分子生物學實驗技術(核酸的凝膠電泳)

1、 前前 言言一、一、 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳二、二、 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳三、三、 脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳 核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術之一，用于分離、鑒定和純化用于分離、鑒定和純化DNADNA或或RNARNA片段；片段； 優(yōu)點：優(yōu)點：（1 1）便于分離）便于分離; ;（2 2）便于檢測）便于檢測; ;（3 3）便于回收：）便于回收： 1 1）核酸分子之糖核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基團，呈磷酸骨架中的磷酸基團，呈負離子化負離子化狀狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強度的電場中，它們會向正態(tài)；核酸分子在一定的電場強度的電場中，它們

2、會向正電極方向遷移；電極方向遷移；2 2）由于在電泳中往往使用由于在電泳中往往使用無反應活性的穩(wěn)定的支持介質無反應活性的穩(wěn)定的支持介質，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質粘度等的函數(shù)；而摩擦系數(shù)是分子大小、介質粘度等的函數(shù)； 因此，可在同一凝膠中、一定電腸強度下、可在凝膠因此，可在同一凝膠中、一定電腸強度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構型有差異的上分離出不同分子量大小或相同分子量但構型有差異的核酸分子。核酸分子。Home 1 DNA 1 DNA分子的大小分子的大小 雙鏈雙鏈DNADNA分子

3、遷移的速率與其堿基分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比； 2 2 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 濃度越低，相同核酸分子遷移越快；濃度越低，相同核酸分子遷移越快； 3 DNA3 DNA的構象的構象 一般同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀一般同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀。切口環(huán)狀。 4 4 凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠 溴化乙錠（溴化乙錠（EBEB）插入雙鏈）插入雙鏈DNADNA造成其造成其負電荷減少、剛性和長度增加。負電荷減少、剛性和長度增加。 5 5 所用的電壓所用的電壓 低電壓時低電壓時DNADNA片段遷移率與所用片段遷移率與所用的電壓成正比

4、。的電壓成正比。 6 6 瓊脂糖種類瓊脂糖種類 常見的有兩種：標準瓊脂糖和低常見的有兩種：標準瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；熔點瓊脂糖； 瓊脂糖類型瓊脂糖類型凝結溫度凝結溫度/熔化溫度熔化溫度/ 標準瓊脂糖標準瓊脂糖35389095不同廠家不同廠家生產的不生產的不同商品其同商品其凝結溫度凝結溫度和熔化溫和熔化溫度有一定度有一定差異差異40428590 高強度瓊脂糖高強度瓊脂糖34438595 修飾的低熔點修飾的低熔點/ 凝點瓊脂糖凝點瓊脂糖253563653565 超低熔點超低熔點8154045 低黏性低熔點瓊低黏性低熔點瓊脂糖脂糖25307038853075濃濃 度度（%）標標 準準(kb)高強度高

5、強度(kb)低熔點低熔點(kb)低黏度低低黏度低溶點溶點(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1 7 7 電泳緩沖液電泳緩沖液 常用的有常用的有TAETAE、TPETPE及及TBETBE 都是常用電泳緩沖液。三者相比：都是常用電泳緩沖液。三者相比：1 1）TAETAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側將發(fā)生酸性化；膠的

6、陽極一側將發(fā)生酸性化；2 2）TBETBE和和TPETPE比比TAETAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3 3）雙鏈線狀雙鏈線狀DNADNA片段在片段在TAETAE中比在中比在TBETBE或或TPETPE中遷移快中遷移快10%10%；4 4）對于高分子質量的對于高分子質量的DNADNA，TAETAE的分辨率略高于的分辨率略高于TBETBE或或TPETPE，對于低分子質量的對于低分子質量的DNADNA，TAETAE要差些。超螺旋要差些。超螺旋DNADNA在在TAETAE中的電泳分辨率要好于中的電泳分辨率要好于TBETBE。 載樣緩沖液：載樣緩沖液：臨上樣到臨上樣

7、到凝膠加樣孔凝膠加樣孔之前與待之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：載樣緩沖液有三個作用：1 1）增加樣品密度保證）增加樣品密度保證DNADNA沉入加樣孔內；沉入加樣孔內；2 2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3 3）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速）其中的染料在電場中以可以預測的泳動速率向陽極遷移。率向陽極遷移。類型類型6 緩沖液緩沖液貯存溫度貯存溫度I0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍溴酚藍室溫室溫0.25%二甲苯氰二甲苯

8、氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚藍溴酚藍40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25%溴酚藍溴酚藍440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液 通過染色通過染色, 紫外燈下檢測。紫外燈下檢測。 主要有溴化乙錠（主要有溴化乙錠（ethidium bromide, EB）染色法和）染色法和SYBR Gold染色法。染色法。（1）EB被認為是一種被認為是一種強致癌物質強致癌物質（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸可用來檢測單鏈或雙鏈核酸 （3 3）EBEB使用時的配制、貯存及使用使用時的配制、貯存及使用 EBEB常用水配制成常用水配制成

