臨床ELISA檢驗影響因素5ppt課件

1、臨床臨床ELISAELISA檢驗影響要素檢驗影響要素保定市疾控中心艾滋病初篩中心實驗室 臨床ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定方式 標本的搜集保管 試劑預(yù)備 加樣 溫育 洗板 顯色 比色 結(jié)果判別 結(jié)果報告及解釋等方面用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清漿，有時由于特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上運用血清標本測定的標志物普通有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的搜集，要留意搜集時間甚或體位有能夠會對測定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨46點之間，會有一峰值出現(xiàn)

2、：生長激素、促黃體激素LH和促卵泡激素FSH均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在親密相連的時間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測，應(yīng)根據(jù)藥代動力學(xué)選擇服藥后的最適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的搜集那么沒有時間和體位方面的影響，只是在處置和保管方面要思索以下幾個方面： 一一. .臨床標本的搜集和保管臨床標本的搜集和保管1要留意防止出現(xiàn)嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標志酶的ELISA測定中，如血清標本

3、中血紅蛋白濃度較高，那么其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面參與的HRP底物反響顯色。 2樣本的采集及血清分別中要留意盡量防止細菌污染，一那么細菌的生長，其所分泌的一些酶能夠會對抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用；二那么一些細菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的-半乳糖苷酶本身會對用相應(yīng)酶作標志的測定方法產(chǎn)生非特異性干擾。 3血清標本如是以無菌操作分別，那么可以在28下保管一周，如為有菌操作，那么建議冰凍保管。樣本的長時間保管，應(yīng)在-70以下。 4冰凍保管的血清標本須留意防止因停電等呵斥的反復(fù)凍融。標本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標本的混勻

4、亦應(yīng)留意，不要進展猛烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。 5標本在保管中如出現(xiàn)細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測。 在臨床實驗室，對試劑預(yù)備普通不太留意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有能夠影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測定中試劑的預(yù)備最為關(guān)鍵的是，在實驗開場前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進展測定，以使試劑盒在運用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反響步驟中，能使反響微孔內(nèi)的溫度能較快地到達所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA

5、試劑盒中的洗板液均需在實驗室運用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)保證質(zhì)量。此外，當(dāng)試劑盒以O(shè)PD為底物時，那么底物溶液應(yīng)在反響顯色前暫時配制二、試劑預(yù)備在如今的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的參與幾乎是獨一的要運用微量加樣器參與樣本的步驟。運用微量加樣器加樣必需留意的關(guān)鍵點是：加樣不可太快，要防止加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會對臨近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡那么反響液界面有差別。試劑的參與在國產(chǎn)試劑盒中根本上均是從滴瓶中滴加，除了要留意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加

6、太快，很容易出現(xiàn)反復(fù)滴加或加在兩孔之間的景象，這樣就會在孔內(nèi)的非包被區(qū)出現(xiàn)非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用一樣的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。 三、加血清樣本及反響試劑三、加血清樣本及反響試劑 溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個要素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反響在固相上進展，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必需在一定的溫度條件下反響一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，那么所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37和室溫，其次是43和28。溫育這一步是臨床EL

7、ISA測定中最容易出現(xiàn)問題的步驟。通常目前國內(nèi)ELISA商品試劑盒的反響溫育時間為37 30分鐘1小時，進口ELISA試劑盒那么通常為37 12小時才干有較完全的結(jié)合，低于1小時，能夠會影響測定下限。因此，關(guān)于溫育，在實踐測定操作中一定要留意以下幾點： 四、溫育四、溫育1要保證在設(shè)定的溫度下有足夠的反響時間。普通來說，加完樣本和/或反響試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內(nèi)溫度從室溫升至37，需求一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的形狀下，這段升溫時間能夠還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人留意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開場計時，這樣就很容易呵斥實踐測定中溫育時間不夠

8、，弱陽性樣本測不出來的問題。這能夠就與南方冬天室內(nèi)溫度較低有關(guān)，此時微孔板轉(zhuǎn)入溫箱后37溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節(jié)不同室溫下微孔板從室溫拿至溫箱后需求多長時間孔內(nèi)溫度才干到達37，從而適當(dāng)延伸板條在溫箱中的放置時間。詳細的做法是，用一小溫度計放置板孔反響溶液中丈量察看即可。 2溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的闡明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37下1小時，另一種那么為43下45分鐘。從免疫測定的抗原抗體反響的本質(zhì)來看，在較低的溫度下反響較長的時間最為完全。如28下反響24小時。較高的反響溫度，

9、由于分子運動的加憐惜，反響時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本那么有漏檢的能夠。因此，建議在臨床ELISA測定中盡量運用較低溫育溫度較長反響時間的條件。3“邊緣效應(yīng)的排除。以前在運用96孔板的ELISA測定中，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)，即外周孔顯色較中心孔深，產(chǎn)生這種“邊緣效應(yīng)的緣由能夠為96孔板周孔與中心孔外表或熱力學(xué)特征的不同。但有研討證明在溫育中的熱力學(xué)梯度能夠是根本緣由之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中，將板從室溫通常在25左右置于37溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間能夠存在一熱力學(xué)梯度。因此運用水浴或在將反響

