第六章、放射免疫分析

1、l 體外分析技術是一組超微量體外分析技術體外分析技術是一組超微量體外分析技術的總稱，它是利用某種特異性結合劑與被測物的總稱，它是利用某種特異性結合劑與被測物和標記物進行結合反應，從而對極微量物質進和標記物進行結合反應，從而對極微量物質進行定量分析的分析技術。行定量分析的分析技術。l 1960年年Berson和和Yalow首次應用放射免疫首次應用放射免疫分析法（分析法（RIA）測定胰島素，開創(chuàng)了生物活性測定胰島素，開創(chuàng)了生物活性物質微量測定的新時代，是微量分析方法學上物質微量測定的新時代，是微量分析方法學上的一大突破。本章主要以的一大突破。本章主要以RIA為例介紹這類方為例介紹這類方法的基本原理

2、及方法特點。法的基本原理及方法特點。l一、基本原理：一、基本原理：放射免疫分析（放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）是體外放射分析技是體外放射分析技術中建立最早、應用最廣的一類技術，術中建立最早、應用最廣的一類技術，其基本原理為競爭性抑制。即：放射性其基本原理為競爭性抑制。即：放射性標記抗原和非標記抗原（包括標準抗原標記抗原和非標記抗原（包括標準抗原或待測抗原）共同與特異性抗體發(fā)生可或待測抗原）共同與特異性抗體發(fā)生可逆性結合，如圖逆性結合，如圖8-1。這種競爭可用以下。這種競爭可用以下反應式來表達：反應式來表達： l 式中式中Ag *代表標記抗原，代表標記抗原，Ag代表非

3、標代表非標記抗原，記抗原，Ab代表特異性抗體，代表特異性抗體，Ag * Ab代代表標記抗原抗體復合物，表標記抗原抗體復合物，AgAb代表非標代表非標記抗原抗體復合物。記抗原抗體復合物。 0 20 40 80 160 320 0 20 40 80 160 320 待待1 1 待待2 2抗原抗體的結合反應遵循質量作用定律，抗原抗體的結合反應遵循質量作用定律，即：即： 當反應達到平衡時，當反應達到平衡時，k1AgAb=k2AgAb。設設KA為平衡結為平衡結合常數，也稱親和常數，則有：合常數，也稱親和常數，則有： k1和和k2分別代表結合速度常數和解離速度常分別代表結合速度常數和解離速度常數，數，Ag

4、、Ab、AgAb分別代表游離抗原、游分別代表游離抗原、游離抗體和抗原抗體復合物的濃度。假設離抗體和抗原抗體復合物的濃度。假設Ab0和和Ag0分別代表抗原、抗體的初始濃度，分別代表抗原、抗體的初始濃度，B和和F分別代表分別代表反應平衡時結合和游離抗原的反應平衡時結合和游離抗原的%，（以分數表示，以分數表示，B+F=1），），可以推導出可以推導出B的函數式，的函數式， 由上式可看出是以由上式可看出是以B為函數的一元二次方程。為函數的一元二次方程。對每一特定的對每一特定的RIA系統(tǒng)，系統(tǒng)， Ab0和和KA是固定的，是固定的，*Ag0也是固定的，所以也是固定的，所以B在直角坐標上隨非標記在直角坐標上隨

5、非標記 Ag0呈雙曲線走向。呈雙曲線走向。二、基本試劑二、基本試劑 （一）、抗體（一）、抗體（antibody）(1)、抗體的制備：抗體是體外放射、抗體的制備：抗體是體外放射分析中應用最廣的結合劑，是用純化分析中應用最廣的結合劑，是用純化的免疫原免疫動物制備而得，免疫的的免疫原免疫動物制備而得，免疫的成敗在于免疫原和動物種類以及注射成敗在于免疫原和動物種類以及注射途徑、佐劑的使用、注射劑量和時間途徑、佐劑的使用、注射劑量和時間等。等。 分子量超過分子量超過5000的蛋白多肽物質的蛋白多肽物質具有較好的免疫原性，容易刺激高活具有較好的免疫原性，容易刺激高活度的抗體形成。分子量小于度的抗體形成。分

6、子量小于5000的肽的肽類物質免疫原性低，需要與載體蛋白類物質免疫原性低，需要與載體蛋白結合方能引起明顯的抗體形成。應該結合方能引起明顯的抗體形成。應該指出，動物對抗原的免疫反應個體差指出，動物對抗原的免疫反應個體差異很大，當一批動物用同樣的免疫原異很大，當一批動物用同樣的免疫原和免疫程序進行免疫時，往往只有部和免疫程序進行免疫時，往往只有部分動物產生滿意的反應。分動物產生滿意的反應。（2）抗血清（）抗血清（antiserum）的質量鑒定：的質量鑒定： 評價結合劑的主要指標有滴度、特異性和評價結合劑的主要指標有滴度、特異性和親和力。親和力。 1）滴度測定：）滴度測定： 測定方法是將抗血清稀測定

7、方法是將抗血清稀釋成不同濃度，分別加入一定量的標記釋成不同濃度，分別加入一定量的標記抗原，在適當的反應條件下達到平衡后，抗原，在適當的反應條件下達到平衡后，分離分離B與與F，計算不同稀釋度的抗血清與計算不同稀釋度的抗血清與標記抗原的結合百分率，以結合百分率標記抗原的結合百分率，以結合百分率為縱坐標，以抗血清稀釋度為橫坐標，為縱坐標，以抗血清稀釋度為橫坐標，繪制抗血清稀釋曲線（如圖）。繪制抗血清稀釋曲線（如圖）。 選擇結合率為選擇結合率為50%時所對應的稀釋度，時所對應的稀釋度，作為該結合劑的稀釋度，該稀釋度即為滴度。作為該結合劑的稀釋度，該稀釋度即為滴度?？贵w滴度越高表明抗體的質量越好?？贵w滴

