HN亞型禽流感病毒感染性克隆的構(gòu)建PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1HN亞型禽流感病毒感染性克隆的構(gòu)建亞型禽流感病毒感染性克隆的構(gòu)建匯報提綱：匯報提綱：v 文獻綜述文獻綜述v RNA RNA干擾對干擾對A A型流感病毒基因表達及病毒復(fù)制型流感病毒基因表達及病毒復(fù)制 的抑制作用的研究的抑制作用的研究v H5N1亞型禽流感病毒亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 全基因組克隆、測序全基因組克隆、測序及其感染性克隆的構(gòu)建及其感染性克隆的構(gòu)建 第1頁/共80頁1 1 文獻綜述文獻綜述 文獻綜述文獻綜述第2頁/共80頁禽流感的發(fā)生與流行禽流感的發(fā)生與流行 文獻綜述文獻綜述禽流感禽流感（Avian Influenza, AI），是由，是由

2、A型流感病毒引型流感病毒引起的一種禽類的烈性傳染性疾病或疾病綜合征。起的一種禽類的烈性傳染性疾病或疾病綜合征。1878年，年，首次在意大利發(fā)現(xiàn)了禽流感的流行。首次在意大利發(fā)現(xiàn)了禽流感的流行。高致病性禽流感（高致病性禽流感（Highly Pathogenic Avian Highly Pathogenic Avian Influenza, HPAIInfluenza, HPAI）是由）是由A型流感病毒中型流感病毒中H5H5、H7H7亞型流亞型流感病毒引起，目前已經(jīng)呈世界性分布，感病毒引起，目前已經(jīng)呈世界性分布， 全世界全世界5050多個多個國家和地區(qū)（國家和地區(qū)（OIEOIE數(shù)據(jù)）報道了高致病性

3、禽流感的發(fā)生數(shù)據(jù)）報道了高致病性禽流感的發(fā)生和流行。和流行。我國自我國自19961996年首次報道分離到年首次報道分離到H5N1H5N1亞型高致病性禽流感亞型高致病性禽流感病毒之后，其流行一直呈上升趨勢。病毒之后，其流行一直呈上升趨勢。第3頁/共80頁世界上高致病性禽流感感染人的發(fā)病世界上高致病性禽流感感染人的發(fā)病與死亡情況（截至與死亡情況（截至2006-6-03） 文獻綜述文獻綜述第4頁/共80頁第5頁/共80頁 文獻綜述文獻綜述第6頁/共80頁 文獻綜述文獻綜述第7頁/共80頁 文獻綜述文獻綜述ATP、RNA解旋解旋酶酶第8頁/共80頁 文獻綜述文獻綜述第9頁/共80頁病毒的感染性克隆其實

4、就是模擬病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等病病毒的感染性克隆其實就是模擬病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等病毒生命周期，人工構(gòu)建病毒的過程。毒生命周期，人工構(gòu)建病毒的過程。病毒的感染性克隆也稱為病毒的反向遺傳操作技術(shù)病毒的感染性克隆也稱為病毒的反向遺傳操作技術(shù)（Reverse Genetic Manipulaton）。）。病毒的感染性克隆病毒的感染性克隆 文獻綜述文獻綜述第10頁/共80頁 文獻綜述文獻綜述第11頁/共80頁第12頁/共80頁第13頁/共80頁 v 核糖核蛋白轉(zhuǎn)染法： 采用T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，NS-CAT-NS，體外轉(zhuǎn)錄 v RNA聚合酶方法： RNA聚合酶I（pol I）啟動子代替T7 RNA聚合酶