9、10 mg/ml10 mg/ml的貯存液，的貯存液，于室溫保存在于室溫保存在棕色瓶棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為中，使用終濃度為0.5 g/ml0.5 g/ml 。（4）當要知道當要知道DNA片段準確大小時，片段準確大小時，凝膠應在無凝膠應在無EB情況下電泳，電泳情況下電泳，電泳結束后再用結束后再用EB染色。染色。 SYBR Gold SYBR Gold是一種新型極敏感染料的商是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與品名稱。其與DNADNA結合的親和力高，并結合的親和力高，并且結合后，能夠極大增強熒光信號。且結合后，能夠極大增強熒光信號。 可以用透射或入射紫外光對可以用透射

10、或入射紫外光對EBEB染色的凝膠成染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。像，圖像可以直接輸出到計算機觀察?，F(xiàn)一般采用試劑盒回收：現(xiàn)一般采用試劑盒回收： 存在的主要問題：存在的主要問題：1 1 不能有效的回收大片段不能有效的回收大片段DNA DNA 2 2 不能有效回收少量不能有效回收少量DNA DNA Home 在在TEMEDTEMED ( (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) 催化催化過硫酸銨過硫酸銨還原還原產生的自由基的存在下，產生的自由基的存在下，丙烯酰胺丙烯酰胺單體的乙烯單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈?；酆闲纬删郾０返木€狀長鏈。 在雙功能交聯(lián)劑如在雙功能交聯(lián)劑如N N，

11、N-N-亞甲雙丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺的的參與下的共聚合反應中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成參與下的共聚合反應中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網格結構。三維帶狀網格結構。 網格孔徑的平均直徑決定于丙烯酰胺和雙功網格孔徑的平均直徑決定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。能交聯(lián)劑的濃度。（一）（一） 聚丙烯酰胺凝膠的本質聚丙烯酰胺凝膠的本質CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亞甲雙丙烯酰胺） 1 1 變性聚丙烯酰胺凝膠變性聚丙烯酰胺凝膠 用于單鏈用于單鏈DNADNA片段的分離或純化。片段的分離或純化。 變性的變性的DNADNA在這些凝膠

12、中的遷移率幾乎與其在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關。堿基組成及序列完全無關。 用途：放射性用途：放射性DNADNA探針的分離、探針的分離、DNADNA測序反應等。測序反應等。 2 非變性聚丙烯酰胺凝膠非變性聚丙烯酰胺凝膠 用于雙鏈用于雙鏈DNADNA片段的分離和純化。片段的分離和純化。 注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。 用途：制備高純度的用途：制備高純度的DNADNA片段。片段。丙烯酰胺濃度丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍有效分離范圍（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚藍溴酚藍3.5100020004601005.080500260658.0

13、604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/301/30; ; Home為何選為何選PFGE？ 超過一定大小的線狀雙鏈超過一定大小的線狀雙鏈DNADNA分子在分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（極限長度（40kb40kb）后）后DNADNA的遷移速率幾的遷移速率幾乎與分子大小無關，而主要決定于電場乎與分子大小無關，而主要決定于電場強度。但強度。但 PEGEPEGE 解決了這一問題。解決了這一問題。 （一）

14、（一） PFGE 工作的基本原理工作的基本原理 這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。替進行的。DNADNA分子在交替變換方向的電場中作分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。出反應所需的時間取決于它的大小。 該法可分離長至該法可分離長至5Mb5Mb的的DNADNA分子。嚴格說來，應分子。嚴格說來，應叫交替電場凝膠電泳。叫交替電場凝膠電泳。B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖脈沖電場電泳示意圖 垂直脈沖場電泳系統(tǒng)垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(vertical pulsed field) 場翻轉系統(tǒng)場翻轉系統(tǒng)(field inversion

15、) 旋轉膠系統(tǒng)旋轉膠系統(tǒng)(rotating gel) 箝位勻強電場系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)(contour-clamped homogeneous electric field)A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉系統(tǒng)場翻轉系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋轉膠系統(tǒng)旋轉膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+1 1 脈沖時間脈沖時間（0.1s-1000s)0.1s-1000s)：增加脈沖時間分離較增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。大分子，減少脈沖時間分離較小分子。2 2 電壓：電壓：若固定脈沖時間，增加電場強度就增大若固定脈沖時間，增加電場強度就增大了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度了可分離最大片段的范圍，但是太大的電場強度會導致較小片段泳動的紊亂。會導致較小片段泳動的紊亂。3