8、度越高表明抗體的質量越好。 2）特異性測定：抗血清的特異性是）特異性測定：抗血清的特異性是指抗體與待測物以外的結構類似物指抗體與待測物以外的結構類似物結合的程度（又稱交叉反應率）。結合的程度（又稱交叉反應率）。 交叉反應百分率交叉反應百分率 =Y50/Z50100% 其中其中Y50為被測物結合率為被測物結合率50%時的濃度值；時的濃度值；Z50為結構類似物結為結構類似物結合率合率50%時的濃度值。干擾輕者特時的濃度值。干擾輕者特異性高。異性高。 3）親和力和親和常數測定：親和力表）親和力和親和常數測定：親和力表示特定的抗原、抗體之間的結合能力，示特定的抗原、抗體之間的結合能力，常用親和常數常用

9、親和常數KA來表示。來表示。KA越大，表越大，表示抗原、抗體之間結合能力越強，示抗原、抗體之間結合能力越強，B/F值大，方法的靈敏度高。值大，方法的靈敏度高。 隨著單克隆抗體（隨著單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）技術的發(fā)展，提高技術的發(fā)展，提高了現代體外分析技術的特異性和親和力。了現代體外分析技術的特異性和親和力。 （二）、放射性標記物（二）、放射性標記物 放射性標記物是體外放射分析的測放射性標記物是體外放射分析的測量依據，常用的標記核素有量依據，常用的標記核素有125I和和3H。 對標記物的質量要求包括：對標記物的質量要求包括： （1）比活度（）比活度（spec

10、ific activity）：）：體外體外放射分析法的定量范圍一般在放射分析法的定量范圍一般在10-9-10-12mol水平，標記物的用量應等于或小于水平，標記物的用量應等于或小于被測物的最小量，以得到較好的靈敏度。被測物的最小量，以得到較好的靈敏度。高比活度的標記物是確保分析方法靈敏高比活度的標記物是確保分析方法靈敏度的前提。度的前提。 （2）放化純度（）放化純度（radiochemical purity）：）：一般要求標記物的放化純度在一般要求標記物的放化純度在95%以上，以上，若放射性雜質過多，標準曲線的斜率降低，若放射性雜質過多，標準曲線的斜率降低，將會影響測定的靈敏度。將會影響測定的

11、靈敏度。（3）免疫活性（）免疫活性（immune activity）：）：標記標記物在標記和儲存等過程中會造成損傷，使物在標記和儲存等過程中會造成損傷，使標記抗原的免疫活性下降，與抗體發(fā)生反標記抗原的免疫活性下降，與抗體發(fā)生反應的能力減弱，甚至喪失，因此抗原活性應的能力減弱，甚至喪失，因此抗原活性的檢測十分重要。要求標記抗原與待測抗的檢測十分重要。要求標記抗原與待測抗原具有相同的免疫活性。原具有相同的免疫活性。（4）穩(wěn)定性（）穩(wěn)定性（stability）：）： 穩(wěn)定性是指標記抗原在合理儲存的條穩(wěn)定性是指標記抗原在合理儲存的條件下，保持其全部性能不變的程度。許多件下，保持其全部性能不變的程度。許

12、多因素可影響其性能的穩(wěn)定性，如標記方法、因素可影響其性能的穩(wěn)定性，如標記方法、標記位置、置換水平、理化環(huán)境等都可使標記位置、置換水平、理化環(huán)境等都可使放射性核素從標記抗原的分子上脫落下來，放射性核素從標記抗原的分子上脫落下來，或造成標記分子聚合或解離，使放化純度或造成標記分子聚合或解離，使放化純度明顯下降。當標記方法合理，保存條件完明顯下降。當標記方法合理，保存條件完善時，貨架期可達善時，貨架期可達1-3月。月。 （三）、標準品（三）、標準品（calibration standard） 標準品是樣品定量的基礎，它的質和量標準品是樣品定量的基礎，它的質和量的變化會直接影響樣品的測定值。的變化會直

13、接影響樣品的測定值。 對標準品對標準品的要求包括：的要求包括：（1）標準品與待測物質應屬同一物質；）標準品與待測物質應屬同一物質；（2）在與結合劑發(fā)生反應時，應與待測配體）在與結合劑發(fā)生反應時，應與待測配體有相等的活性和親和力；有相等的活性和親和力；（3）高度純化，不含影響分析的雜質；）高度純化，不含影響分析的雜質；（4）標準品的定量一定要準確。）標準品的定量一定要準確。四、分離技術四、分離技術 在放免分析中，當抗原、抗體反應達到平衡在放免分析中，當抗原、抗體反應達到平衡后，必須將后，必須將B與與F分離，分別測定其放射性。理想分離，分別測定其放射性。理想的分離技術應兼?zhèn)湟韵聨c：（的分離技術應

14、兼?zhèn)湟韵聨c：（1）將）將B與與F盡可能盡可能完全分離，并且不改變最初的平衡狀態(tài)；（完全分離，并且不改變最初的平衡狀態(tài)；（2）B與與F的分離不易受血漿或血清等外界因素的干擾；的分離不易受血漿或血清等外界因素的干擾；（3）分離試劑廉價易得，操作簡便、分離迅速、）分離試劑廉價易得，操作簡便、分離迅速、重復性好。幾種常用的分離技術介紹如下：重復性好。幾種常用的分離技術介紹如下：（一）沉淀法（一）沉淀法（precipitation method） 也稱也稱PEG法。溶解于水中的蛋白質，其分子周圍有水化層，法。溶解于水中的蛋白質，其分子周圍有水化層，以此保持蛋白質在水中的穩(wěn)定性，蛋白質分子吸以此保持蛋白

15、質在水中的穩(wěn)定性，蛋白質分子吸水能力的大小取決于蛋白質分子電荷的多少。水能力的大小取決于蛋白質分子電荷的多少。 在一般在一般RIA中，反應體系中，反應體系PH值多為中性附近，值多為中性附近，接近蛋白質的等電點，接近蛋白質的等電點，球蛋白所帶的電荷很少，形球蛋白所帶的電荷很少，形成水化層的能力較弱，當加入適當濃度的聚乙二醇成水化層的能力較弱，當加入適當濃度的聚乙二醇或堿金屬中性鹽如硫酸胺等奪取其周圍的水分子，或堿金屬中性鹽如硫酸胺等奪取其周圍的水分子，使它失去水化層，從而將抗體使它失去水化層，從而將抗體球蛋白（球蛋白（B）沉淀下沉淀下來，與游離部分的抗原分離。這種分離方法的優(yōu)點來，與游離部分的抗