5、啟動子第14頁/共80頁1717質(zhì)粒系統(tǒng)質(zhì)粒系統(tǒng) 1212質(zhì)粒系統(tǒng)質(zhì)粒系統(tǒng) 第15頁/共80頁第16頁/共80頁第17頁/共80頁第18頁/共80頁第19頁/共80頁“6“62”2”流感疫流感疫苗苗第20頁/共80頁2 RNA干擾對干擾對A型流感病毒基因表達及病毒型流感病毒基因表達及病毒復(fù)制的抑制作用的研究復(fù)制的抑制作用的研究 第21頁/共80頁2.1 2.1 研究目的和意義研究目的和意義研究目的和意研究目的和意義義第22頁/共80頁v 禽流感病毒禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004 NP和和M2基因的克隆基因的克隆及及M2基因跨膜區(qū)的缺失基因跨膜區(qū)的缺失(M2 ).v

6、NP和和M2 基因同基因同eGFP共表達真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其在共表達真核質(zhì)粒的構(gòu)建及其在HeLa細胞中的表達細胞中的表達.v NP和和M2基因特異性基因特異性siRNA的設(shè)計及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)的設(shè)計及其真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建建v siRNA對對NP和和M2基因在基因在HeLa細胞中表達水平影響的研究細胞中表達水平影響的研究.v siRNA在體外（在體外（MDCK細胞上）對流感病毒細胞上）對流感病毒(H5N1, H9N2, H1N1)復(fù)制的影響復(fù)制的影響.v siRNA的體內(nèi)試驗和攻毒保護試驗的體內(nèi)試驗和攻毒保護試驗研究內(nèi)容研究內(nèi)容第23頁/共80頁第24頁/共80頁NPNP基因的基因的PCRPCR

7、擴增及同報告基因（擴增及同報告基因（EGFPEGFP）融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建 結(jié)果與分析結(jié)果與分析NP基因的基因的PCR擴增結(jié)果擴增結(jié)果質(zhì)粒質(zhì)粒pCDM-NP的酶切鑒定的酶切鑒定和和PCR鑒定鑒定第25頁/共80頁PCR方法缺失方法缺失M2基因跨膜區(qū)基因跨膜區(qū) 結(jié)果與分析結(jié)果與分析第26頁/共80頁M2M2基因的克隆、跨膜區(qū)的缺失及同報告基因（基因的克隆、跨膜區(qū)的缺失及同報告基因（EGFPEGFP）融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建 結(jié)果與分析結(jié)果與分析M2基因基因跨膜區(qū)缺失的跨膜區(qū)缺失的PCR擴增結(jié)果擴增結(jié)果質(zhì)粒質(zhì)粒pCDM-M2的酶切鑒定的酶切鑒定和和PCR鑒定鑒定第27頁

8、/共80頁結(jié)果與分析結(jié)果與分析NP基因同基因同EGFP在在HeLa細胞中的細胞中的融合表達融合表達M2基因同基因同EGFP在在HeLa細胞中的細胞中的融合表達融合表達質(zhì)粒質(zhì)粒pCDM-NP、pCDM-M2在轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染HeLa細胞后細胞后12小時就可以檢測到特異性小時就可以檢測到特異性熒光，轉(zhuǎn)染后熒光，轉(zhuǎn)染后24小時發(fā)出熒光的細胞明顯增多，熒光主要呈彌散性分布于整小時發(fā)出熒光的細胞明顯增多，熒光主要呈彌散性分布于整個細胞中，說明個細胞中，說明NP基因與基因與EGFP，M2基因與基因與EGFP均發(fā)生了融合表達。均發(fā)生了融合表達。 NP、M2基因同報告基因（基因同報告基因（EGFP）在）在HeLa細

9、胞中的細胞中的融合表達融合表達第28頁/共80頁BamHI+HindIII結(jié)果與分析結(jié)果與分析第29頁/共80頁siRNA表達質(zhì)粒表達質(zhì)粒bamHI + HindIII的雙酶切鑒定的雙酶切鑒定M: DNA marker (DL-15000)1: pSCMV- M48 2: pSCMV-M7543: pSCMV-M949 4: pSCMV-NP749 5: pSCMV-NP1383結(jié)果與分析結(jié)果與分析第30頁/共80頁結(jié)果與分析結(jié)果與分析siRNA表達質(zhì)粒與表達質(zhì)粒與pCDM-NP共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染 siRNA表達質(zhì)粒與表達質(zhì)粒與pCDM-M2共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染 siRNAsiRNA表達質(zhì)粒與表達質(zhì)粒與pC

