腫瘤部位光敏劑濃度檢測

1、腫瘤部位光敏劑濃度檢測新技術講座一一 課題背景及研究目的和意義課題背景及研究目的和意義二二 國內外研究狀況及分析國內外研究狀況及分析三三 研究思路及方法研究思路及方法四四實驗中發(fā)現的問題實驗中發(fā)現的問題 光動力學療法（PDT）具有組織選擇性好、對微血管組織的損傷作用強、全身副反應少等特點1,2。 PDT治療：將某種外源性光敏物質注射入生物組織中，在激勵光源照射下，光敏物質吸收光子能量后，由基態(tài)變成激發(fā)態(tài)，之后又退激發(fā)并返回基態(tài)的過程中生成大量活性氧物質 (ROS)，其中最主要的是單線態(tài)氧(1O2)，1O2是一種光毒性物質，能與多種生物大分子相互作用，損傷細胞結構或影響細胞功能，從而對病變組織產

2、生治療作用。 光動力學療法有望克服傳統(tǒng)診療方法的缺點和不足，為癌癥的治療提供了新的途徑和可能，由此可見，對其診療癌癥的研究是非常必要的3。 在臨床上有一定的治療效果，但治療劑量受到光敏劑濃度的影響，所以在治療前需要對光敏劑濃度給予定量檢測。課題背景4研究目的和意義 經過歸納分析提出：激光、氧和光敏劑是影響光動力學療法的生物學效應的三要素4,5，它們之間的量效關系相當復雜6，治療過程中靶組織內光敏劑的含量是影響光動力反應效果的重要因素7。 不同的患者藥代動力學同，所以在PDT治療前需要實際測量每一位患者腫瘤部位光敏劑含量8-11?？紤]到，非接觸式熒光光譜測量載體光敏劑濃度12區(qū)別傳統(tǒng)的接觸式的、

3、耗時長的、破壞性的測量方式13，對載體動物實驗以至于臨床診斷及治療有著非常重要的作用。載體測量光敏熒光光譜信號會受到測量的腫瘤的形狀、生物組織的吸收和散射等影響14,15，導致測得的熒光強度不能精確地反應光敏劑濃度。 目前在光動力臨床治療中，光敏劑熒光診斷還處于離體測量的階段，不能準確的獲得臨床載體光敏劑定量測量，無法確定每一患者在注入光敏劑后某些時間段的光敏劑濃度是否達到光動力治療標準，從而限制了光動力治療疾病的使用。熒光光譜方法測量腫瘤細胞光敏劑含量國外研究狀況u1996年以前，光敏劑熒光診斷光敏劑濃度的方法被廣泛的研究16-19，但所有載體輻射熒光檢測不僅受到光敏劑濃度的影響還受到測量腫

4、瘤部位的幾何形狀、生物組織對激勵波長與輻射波長吸收與散射的影響16-19。當獲得生物組織的吸收、散射等光學特性參量時，被改變的熒光光譜輪廓可能被修正，由熒光團所確定的光敏劑濃度的準確度可以達到15%20。實驗與蒙特卡洛仿真同時證明了通過減少測量樣品的直徑約100um或更少來降低生物組織的散射和吸收的影響，使得熒光強度與英光團濃度呈線性關系21，22。u1997年，R. A. Weersink研究小組提出了另一種方法23，即反射光譜的漫反射近似可以用于確定光敏劑的濃度，生物組織反射光可以通過帶有多個激勵源與探測分離的面探頭來測量，這里散射與吸收系數都可以通過漫反射來推算。在皮膚表面及新西蘭白鼠身

5、上，這種方法被用來研究光敏劑濃度。對于內臟器官的實際與測量的光敏劑濃度都一致，但在皮膚組織上實際值與測量值相比低了3倍，并且光纖頭太大以至于不適用于內窺鏡通道的適用。圖1 后向散射光測量方法光纖結構示意圖，其中一根為激勵光纖其他為探測光纖圖2 在442nm激勵下探測的熒光強度與后向散射強度的比值隨光敏劑吸收吸收的變化情況u 1997年，Judith R. Mourant研究小組發(fā)現采用分離式激勵與接收方式（間距約為1.7mm）反射光譜與吸收系數之間的線性關系，通過測量生物組織的彈性散射譜來計算組織內相關復合物的濃度23。在1999年該方法被用于組織內光敏劑藥物濃度的檢測24。u 2000年，該