16、原分離。這種分離方法的優(yōu)點是操作簡便，分離迅速，價格低廉，但是，這種方是操作簡便，分離迅速，價格低廉，但是，這種方法易受環(huán)境溫度（溫度高于法易受環(huán)境溫度（溫度高于30時沉淀物容易復時沉淀物容易復溶）溶） 、pH值、離子強度和蛋白質含量值、離子強度和蛋白質含量(最終濃度達最終濃度達250mg/ml以上以上 )及分子量及分子量(蛋白質分子量越大，用以蛋白質分子量越大，用以沉淀的沉淀的PEG濃度越小濃度越小)的影響，并且有些抗原也可能的影響，并且有些抗原也可能被同時沉淀下來，所以，非特異性結合高。被同時沉淀下來，所以，非特異性結合高。 （二）雙抗體法（二）雙抗體法（double antibody m

17、ethod） 在在RIA中，當抗原、抗體反應達到平衡中，當抗原、抗體反應達到平衡后，由于抗原抗體復合物的濃度很低，而后，由于抗原抗體復合物的濃度很低，而且處于可溶性狀態(tài)，不能直接通過離心的且處于可溶性狀態(tài)，不能直接通過離心的方法加以分離。于反應體系中加入第二抗方法加以分離。于反應體系中加入第二抗體，形成抗原體，形成抗原-第一抗體第一抗體-第二抗體復合物，第二抗體復合物，通過離心將通過離心將B與與F分離開來。雙抗體法為一分離開來。雙抗體法為一種特異性的分離方法，非特異性結合低，種特異性的分離方法，非特異性結合低，但主要缺點是分離時間長，第二抗體用量但主要缺點是分離時間長，第二抗體用量多等。多等。

18、AgAb1Ab2 Ag Ab1 Ab1 Ab2Ag Ab1 Ab2（三）雙抗體（三）雙抗體-PEG法法（double antibody-PEG method） 這種方法是目前被廣泛采用的一種方法，它兼這種方法是目前被廣泛采用的一種方法，它兼顧了雙抗體法和顧了雙抗體法和PEG法各自的優(yōu)點，克服了雙抗法法各自的優(yōu)點，克服了雙抗法分離時間長和沉淀法非特異性結合高的缺點，并且分離時間長和沉淀法非特異性結合高的缺點，并且使第二抗體和使第二抗體和PEG的用量大為減少，在常溫加入分的用量大為減少，在常溫加入分離劑后，無需溫育，直接離心，可獲得滿意的結果。離劑后，無需溫育，直接離心，可獲得滿意的結果。（四）吸

19、附分離法（四）吸附分離法（adsorptive separation method） 應用經過特殊處理的吸附劑，將游離的小分子應用經過特殊處理的吸附劑，將游離的小分子抗原或半抗原吸附，經過離心，隨著吸附劑的沉淀抗原或半抗原吸附，經過離心，隨著吸附劑的沉淀，將，將F沉淀下來，而抗原沉淀下來，而抗原-抗體復合物分子大，不被抗體復合物分子大，不被吸附，仍保留在溶液中，從而將吸附，仍保留在溶液中，從而將B與與F分離開。常用分離開。常用的吸附劑有葡聚糖包被的活性炭（的吸附劑有葡聚糖包被的活性炭（DCC），），離子交離子交換樹脂等。換樹脂等。 （五）固相分離法（五）固相分離法 這種分離法是將抗原或抗體通過

20、特殊技術聯(lián)這種分離法是將抗原或抗體通過特殊技術聯(lián)結在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，結在固相載體上，免疫反應在固相載體上完成，達到平衡后形成固相的抗原達到平衡后形成固相的抗原-抗體復合物，可與抗體復合物，可與游離部分分離。固相分離技術的方法較多，比如游離部分分離。固相分離技術的方法較多，比如，試管固相法：將抗體，試管固相法：將抗體IgG直接包被于試管底部直接包被于試管底部，使用時將非標記抗原和標記抗原加入試管，抗，使用時將非標記抗原和標記抗原加入試管，抗原與包被在管底的抗體結合達到平衡後，棄去上原與包被在管底的抗體結合達到平衡後，棄去上清（清（F），），洗滌后測定反應管（洗滌后測定反應管

21、（B）的放射性即的放射性即可。固相分離技術的主要優(yōu)點是操作簡便、迅速可。固相分離技術的主要優(yōu)點是操作簡便、迅速，分離效果好，非特異性結合低，是一種比較有，分離效果好，非特異性結合低，是一種比較有前途的分離方法。前途的分離方法。 （六）磁化分離技術（六）磁化分離技術（magnetizing separation technique） 磁化分離法是將磁化材料引入磁化分離法是將磁化材料引入RIA體系，體系，當反應達到平衡后，借助磁力將當反應達到平衡后，借助磁力將B與與F分離，分離，從而省去了離心的步驟。從而省去了離心的步驟。（七）微孔濾膜法（七）微孔濾膜法（millipore filter meth

22、od） 微孔濾膜法通常采用醋酸纖維素濾膜或玻微孔濾膜法通常采用醋酸纖維素濾膜或玻璃纖維素濾膜，在放免反應達到平衡后，將反璃纖維素濾膜，在放免反應達到平衡后，將反應液加入裝有微孔濾膜的濾器上，抗原抗體復應液加入裝有微孔濾膜的濾器上，抗原抗體復合物保留在濾膜上，游離部分被濾掉。合物保留在濾膜上，游離部分被濾掉。 五、數據處理（標準曲線擬合）五、數據處理（標準曲線擬合） RIA的數據處理是以標準品的檢測結果為依據的數據處理是以標準品的檢測結果為依據，擬合出標準曲線，再通過標準曲線求出待測樣品，擬合出標準曲線，再通過標準曲線求出待測樣品的濃度值，標準曲線是衡量樣品的客觀尺度。標準的濃度值，標準曲線是衡