10、DM-NPpCDM-NP或或pCDM-pCDM-M2M2共轉(zhuǎn)染共轉(zhuǎn)染細胞孔編號 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 1 pCDM-NP（3 g） pSilencer 4.1-negative（3 g） 2 pCDM-NP（3 g） pSCMV-NP749（3 g） 3 pCDM-NP（3 g） pSCMV-NP1383（3 g） 4 細胞對照 細胞孔編號 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒 1 pCDM-M2（3 g） pSilencer 4.1-negative（3 g） 2 pCDM-M2（3 g） pSCMV- M48（3 g） 3 pCDM-M2（3 g） pSCMV-M754（3 g） 4 pCDM-M2（3 g） pSCMV-M94

11、9（3 g） 5 細胞對照 第31頁/共80頁結(jié)果與分析結(jié)果與分析第32頁/共80頁siRNAsiRNA表達質(zhì)粒同表達質(zhì)粒同pCDM-NPpCDM-NP共轉(zhuǎn)染后共轉(zhuǎn)染后2424h h的流式細胞檢測的流式細胞檢測 結(jié)果與分析結(jié)果與分析第33頁/共80頁結(jié)果與分析結(jié)果與分析siRNAsiRNA表達質(zhì)粒同表達質(zhì)粒同pCDM-pCDM-M2M2共轉(zhuǎn)染后共轉(zhuǎn)染后2424h h的流式細胞檢測的流式細胞檢測第34頁/共80頁半定量半定量RT-PCR檢測檢測NP、EGFP mRNA的水平的水平 結(jié)果與分析結(jié)果與分析A: pNP-EGFP + pS-NegativeB: pNP-EGFP + pS-NP749C

12、: pNP-EGFP + pS-NP1383D: Cell Control第35頁/共80頁結(jié)果與分析結(jié)果與分析A: pM2 -EGFP + pS-Negative B: pM2 -EGFP + pS-M48C: pM2 -EGFP + pS-M754 D: pM2 -EGFP + pS-M949E: Cell Control半定量半定量RT-PCR檢測檢測M2、EGFP mRNA的水平的水平第36頁/共80頁半定量半定量RT-PCR檢測看家基因檢測看家基因GAPDH mRNA的水平的水平 結(jié)果與分析結(jié)果與分析A：pCDM-NP pSilencerB：pCDM-NP pSCMV-NP749C：

13、pCDM-NP pSCMV-NP1383D：pCDM-M2 pSilencerE：pCDM-M2 pSCMV- M48F：pCDM-M2 pSCMV-M754G：pCDM-M2 pSCMV-M949H：Cell Control第37頁/共80頁Western blot Western blot 評價評價siRNAsiRNA對目的基因表達的抑制作用對目的基因表達的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析Western blot檢測檢測M2基因的表達水平基因的表達水平 A：pCDM-M2 pSilencer C：pCDM-M2 pSCMV-M754B：pCDM-M2 pSCMV-M949 D：pCDM-M2

14、 pSCMV- M48E：Cell Control Western blot檢測檢測NP基因的表達水平基因的表達水平A：pCDM-NP pSilencer C：pCDM-NP pSCMV-NP1383B：pCDM-NP pSCMV-NP749 D：Cell Control第38頁/共80頁Western blot Western blot 檢測檢測GAPDHGAPDH基因的表達基因的表達 結(jié)果與分析結(jié)果與分析A：pCDM-NP pSilencer E：pCDM-M2 pSCMV- M48B：pCDM-NP pSCMV-NP749 F：pCDM-M2 pSCMV-M754C：pCDM-NP pS