10、溶液參與至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度如37，就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)，并且可提高測定的反復(fù)性。 總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡一方法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或?qū)⒔杆纳巢挤湃胍淮箫埡兄谐梢粷窈?，放于溫箱中，這樣就會由于板條孔底部直接與37水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內(nèi)的高溫度，而使反響溶液的溫度迅速與溫室平衡。 固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反響溫育過程中吸附的非特異成份別分開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其

11、關(guān)鍵的一步。以HRP作為標志酶的ELISA試劑盒中運用的洗板液普通為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，借助其疏水基團與經(jīng)疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團構(gòu)成疏水鍵，從而減弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結(jié)協(xié)作用下，促使蛋白質(zhì)脫離固相而進入液相，這樣就可到達去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是經(jīng)過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要留意非離子去垢劑的運用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體

12、解吸附而影響實驗的測定下限 ： 五、洗板五、洗板 在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板普通有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反響溫育后，將反響液吸出或甩干，然后在板孔中加滿洗液，放置23分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。反復(fù)上述洗滌步驟34次，最后在吸水紙上拍干，即可進展下一步測定操作。洗板機洗板那么是將上述手工操作改由洗板機進展，運用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數(shù)要少于殘留量大的洗板機。 在目前的以HRP作為標志酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，那么提供的底物為A和B兩瓶運用液；如

13、以O(shè)PD為底物，那么試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。普通商品試劑盒顯色反響條件為37或室溫反響1530分鐘。從實際上說，3730分鐘才可以使HRP的底物催化反響完全，雖然在最初的10分鐘內(nèi)，絕大部份催化反響即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37下反響2530分鐘后，終止反響比色測定。 此外，在參與底物開場顯色反響前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，察看能否有顯色出現(xiàn)，如有，那么闡明底物已蛻變。以O(shè)PD為底物，配好后應(yīng)為無色，否那么就不能運用。以TMB為底物，整個顯色反響過程無需避光，而以O(shè)PD為底物

14、，那么需避光進展。關(guān)于TMB和OPD的顯色反響特點及留意點可參考前面有關(guān)章節(jié)內(nèi)容。顯色反響完成后，參與酸終止反響，振蕩混勻后即可進展下面的比色測定或肉眼判別結(jié)果。 六、顯色六、顯色 ELISA的比色測定由酶標儀進展，有的同行能夠會以為，既然由酶標儀進展，那么此時便可以萬事大吉了，其實不然，由于當(dāng)代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，運用不當(dāng)，會得到令人難以了解的結(jié)果。如運用酶標儀比色測定后，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數(shù)或測定假陽性率大大添加等等。這主要是沒有正確地了解和運用酶標儀所致。至于如何正確了解和運用酶標儀詳見后面有關(guān)章節(jié)。此處，只是強調(diào)下面兩點： 七、比色七、比色1比色測定時，

15、一定要留意酶標儀的波長能否已調(diào)至適宜或所用濾光片能否正確。由于有的臨床實驗室在進展ELISA測定時，以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有運用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時改換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。 2單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀根本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進展比色測定；而雙波長雙色那么酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反響特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物

16、所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改動波長至一定值，使得樣本測定酶反響特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數(shù)值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優(yōu)點，普通不用設(shè)空白孔。如在運用雙波長比色時，仍設(shè)空白孔，就能夠會呵斥前面提到的測定孔吸光度為負數(shù)的景象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有能夠得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是運用

17、雙波長比色。八、結(jié)果斷定 臨床ELISA測定按其表示測定結(jié)果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中能否含有待測抗原或抗體作出“有或“無的結(jié)論，分別用“陽性和“陰性來表示。可見定性測定通常是用于傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判別特定病原體感染的存在與否。而定量測定那么是對標本中待測抗原的多少進展量值測定，以詳細數(shù)值表示。定量測定根本上是用于非病原體抗原物質(zhì)的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子藥物等。ELISA定性測定的“陽性和“陽性的斷定根據(jù)是試劑盒所確定的陽性斷定值Cut-off。定量測定的“量值根據(jù)是試劑盒中所帶規(guī)范品同時測定得出的劑量反響曲線又稱規(guī)范曲線。下面再解

18、釋一下在ELISA定性測定結(jié)果斷定中常用的一些縮寫。 1S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑制法外，其它ELISA定性測定方式中，當(dāng)S/CO值大于或等于1時，標本的測定為陽性，小于1時為陰性。 2S/N或P/N：其中S同1，N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient患者的簡寫。較早的試劑盒很多都運用S/N或P/N2.1為陽性斷定規(guī)范，現(xiàn)仍有一些試劑盒運用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區(qū)別，只不過是前者將陰性對照N的2.1倍視為Cut-off值而已。九、結(jié)果報告及解釋 臨床ELISA測定結(jié)果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定那么報出詳細