23、量樣品的客觀尺度。標準曲線的擬合方式要慎重選擇，使它能夠真實的反應曲線的擬合方式要慎重選擇，使它能夠真實的反應測量的結果，減少人為因素的引入。目前常用的方測量的結果，減少人為因素的引入。目前常用的方式為數學模型法。式為數學模型法。1、Logit-Log模型模型 Logit-Log轉換是使雙曲線轉換是使雙曲線直線化的最常用方法。它是將標準品濃度轉換成直線化的最常用方法。它是將標準品濃度轉換成Log濃度，作為橫坐標，而把濃度，作為橫坐標，而把B轉換成轉換成LigitB，LigitB=LogBx/（B0-Bx）。）。其中其中B0是是0劑量結合率，劑量結合率，Bx是任何劑量為是任何劑量為X時的結合率（

24、如圖）：時的結合率（如圖）： 可以看出，這是一條隨劑量增加而下降的可以看出，這是一條隨劑量增加而下降的直線。這種方法的缺點是：由于劑量取對數，直線。這種方法的缺點是：由于劑量取對數，0劑量在擬合時不用，所以靈敏度有損失；如果劑量在擬合時不用，所以靈敏度有損失；如果反應系統(tǒng)不是理想模式，用本方法處理將有較反應系統(tǒng)不是理想模式，用本方法處理將有較大偏差。大偏差。2、四參數、四參數Logistic模型模型 四參數四參數Logistic模模型是國際原子能機構（型是國際原子能機構（IAEA）和世界衛(wèi)生組織和世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的數據處理模型，是對推薦的數據處理模型，是對Logit-Log模型的發(fā)展

25、。其通式為：模型的發(fā)展。其通式為： 其中其中X是抗原劑量，是抗原劑量，Y是結合是結合%，a、b、c、d為四個參數。對為四個參數。對RIA來說，來說，a可取實驗所得的最大可取實驗所得的最大結合率結合率B0，b可取同一批數據用可取同一批數據用Logit-Log法作線性法作線性回歸所得的斜率，回歸所得的斜率，c可取使可取使B0下降一半所需抗原濃下降一半所需抗原濃度度ED50，d可取實驗所得可取實驗所得NSB。四參數四參數Logistic模型模型的圖形如圖：的圖形如圖： 3、其他擬合模型、其他擬合模型 如四參數單位點作用模型的穩(wěn)定如四參數單位點作用模型的穩(wěn)定性較好，個別標準管出現壞點對擬合性較好，個別

26、標準管出現壞點對擬合結果的影響較小；還有二次多項式擬結果的影響較??；還有二次多項式擬合法、折線擬合法等。應當指出，不合法、折線擬合法等。應當指出，不論采用何種數學模型進行曲線擬合，論采用何種數學模型進行曲線擬合，實驗的結果應該是相同的或相近的，實驗的結果應該是相同的或相近的，都不能改善實驗過程低劣所帶來的影都不能改善實驗過程低劣所帶來的影響。響。 六、六、RIA的分析誤差和質量控制的分析誤差和質量控制 RIA是一類高靈敏度的超微量分析技術，是一類高靈敏度的超微量分析技術，易受各種因素的影響而使檢測結果失真。因易受各種因素的影響而使檢測結果失真。因此，質量控制體系應包括生產及使用兩個重此，質量控

27、制體系應包括生產及使用兩個重要環(huán)節(jié)。作為生產廠家，應建立嚴格的質量要環(huán)節(jié)。作為生產廠家，應建立嚴格的質量檢測程序，以保證進入市場的產品都符合質檢測程序，以保證進入市場的產品都符合質量要求，這是首要環(huán)節(jié)。作為用戶則應建立量要求，這是首要環(huán)節(jié)。作為用戶則應建立嚴格的質量控制體系，以保證檢測的質量。嚴格的質量控制體系，以保證檢測的質量。根據不同的目的，質量控制體系可分為實驗根據不同的目的，質量控制體系可分為實驗室內部質量控制和實驗室間質量評價。室內部質量控制和實驗室間質量評價。 （一）誤差的來源（一）誤差的來源 按誤差發(fā)生的統(tǒng)計學性質可將其分為：按誤差發(fā)生的統(tǒng)計學性質可將其分為：1、系統(tǒng)誤差（、系統(tǒng)

28、誤差（systematic error） 這種誤差這種誤差常表現為檢測結果呈傾向性的偏高或偏低，常表現為檢測結果呈傾向性的偏高或偏低，是一些可以確定的因素導致的。是一些可以確定的因素導致的。（1）方法誤差，如標準品稀釋體積不正確；）方法誤差，如標準品稀釋體積不正確；（2）儀器和試劑誤差，如儀器狀態(tài)不佳；量）儀器和試劑誤差，如儀器狀態(tài)不佳；量器不準；器不準；（3）操作誤差，如不正確的操作習慣等。）操作誤差，如不正確的操作習慣等。 系統(tǒng)誤差是可以通過努力消除的。系統(tǒng)誤差是可以通過努力消除的。 2、隨機誤差（、隨機誤差（random error） 這種誤差是這種誤差是由偶然因素所引起，誤差的出現是隨

29、機的，與真由偶然因素所引起，誤差的出現是隨機的，與真值的偏差是雙向的。常見的原因如加樣誤差，由值的偏差是雙向的。常見的原因如加樣誤差，由分離劑或離心機造成的錯分誤差等。分離劑或離心機造成的錯分誤差等。 （二）實驗室內部質量控制（二）實驗室內部質量控制（internal quality control） 實驗室內部質量控制側重對檢測質量的控制實驗室內部質量控制側重對檢測質量的控制，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報告為止的全過，它保證從收集樣本開始到發(fā)出報告為止的全過程中，能及時發(fā)現檢測過程中出現的各種誤差，程中，能及時發(fā)現檢測過程中出現的各種誤差，分析產生的原因，找出糾正的辦法，以確保檢測分析產生的