6、研究小組采用分光手段提出一個無創(chuàng)的實時光敏劑治療藥物濃度檢測方法，如圖1所示。該方法通過穩(wěn)態(tài)的熒光光譜儀對熒光的后向散射進行測量，發(fā)現熒光強度與激勵光后向散射光強度的比值與光敏劑吸收系數存在線性關系，如圖2所示。u2000年，Brian W. Pogue26研究小組采用了一個實驗方案如圖3所示，證明了微小采樣方法（選用間隔700um多路直徑為100um的光纖）可以增加探測返回熒光信號的強度，減小生物組織對光敏劑熒光的影響。圖3 左圖為光纖測試系統(tǒng)示意圖，右圖為微小采樣的多路光纖束浸入生物組織的示意圖，注本圖沒有顯示出所有的光纖個數，實驗中采用37路光纖束。圖4 在注入AIS2Pc光敏劑后測得的

7、熒光強度隨化學萃取法測量的浸入濃度變化情況，左圖為動物內臟右圖為肌肉組織在同一個人的測量結果，兩圖給出的斜率相似表明生物住在的類型對本探測響應幾乎無關。該研究小組進行了小鼠肝臟與肌肉組織下注射光敏劑的活體實驗，驗證了不同組織的光敏熒光信號強度隨光敏劑（ALS2Pc）浸入濃度（通過對組織提取測量的結果）的響應斜率較為相近11%，如圖4所示。表明探測器響應幾乎不受到生物組織的影響，所以該實驗方法可以減少生物組織熒光噪聲對光敏劑熒光的影響。u2007年， Wilson BC研究小組探索了新的光動力計量方法，提出通過特定的單線態(tài)氧熒光探測與基于光敏劑漂白計量方式相結合的全光的計量方法27，如圖5所示。

8、圖 5 單線態(tài)氧光譜強度與光敏劑熒光探測系統(tǒng)的示意圖。熒光光譜方法測量腫瘤細胞光敏劑含量國內研究狀況1. 目前國內在光敏劑濃度方面的研究主要有解放軍總醫(yī)院顧英教授與北京理工大學于常青副教授進行研究，在2008年該研究小組對皮膚表面鮮紅斑痣光動力治療中皮膚光敏劑含量的光譜信息提取方面的研究28。該實驗方案主要有半導體激光器作為光源、單路激勵光纖與多路接收光纖探頭、光纖光譜儀以及手提電腦的實驗設備來完成如圖6所示。在440nm的激發(fā)下對皮膚組織的熒光光譜及注射光敏劑（PSD007）后的熒光光譜給予測量，并觀察了注射光敏劑幾分鐘后光譜的紅移譜峰，如圖7，8所示。圖圖 6 熒光光譜儀的各個組成部分熒光

9、光譜儀的各個組成部分圖 7 注射光敏劑后 PDT 治療中 PWS 皮膚和正常皮膚的熒光光譜對照圖 8 照光前后 PSD007 白蛋白緩沖溶液的熒光光譜圖圖8顯示出顯示出670nm 處又出現了一個熒光峰，這是光敏劑受光照射后產生光產物的特征峰處又出現了一個熒光峰，這是光敏劑受光照射后產生光產物的特征峰皮膚熒光主要來自于皮膚自體熒光、光敏劑熒光和光產物熒光皮膚熒光主要來自于皮膚自體熒光、光敏劑熒光和光產物熒光認為 PWS 皮膚實測光譜在排除血紅蛋白和黑色素的吸收后主要為三種基本熒光物質的熒光光譜的疊加：皮膚自體熒光（主要熒光物質來源是黃素腺嘌呤二核苷酸，簡稱FAD）、光敏劑熒光以及光產物熒光?；?/p>

10、光譜在腫瘤組織部位的疊加原理 需要從各自的水溶液中提取FAD、光敏劑、光產物的特征光譜，并通過實際測量取得人體皮膚血紅蛋白和黑色素的吸收譜。 由于PSD007 熒光特征峰、光產物熒光特征峰以及血紅蛋白吸收峰較為對稱且接近高斯形態(tài)，因而對其采用高斯擬合；而FAD的熒光峰以及黑色素吸收譜都不對稱，采取多項式擬合方式。由于熒光光譜采集數據間隔很小，數據量很大，數據分布均勻，且互不相關，方程組求解采用一般的最小二乘回歸即可兩個患者的臨床測量結果與擬合結果的對比圖兩個患者的臨床測量結果與擬合結果的對比圖圖9 臨床實測光譜與擬合光譜對比結果2. 在2008年，哈爾濱工業(yè)大學張治國教授課題組建立了用于牙結石

11、的熒光比例方法29，并取得較高的靈敏度。離體的腫瘤細胞的光敏劑熒光與自體熒光密度譜線一定波長范圍積分的比值與光敏劑濃度存在線性關系，熒光比例的公式為：OP=(SB-SC)/SAOP = SB/SA， =SC/SA上式中 定義為自體熒光系數，對于同一物質 為一常數，通過計算得出不加光敏劑的Eca-109 細胞所對應的 為 0.145。該公式的圖像表示形式如圖10所示，其值與光敏劑濃度獲得的線性關系如圖11所示。圖 10 光敏劑濃度參量的原理圖SA是以 490 nm 的熒光峰為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的 1/e 處的熒光曲線下的面積，表征了細胞自體熒光的強度。SB是以 630 nm 的熒光峰