15、CMV-NP1383 G：pCDM-M2 pSCMV-M949D：pCDM-M2 pSilencer H：Cell Control第39頁/共80頁siRNA對對A型流感病毒在型流感病毒在MDCK細胞中復(fù)制的抑制作用細胞中復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 在在6 6孔板上培養(yǎng)孔板上培養(yǎng)MDCKMDCK細胞，待細胞長至細胞，待細胞長至80%80%滿時分別轉(zhuǎn)滿時分別轉(zhuǎn)染染siRNA表達質(zhì)粒，表達質(zhì)粒，同時設(shè)置同時設(shè)置p pSilencerSilencer對照和空白細胞對照和空白細胞對照。轉(zhuǎn)染后對照。轉(zhuǎn)染后1818-24-24h h分別接種流感病毒分別接種流感病毒H1N1H1N1（10106 6

16、 TCID TCID5050），），H5N1H5N1（10104 4 TCID TCID5050），），H9N2H9N2（10106 6 TCID TCID5050），接毒后），接毒后48-72h48-72h收獲細胞及上清進行病毒收獲細胞及上清進行病毒TCIDTCID5050的測定。的測定。第40頁/共80頁siRNAsiRNA對對A A型流感病毒在型流感病毒在MDCKMDCK細胞中復(fù)制的抑制作用細胞中復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析第41頁/共80頁siRNAsiRNA對對A A型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析攻攻毒毒組組別別

17、 注注射射的的質(zhì)質(zhì)粒粒 pSilencer 4.1-negative（100g） pSCMV- M48（100 g） pSCMV-NP1383（100 g） H5N1 pSCMV- M48（50 g）+ pSCMV-NP1383（50 g） pSilencer 4.1-negative（100g） H1N1 pSCMV- M48（50 g）+ pSCMV-NP1383（50 g） pSilencer 4.1-negative（100g） H9N2 pSCMV- M48（50 g）+ pSCMV-NP1383（50 g） 各攻毒組小鼠（各攻毒組小鼠（4 4只只/ /組）注射質(zhì)粒的種類和劑量組）注

18、射質(zhì)粒的種類和劑量 第42頁/共80頁siRNAsiRNA對對H5N1H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 siRNA 的瞬時表達特異性抑制的瞬時表達特異性抑制H5N1亞型禽流感亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制 第43頁/共80頁siRNAsiRNA對對H5N1H5N1亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用亞型禽流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 siRNA特異性抑制特異性抑制H5N1流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制流感病毒在體內(nèi)的復(fù)制 Treatment n Mean lung virus t

19、iter （lgTCID50） P value （t-test） Fold reduction si-Negtive 4 8.240.13 si-M48 4 7.030.09 0.001 16 si-NP1383 4 6.840.17 0.001 25 si-M48+ si-NP1383 4 6.540.28 0.001 50 第44頁/共80頁siRNAsiRNA對對H1N1H1N1和和H9N2H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析siRNA siRNA 的瞬時表達特異性抑的瞬時表達特異性抑制制H1N1H1N1亞型流感病毒在小鼠

20、亞型流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制肺臟中的復(fù)制siRNA 的瞬時表達特異性抑制的瞬時表達特異性抑制H9N2亞型禽流感病毒在小鼠亞型禽流感病毒在小鼠肺臟中的復(fù)制肺臟中的復(fù)制 第45頁/共80頁siRNA對對H1N1和和H9N2亞型流感病毒在小鼠肺中亞型流感病毒在小鼠肺中復(fù)制的抑制作用復(fù)制的抑制作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析 siRNA顯著性降低顯著性降低H1、H5和和H9 亞型流感病毒攻亞型流感病毒攻擊小鼠的肺病毒滴度擊小鼠的肺病毒滴度 Challenge virus Treatment Mean lung virus titer （lgTCID50） P value （t-test） Fold red