30、原因，找出糾正的辦法，以確保檢測的質量。常用的評價指標有精密度、準確度、特的質量。常用的評價指標有精密度、準確度、特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性。異性、靈敏度、穩(wěn)定性、有效性。1、精密度（、精密度（precision） 精密度是指在相同的精密度是指在相同的條件下，對某一樣品多次檢測所得結果的符合程度，條件下，對某一樣品多次檢測所得結果的符合程度，即重復性。即重復性。RIA系統(tǒng)的精密度是首先和隨時應考慮系統(tǒng)的精密度是首先和隨時應考慮的，是最重要的質量參數。評價方法如下：的，是最重要的質量參數。評價方法如下：（1）、標準誤差（）、標準誤差（SD）和變異系數和變異系數2、準確度（、準確度（accur

31、acy） 準確度是指測定值與真值的符合程度。考核準確度是指測定值與真值的符合程度。考核符合程度的實踐往往需要多份測定的結果進行計符合程度的實踐往往需要多份測定的結果進行計算。準確度、精密度之間的關系：算。準確度、精密度之間的關系：1準確度、精密度均好。準確度、精密度均好。2準確度較好，精準確度較好，精密度差。密度差。3準確度差，精密度好。準確度差，精密度好。4準確度、準確度、精密度均差。精密度均差。 實驗室內常用回收實驗，健全性試驗，實驗室內常用回收實驗，健全性試驗，“零零”水平測定等評價方法的準確度。水平測定等評價方法的準確度。附回收率（附回收率（recovery rate）的測定：的測定：

32、（1）回收率：）回收率：回收率是反應測定值偏差的質控回收率是反應測定值偏差的質控指標，測定方法是設回收管和對照管，對照管指標，測定方法是設回收管和對照管，對照管中加入待測樣品，回收管中加入待測樣品和已中加入待測樣品，回收管中加入待測樣品和已知量的分析物，經過測定全過程，比較已知量知量的分析物，經過測定全過程，比較已知量和測得量之間的一致程度，理論上回收率一般和測得量之間的一致程度，理論上回收率一般為為90%-110%之間，回收率的計算方法：之間，回收率的計算方法： （2）：）：回收率回收率:在實際工作中常常用更簡便的方法來計算回收率。在實際工作中常常用更簡便的方法來計算回收率?；厥章驶厥章?測

33、定值測定值/質控管真值質控管真值100%（3）質控樣品的應用：）質控樣品的應用： 1）質量控制樣品（）質量控制樣品（quality control sample）為了更為了更加準確的對樣本進行定量，我們使用質量控制樣品，加準確的對樣本進行定量，我們使用質量控制樣品，它是含有一種或幾種測定物（其量值是經過標定的它是含有一種或幾種測定物（其量值是經過標定的靶值），用來比較和評價測定系統(tǒng)的偏差和重復性靶值），用來比較和評價測定系統(tǒng)的偏差和重復性的實驗用血清。的實驗用血清。2）對質控樣品的要求：）對質控樣品的要求： A、質控樣品中的分析物應與待測樣品具有相同的質控樣品中的分析物應與待測樣品具有相同的生

34、物學活性和免疫原性，其他組成成分也盡量相同。生物學活性和免疫原性，其他組成成分也盡量相同。B、質控樣品中分析物的濃度應是準確定量的，質控樣品中分析物的濃度應是準確定量的，并且應有一個合理的濃度范圍，一般根據患者和并且應有一個合理的濃度范圍，一般根據患者和正常人血清中被測物的濃度，制定高、中、低三正常人血清中被測物的濃度，制定高、中、低三個劑量水平，高者應小于標準曲線的最大劑量點，個劑量水平，高者應小于標準曲線的最大劑量點，中者應為標準曲線的中間劑量點，低者應大于標中者應為標準曲線的中間劑量點，低者應大于標準曲線的最小劑量點，這樣能更好得發(fā)現整個檢準曲線的最小劑量點，這樣能更好得發(fā)現整個檢測范圍

35、內出現的變化，準確判斷誤差的性質和大測范圍內出現的變化，準確判斷誤差的性質和大小。小。C、在合理貯存的條件下，能長時間保存而不影在合理貯存的條件下，能長時間保存而不影響其性能，以便監(jiān)控測定系統(tǒng)的遠期重現性。響其性能，以便監(jiān)控測定系統(tǒng)的遠期重現性。D、質控樣品的管數約為總樣品管數的平方根，質控樣品的管數約為總樣品管數的平方根，使用時將其分置于待測樣本的不同位置。使用時將其分置于待測樣本的不同位置。 3、 靈敏度（靈敏度（sensitivity）靈敏度是指剛能靈敏度是指剛能與零標準管的測定結果在統(tǒng)計學上區(qū)別開與零標準管的測定結果在統(tǒng)計學上區(qū)別開來的最低濃度，即用該方法的最小可測值。來的最低濃度，即

36、用該方法的最小可測值。計算方法是累積多批（一般為計算方法是累積多批（一般為10次）測量次）測量結果，計算出零標準管的結合率為結果，計算出零標準管的結合率為x-2SD時時對應的劑量值，即為靈敏度。由此可見，對應的劑量值，即為靈敏度。由此可見，靈敏度和精密度有一定的關系，當精密度靈敏度和精密度有一定的關系，當精密度好時，零標準管的結合率較高，對應的濃好時，零標準管的結合率較高，對應的濃度值較小，最小可測值較小，即靈敏度較度值較小，最小可測值較小，即靈敏度較高。高。 4、穩(wěn)定性（、穩(wěn)定性（stability） 穩(wěn)定性是指測定試劑穩(wěn)定性是指測定試劑在合理保存和正確使用的條件下。在規(guī)定的有效在合理保存和

37、正確使用的條件下。在規(guī)定的有效期內，保持其全部性能不變。常用指標有：期內，保持其全部性能不變。常用指標有：（1）零標準結合率：）零標準結合率：是指在沒有未標記配體存在是指在沒有未標記配體存在下，由標記配體與結合劑之間產生的最大結合率，下，由標記配體與結合劑之間產生的最大結合率，理論上不應低于理論上不應低于33%，這個指標主要用來反應結，這個指標主要用來反應結合劑的質量，它在整個有效期內應保持穩(wěn)定。合劑的質量，它在整個有效期內應保持穩(wěn)定。（2）非特異性結合率：）非特異性結合率：它是指在沒有結合劑的存它是指在沒有結合劑的存在下，標記配體被分離試劑結合造成的結合率，在下，標記配體被分離試劑結合造成的

