：各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸干擾物質：各種嘌吟和嘧啶；各種核苷酸 優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定(cdng)。特別適用于柱。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，利用層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，利用280nm進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況是進行紫外檢測，來判斷蛋白質吸附或洗脫情況是最常用的方法。最常用的方法。缺點：準確度較差，干擾物質多，在用標準曲

11、線法測定缺點：準確度較差，干擾物質多，在用標準曲線法測定(cdng)蛋白質含量時，對那些與標蛋白質含量時，對那些與標準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定準蛋白質中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質，有一定的誤差。故該法適于用測定(cdng)與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經算的方法，加以適當?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經過校正，測定過校正，

12、測定(cdng)的結果還是存在一定的誤差。的結果還是存在一定的誤差。說明：用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正說明：用于層析柱流出液的檢測；核酸的吸收可以校正 。由于蛋白質吸收高峰常因。由于蛋白質吸收高峰常因pH的改的改變而有變化，因此要注意溶液的變而有變化，因此要注意溶液的pH值，測定值，測定(cdng)樣品時的樣品時的pH要與測定要與測定(cdng)標準曲標準曲線的線的pH相一致。相一致。 第五頁，共7頁。5、考馬斯亮蘭法（、考馬斯亮蘭法（Bradford法）法） 原理：原理：1976年由年由Bradford根據蛋白質與染料相結合的原理設計根據蛋白質與染料相結合的原理設計(shj)。

13、考馬斯亮蘭?？捡R斯亮蘭G-250染料，染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰由在酸性溶液中與蛋白質結合，使染料的最大吸收峰由465nm變?yōu)樽優(yōu)?95nm，溶液的顏色也由棕黑色，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸變?yōu)樗{色。經研究認為，染料主要是與蛋白質中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結合。殘基相結合。在在595nm下測定的吸光度值下測定的吸光度值A595與蛋白質濃度成正比。與蛋白質濃度成正比。靈敏度：最高。靈敏度：最高。15mg 時間：時間：515分鐘分鐘干擾物質：強堿性緩沖液；干擾物質：強堿性緩

14、沖液；TritonX-100; SDS；去污劑。；去污劑。優(yōu)點：（優(yōu)點：（1）靈敏度高。（）靈敏度高。（2）快速、簡便，只需加一種試劑。（）快速、簡便，只需加一種試劑。（3）干擾物質少。）干擾物質少。缺點：（缺點：（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質測定時）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用有較大的偏差，在制作標準曲線時通常選用 g球蛋白為標準蛋白質以減少這方面的偏差。球蛋白為標準蛋白質以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質干擾此法的測定。）仍有一些物質干擾此法的測定。（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。蛋白質的濃度。 說明：最好的方法；說明：最好的方法； 干擾物質少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質變化干擾物質少；顏色穩(wěn)定；顏色深淺隨不同蛋白質變化 第六頁，共7頁。6、BCA比色法比色法 原理：在堿性溶液中，蛋白質將原理：在堿性溶液中，蛋白質將Cu2+還愿為還愿為Cu+再與再與BCA試劑（試劑（4，4 -二羧酸二羧酸-2，2 -二喹啉鈉）生成紫色復合物，于二喹啉鈉）生成