21、uction si-Negtive 6.530.28 H1N1 si-M48+ si-NP1383 4.960.15 0.00045 37 si-Negtive 8.240.13 H5N1 si-M48+ si-NP1383 6.540.28 0.00036 50 si-Negtive 6.490.41 H9N2 si-M48+ si-NP1383 4.880.14 0.00183 40 第46頁/共80頁siRNAsiRNA對對A A型流感病毒攻擊小鼠的保護作用型流感病毒攻擊小鼠的保護作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析攻毒保護組小鼠（攻毒保護組小鼠（8 8只只/ /組）注射質(zhì)粒的種類和劑量組）注射質(zhì)

22、粒的種類和劑量 攻攻毒毒組組別別 注注射射的的質(zhì)質(zhì)粒粒 pSilencer 4.1-negative（100g） H5N1 pSCMV- M48（50 g）+ pSCMV-NP1383（50 g） pSilencer 4.1-negative（100g） H1N1 pSCMV- M48（50 g）+ pSCMV-NP1383（50 g） 第47頁/共80頁 siRNAsiRNA對對H1N1H1N1亞型流感病毒攻擊小鼠的保護作用亞型流感病毒攻擊小鼠的保護作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析H1N1H1N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化化*, Groups differ fo

23、r weight loss, p0.05 (Students test) H1N1亞型流感病毒攻擊后亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率小鼠的存活率 第48頁/共80頁siRNAsiRNA對對H5N1H5N1亞型禽流感病毒攻擊小鼠的保護作用亞型禽流感病毒攻擊小鼠的保護作用 結(jié)果與分析結(jié)果與分析H5N1H5N1亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變亞型流感病毒攻擊后小鼠體重的變化化*, Groups differ for weight loss, p0.05 (Students test) H5N1亞型流感病毒攻擊后亞型流感病毒攻擊后小鼠的存活率小鼠的存活率 第49頁/共80頁討論討論第50頁/共80頁討論討

24、論第51頁/共80頁討論討論第52頁/共80頁討論討論第53頁/共80頁第54頁/共80頁第55頁/共80頁3 H5N1亞型禽流感病毒亞型禽流感病毒A/chicken/Hubei/327/2004全基因組克隆、測序及其感染性克隆的構(gòu)建全基因組克隆、測序及其感染性克隆的構(gòu)建 第56頁/共80頁 3.1 研究目的和意義研究目的和意義研究目的和意研究目的和意義義第57頁/共80頁研究目的和意研究目的和意義義第58頁/共80頁v H5N1亞型禽流感病毒亞型禽流感病毒A / c h i c k e n / H u b e i / 3 2 7 / 2 0 0 4全基因組克隆、測序及遺傳進化分析全基因組克隆

25、、測序及遺傳進化分析v 用于流感病毒拯救的八個轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的構(gòu)建用于流感病毒拯救的八個轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒的構(gòu)建v H5N1亞型禽流感病毒湖北分離株的體外拯救亞型禽流感病毒湖北分離株的體外拯救v 拯救病毒的鑒定拯救病毒的鑒定研究內(nèi)容研究內(nèi)容第59頁/共80頁第60頁/共80頁基因組八個片段的基因組八個片段的PCR擴增結(jié)果擴增結(jié)果第61頁/共80頁H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析第62頁/共80頁H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析第63頁/共80頁H5N1亞型禽流感病毒基因序列及遺傳進化分析亞型禽流感病毒基因序列及

26、遺傳進化分析第64頁/共80頁第65頁/共80頁BsmBI & BsaI第66頁/共80頁流感病毒的拯救流感病毒的拯救SPFSPF雞胚增殖雞胚增殖第67頁/共80頁拯救病毒在拯救病毒在SPFSPF雞胚中增殖雞胚中增殖不同代次的血凝價不同代次的血凝價 結(jié)果與分析結(jié)果與分析1,51,5：The NO.1 generation The NO.1 generation virus titersvirus titers2,62,6：The NO.2 generation The NO.2 generation virus titersvirus titers3,73,7：The NO.3 generation The NO.3 generation virus