38、結合率，由于檢測過程中的種種原因，非特異性結合總會由于檢測過程中的種種原因，非特異性結合總會或多或少地存在，一般應控制在或多或少地存在，一般應控制在5%以下。以下。 5、特異性（、特異性（specificity）：）： 特異性是指該特異性是指該反應體系不受干擾物質影響的程度，反映的反應體系不受干擾物質影響的程度，反映的是對分析物測定的專一程度。交叉反應率越是對分析物測定的專一程度。交叉反應率越小，反應體系對分析物測定的專一性越好。小，反應體系對分析物測定的專一性越好。 6、有效性（、有效性（affectivity）：）： 有效性主要是有效性主要是指臨床診斷符合率及臨床使用評價。檢測結指臨床診斷

39、符合率及臨床使用評價。檢測結果能有效地實現實驗目的，應有可信的正常果能有效地實現實驗目的，應有可信的正常值及正常范圍，在正常和異常之間應有良好值及正常范圍，在正常和異常之間應有良好的分離，以便得出結論，如有些要作有或無、的分離，以便得出結論，如有些要作有或無、陽性或陰性的回答，有些要確定濃度的高低陽性或陰性的回答，有些要確定濃度的高低等。等。 應該指出，上面提到的各種質控指應該指出，上面提到的各種質控指標，對于全面評價檢測系統(tǒng)的質量及檢標，對于全面評價檢測系統(tǒng)的質量及檢測者的操作水平雖然是必要的，然而在測者的操作水平雖然是必要的，然而在實驗室常規(guī)檢測工作中，要完成如此眾實驗室常規(guī)檢測工作中，要

40、完成如此眾多的質控指標是不可能的，也是沒有必多的質控指標是不可能的，也是沒有必要的。通常可根據實際需要和實驗室條要的。通?？筛鶕嶋H需要和實驗室條件，選擇數項質控指標用于批內質量控件，選擇數項質控指標用于批內質量控制和批間質量控制。制和批間質量控制。（三）實驗室外部質量評價（三）實驗室外部質量評價（external quality control） 實驗室外部質量評價是對各實驗室之間的測定實驗室外部質量評價是對各實驗室之間的測定結果按統(tǒng)一的評價方案及方法比較分析，發(fā)現誤差結果按統(tǒng)一的評價方案及方法比較分析，發(fā)現誤差，找出原因，提出改進辦法，以提高各實驗室之間，找出原因，提出改進辦法，以提高各實

41、驗室之間所得結果的可信性和可比性。外部質量評價要在做所得結果的可信性和可比性。外部質量評價要在做好內部質量控制的基礎上才能進行。通常是根據工好內部質量控制的基礎上才能進行。通常是根據工作需要，由一個負責單位來領導，提出計劃及要求作需要，由一個負責單位來領導，提出計劃及要求，提供實施外部質量評價用的統(tǒng)一樣品，分發(fā)至各，提供實施外部質量評價用的統(tǒng)一樣品，分發(fā)至各參加單位進行檢測，然后將所得結果反饋給負責單參加單位進行檢測，然后將所得結果反饋給負責單位進行整理分析，對各有關單位的檢測質量進行評位進行整理分析，對各有關單位的檢測質量進行評價，促進檢測質量的提高和資料的可比性。價，促進檢測質量的提高和資

42、料的可比性。 免疫放射分析是利用過量放射標記抗免疫放射分析是利用過量放射標記抗體來測定樣品中的抗原或半抗原。所用的體來測定樣品中的抗原或半抗原。所用的標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的，標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的，所以反應系統(tǒng)是非競爭性的全量反應。為所以反應系統(tǒng)是非競爭性的全量反應。為了與放射免疫分析法相區(qū)別，它的創(chuàng)始人了與放射免疫分析法相區(qū)別，它的創(chuàng)始人Miles一開始就將其命名為免疫放射分析一開始就將其命名為免疫放射分析（immunoradiometric assay，IRMA）并并一直沿用到現在。一直沿用到現在。 一、基本原理一、基本原理 放射性核素標記在抗體上，然后以放射性

43、核素標記在抗體上，然后以過量標記抗體與抗原結合，多余的抗體過量標記抗體與抗原結合，多余的抗體通過一定手段除去，測定復合物的放射通過一定手段除去，測定復合物的放射性，其活度與待測抗原的量呈正相關。性，其活度與待測抗原的量呈正相關。由于不存在競爭反應，其靈敏度明顯高由于不存在競爭反應，其靈敏度明顯高于于RIA。如下式表式：如下式表式： IRMA中要分離的是游離抗體和復合物，中要分離的是游離抗體和復合物，都是大分子，一般分離方法難以奏效，目前都是大分子，一般分離方法難以奏效，目前主要靠單克隆抗體作分離劑。也就是每一主要靠單克隆抗體作分離劑。也就是每一IRMA系統(tǒng)至少要有兩個抗體，一個起分離作系統(tǒng)至少

44、要有兩個抗體，一個起分離作用，一個起測量作用。所以，一個用，一個起測量作用。所以，一個IRMA方法方法的建立，至少需要兩個抗原決定簇，對很多的建立，至少需要兩個抗原決定簇，對很多小分子半抗原不適用。小分子半抗原不適用。 （一）（一）IRMA同樣遵循質量作用定律同樣遵循質量作用定律 IRMA的函數式也是雙曲線，若以的函數式也是雙曲線，若以B為縱為縱坐標，它們是隨抗原量增加而上升的曲線。坐標，它們是隨抗原量增加而上升的曲線。（二）、（二）、 IRMA的測量范圍寬的測量范圍寬 抗體含量越大，則欲達到飽和時所抗體含量越大，則欲達到飽和時所需要的抗原更多，這說明測量范圍寬。需要的抗原更多，這說明測量范圍

45、寬。但標記抗體過高，游離抗體的量也增多，但標記抗體過高，游離抗體的量也增多，分離時將有明顯的分離誤差，使分離時將有明顯的分離誤差，使NSB升升高，低濃度抗原的測量精密度降低。所高，低濃度抗原的測量精密度降低。所以標記抗體的最佳濃度應通過實驗來選以標記抗體的最佳濃度應通過實驗來選擇。擇。（三）、（三）、IRMA和和RIA的主要區(qū)別：的主要區(qū)別：二、二、IRMA分類分類 （一）、雙抗體夾心法（一）、雙抗體夾心法（double antibody sandwich method） 此法采用固相抗體來代替經典的固相抗原的此法采用固相抗體來代替經典的固相抗原的IRMA法，固相抗體先與待測物（或標準品）結合

46、法，固相抗體先與待測物（或標準品）結合，再與標記的另一抗體反應，形成固相抗體，再與標記的另一抗體反應，形成固相抗體-抗原抗原-標標記抗體復合物，未結合抗體留在上清液中被棄去，記抗體復合物，未結合抗體留在上清液中被棄去，測固相放射性。如下式表示：測固相放射性。如下式表示：上式中的上式中的Ab1、*Ab2分別作為抗原上二個抗原決分別作為抗原上二個抗原決定簇的單抗，定簇的單抗，SP表示固相。表示固相。（二）、標記雙抗法（二）、標記雙抗法（labeled double antibody method） 標記抗體即為夾心法中那個標記抗體的抗標記抗體即為夾心法中那個標記抗體的抗體，亦即雙抗，這樣設計是為了

47、簡化標記每一特體，亦即雙抗，這樣設計是為了簡化標記每一特異性抗體，只要標記這個雙抗體，即可作為通用異性抗體，只要標記這個雙抗體，即可作為通用示蹤劑，例如用示蹤劑，例如用125I標記了兔抗鼠的標記了兔抗鼠的IgG，則所有則所有應用非固相的鼠抗體作為第二抗體的，均可用此應用非固相的鼠抗體作為第二抗體的，均可用此標記的抗抗體作為示蹤劑，如下式表示：標記的抗抗體作為示蹤劑，如下式表示： （三）、雙標記抗體法（三）、雙標記抗體法（double labeled antibody method） 有些結構復雜的抗原有有些結構復雜的抗原有3個或更多個個或更多個抗原決定簇，為此，可以用兩個標記抗體抗原決定簇，為

48、此，可以用兩個標記抗體進行進行IRMA分析，以提高復合物的放射性分析，以提高復合物的放射性比活度，從而提高方法靈敏度和精密度。比活度，從而提高方法靈敏度和精密度。最后形成的標記復合物見下圖：最后形成的標記復合物見下圖： 三、數據處理三、數據處理 采用計算機數學模型的方法進行處理，采用計算機數學模型的方法進行處理，常用的數學模型包括：三參數單位點質量常用的數學模型包括：三參數單位點質量定律數學模型、五參數定律數學模型、五參數Logistic模型、線模型、線性內插模型等。性內插模型等。四、免疫放射分析的特點四、免疫放射分析的特點 （一）示蹤劑（一）示蹤劑 IRMA法中的示蹤劑為標記抗體，是一種法中

49、的示蹤劑為標記抗體，是一種IgG蛋白分子，含有多個酪氨酸或組氨酸殘基蛋白分子，含有多個酪氨酸或組氨酸殘基，易被放射性碘化，目前示蹤劑的標記多用固，易被放射性碘化，目前示蹤劑的標記多用固相氧化劑碘化法，如相氧化劑碘化法，如Iodogen法等，很少影響其法等，很少影響其免疫活性，標記率可達免疫活性，標記率可達70%左右。左右。 （二）反應動力學（二）反應動力學 質量作用定律認為反應速度與反應物的濃質量作用定律認為反應速度與反應物的濃度呈正比，在度呈正比，在IRMA中標記抗體是過量的，且中標記抗體是過量的，且反應是非競爭性的，抗原抗體是全量反應，故反應是非競爭性的，抗原抗體是全量反應，故反應速度比反

50、應速度比RIA法快，一般反應法快，一般反應2-3小時即達平小時即達平衡，當天出結果。衡，當天出結果。（三）靈敏度（三）靈敏度 IRMA的靈敏度比的靈敏度比 RIA有明顯的提高，約有明顯的提高，約為為10-100倍，這在某些分析項目中具有重要意倍，這在某些分析項目中具有重要意義。如甲狀腺功能主要指標有三項，即義。如甲狀腺功能主要指標有三項，即FT3、FT4的放免測定和的放免測定和TSH的的IRMA測定，測定，IRMA測測定定TSH能可靠的區(qū)分正常人和甲亢病人血清能可靠的區(qū)分正常人和甲亢病人血清TSH含量的差別，只要含量的差別，只要TSH低于正常，低于正常，FT3或或FT4任一項高于正常即可診斷為

51、甲亢，在復雜任一項高于正常即可診斷為甲亢，在復雜情況下，情況下，TRH試驗時試驗時TSH高于正常，應否定甲高于正常，應否定甲亢?？?。 （四）標準曲線的工作范圍（四）標準曲線的工作范圍 當選擇的標記抗體質和量適當，當選擇的標記抗體質和量適當，IRMA的工作范圍寬。一般情況下，待測的工作范圍寬。一般情況下，待測物含量低者不必濃縮，高者不必稀釋，物含量低者不必濃縮，高者不必稀釋，給臨床檢測帶來方便，也避免了由于濃給臨床檢測帶來方便，也避免了由于濃縮和稀釋帶來的誤差。縮和稀釋帶來的誤差。（五）特異性（五）特異性IRMA應用的固相抗體和標記抗體是分別應用的固相抗體和標記抗體是分別針對抗原的兩個抗原決定簇

52、的單抗，不針對抗原的兩個抗原決定簇的單抗，不易發(fā)生交叉反應，因此特異性高。易發(fā)生交叉反應，因此特異性高。 （六）方法的穩(wěn)健性（六）方法的穩(wěn)健性在免疫反應中，有些抗原抗體間的親和常在免疫反應中，有些抗原抗體間的親和常數數KA有明顯的溫度依賴性，降低溫度有有明顯的溫度依賴性，降低溫度有利于利于KA值的提高，有利于增加靈敏度。值的提高，有利于增加靈敏度。根據質量作用定律，當抗體的濃度大于根據質量作用定律，當抗體的濃度大于1/KA，KA的影響就明顯減少。的影響就明顯減少。IRMA中中Ab0總是過量的，溫度對總是過量的，溫度對KA的影響較小，的影響較小，一般在一般在4-37的溫度改變對實驗結果無明的溫度

53、改變對實驗結果無明顯影響，所以顯影響，所以IRMA常采用常采用37溫育，反溫育，反應平衡時間明顯縮短。方法的穩(wěn)健性好。應平衡時間明顯縮短。方法的穩(wěn)健性好。 （七）（七）IRMA的主要缺點的主要缺點 IRMA對蛋白和多肽抗原的檢測是優(yōu)對蛋白和多肽抗原的檢測是優(yōu)越的。但它的典型的兩位點夾心法需要越的。但它的典型的兩位點夾心法需要二個抗原決定簇的抗原，這就大大地限二個抗原決定簇的抗原，這就大大地限制了對短肽及其它半抗原活性物的檢測制了對短肽及其它半抗原活性物的檢測。 在體外分析方法中，除了放射免疫分析和免在體外分析方法中，除了放射免疫分析和免疫放射分析外，還包括其它非放射性核素標記的疫放射分析外，還

54、包括其它非放射性核素標記的免疫分析。如酶標記免疫分析，化學發(fā)光免疫測免疫分析。如酶標記免疫分析，化學發(fā)光免疫測定，稀土元素標記的免疫分析法等。它們與前者定，稀土元素標記的免疫分析法等。它們與前者一樣，都是利用抗原與抗體的結合具有高度特異一樣，都是利用抗原與抗體的結合具有高度特異性這一重要特性，而不同之處只是利用的標記示性這一重要特性，而不同之處只是利用的標記示蹤物不同，因而其標記物的測定方法也不同。它蹤物不同，因而其標記物的測定方法也不同。它們除了與前者同樣具有高度特異性及敏感性外，們除了與前者同樣具有高度特異性及敏感性外，還克服了放射性核素可能造成的環(huán)境污染，保存還克服了放射性核素可能造成的

55、環(huán)境污染，保存期短等缺點，因此得到了廣泛的應用。期短等缺點，因此得到了廣泛的應用。 一、酶標記免疫分析法一、酶標記免疫分析法 酶標記免疫分析法（酶標記免疫分析法（enzyme immunoassay，EIA）是以酶代替放射性核素標記抗體或抗原作為是以酶代替放射性核素標記抗體或抗原作為主要試劑的免疫測定法。它是將抗原抗體結合的主要試劑的免疫測定法。它是將抗原抗體結合的高度特異性與酶促反應的高度敏感性有機的結合高度特異性與酶促反應的高度敏感性有機的結合起來，用酶標記抗體（抗原），檢測待測標本中起來，用酶標記抗體（抗原），檢測待測標本中的未知抗原（抗體），當相應的抗原抗體特異性的未知抗原（抗體），當

56、相應的抗原抗體特異性結合后，加入相應的酶的底物，酶可以高效專一結合后，加入相應的酶的底物，酶可以高效專一催化和分解底物，生成有顏色的產物。根據顏色催化和分解底物，生成有顏色的產物。根據顏色的有無和深淺，可以判斷待測標本中有無特異性的有無和深淺，可以判斷待測標本中有無特異性抗原（抗體）以及量的多少。本實驗是一種敏感抗原（抗體）以及量的多少。本實驗是一種敏感、特異、簡便，只需一般光譜分析儀器的微量測、特異、簡便，只需一般光譜分析儀器的微量測定技術。定技術。 二、化學發(fā)光免疫分析法二、化學發(fā)光免疫分析法 化學發(fā)光免疫分析法化學發(fā)光免疫分析法（chemiluminescences immunoassa

57、y，CLIA），），是以化學發(fā)光物質代替放射性核素作為示蹤劑，是以化學發(fā)光物質代替放射性核素作為示蹤劑，將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高度特將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高度特異的抗原抗體反應結合起來的一種超微量的分異的抗原抗體反應結合起來的一種超微量的分析法。其特點是：設備簡單，試劑穩(wěn)定，無放析法。其特點是：設備簡單，試劑穩(wěn)定，無放射性污染，自動化程度高。射性污染，自動化程度高。 三、稀土元素標記的免疫分析法三、稀土元素標記的免疫分析法 稀土元素即鑭系元素，其中有銪（稀土元素即鑭系元素，其中有銪（Eu）、）、鈦（鈦（Tb）、）、釤（釤（Sm）、）、和鏑（和鏑（Dy）四種元素能四種元素

58、能發(fā)射離子熒光，這些稀土元素的螯合物，可以與發(fā)射離子熒光，這些稀土元素的螯合物，可以與抗原抗體結合，所以又稱鑭系熒光免疫分析。此抗原抗體結合，所以又稱鑭系熒光免疫分析。此螯合劑上的稀土元素在紫外光的激發(fā)下，可產生螯合劑上的稀土元素在紫外光的激發(fā)下，可產生持續(xù)一定時間，一定光峰的熒光。而其它非特異持續(xù)一定時間，一定光峰的熒光。而其它非特異性熒光壽命很短，待其衰減后，測量鑭系元素的性熒光壽命很短，待其衰減后，測量鑭系元素的特異性熒光，可以完全排除背景熒光的干擾，此特異性熒光，可以完全排除背景熒光的干擾，此法又稱時間分辨熒光免疫分析（法又稱時間分辨熒光免疫分析（time-resolved fluoimmunoassay，TrFIA）。）。 本法操作方便，靈敏度高，特異性強，無本法操作方便，靈敏度高，特異性強，無放射性，標記物穩(wěn)定性好，制備簡單并可長期放射性，標記物穩(wěn)定性好，制備簡單并可長期保存，加之曲線劑量寬，自動化程度高（分析保存，加之曲線劑量寬，自動化程度高（分析系統(tǒng)類似放免法）等優(yōu)點，深受生物醫(yī)學工作系