12、為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的 1/e 處的熒光曲線下的面積。SC是不加光敏劑的 Eca-109 細胞在以 630 nm 的熒光峰為中心，兩端為熒光強度衰減到初始的1/e 處的熒光曲線下的面積，(SBSC)表征了HMME 光敏劑的熒光強度。圖11 不同濃度 HMME 溶液 OP 值擬合曲線三、研究思路及方法三、研究思路及方法1.理想定標：確定純光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑特征峰值熒光光譜相對強度線性關系。2.離體定標：a，確定浸入腫瘤細胞內光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑特征峰值熒光光譜相對強度線性關系；b，確定浸入腫瘤細胞內光敏劑不同濃度與激發(fā)光敏劑熒光和自體熒光特征峰比值的線性關系。3.載體測

13、量載體測量：對小鼠體表腫瘤在注入一定劑量光敏劑后，每間隔一定時間進行激發(fā)腫瘤獲得其熒光光譜相對強度，并根據其強度值及已知的線性關系，推算此時腫瘤細胞內的光敏劑濃度值。4. 閾值濃度：可進行有意義的光動力治療時最小的光敏劑濃度值。實驗方案設計載體測量實驗載體測量實驗光敏劑濃度，腫瘤與非腫瘤熒光相對強度比值，閾值光敏劑濃度光敏劑濃度，腫瘤與非腫瘤熒光相對強度比值，閾值光敏劑濃度對比分析理想定標實驗理想定標實驗離體定標實驗離體定標實驗線性關系理論模型一 （這里給出理想檢測時吸收激勵光與激發(fā)熒光之間的關系，未考慮腫瘤細胞對激勵光的散射、吸收、收集效率及腫瘤形狀等因素）（1）（2） LIkemexex0

14、,303. 2LemexemFLAAemexemFexexeIIeIIII1,1,00cLIIexexexemexemF303. 2,0cLIIexemexemF303. 2,0線性關系物理模型二：單一波長激勵下光敏劑熒光相對與自體熒光的相對強度與光敏劑濃度線性關系。ex在 波長激發(fā)下的公式關系（4）（5）（6-1）xexxexgemexemexck1, （6-2） xgexxexgemexxemexgemFemFxexxemexxexemFgexgemexgexemFccIILcIILcII ,303. 2,303. 200考慮實際測量光譜值并非理論真實值，則定義如下關系式：()()()()

15、()()cFemBemFemcFemBemFemIIIIII(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,ccFemexBemexFemexFemexRccFemexBemexFemexFemexccBemexFemexFemexRccFemexFemexIIIINIIIIIIINII )(,)BemexI（7）則（7）式可改寫為：（8）上式中，N/R被認為待測熒光組織及返回激發(fā)光產生的背景噪聲。物理模型三物理模型三：雙波長激勵下可消去噪聲對線性關系的影響。同理另一個波長 激勵下ex(,)(,)(,)(,)cFemexFemexRcFemexFemIINII（9）

16、(8)式與(9)式相減：(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)(,)1(,)(,)ccFemexFemexFemexFemexccFemexFemexFemexFemexgexemgexgexemgexxexemxexxxexemIIIIIIIIc1gxexxcc（10）xexxexgemexxemexgexxexgemexxemexgck1, 令 gexemFexemFexemFexemFckIIII ,則有（11）當待測腫瘤細胞濃度確定時， 為常量。k 光譜分析實驗研究實驗方案： 采用熒光質量分析儀對正常細胞、PSD007孵化腫瘤細胞、正常細胞熒光光譜進行檢測。 正常細胞：

17、大鼠的脾臟白細胞；腫瘤細胞:LG12實驗內容： 確定細胞自體熒光、PSD007光敏劑熒光、ALA光敏劑熒光特征峰的位置，對激發(fā)光源波長進行指導。PSD007吸收光譜測量結果nm.200.00400.00600.00800.00吸收值5.0004.0002.0000.000-0.50012345678No. 波長(nm) 吸收值1619.500.2752568.000.5603540.000.6294505.500.8525405.003.4566360.004.0397352.004.0398338.003.914405nm激發(fā)下正常組織細胞熒光譜400nm激發(fā)下腫瘤+PSD007光敏劑熒光譜

18、635nm激勵下未發(fā)現熒光信號細胞實驗研究-理想定標離體細胞定標u實驗方案：激發(fā)光源：405nm連續(xù)激光器、熒光質量分析儀待測樣品：純不同濃度PSD007、孵化白血病腫瘤細胞光線探頭：平頭多纖芯NA=0.22醫(yī)用光纖光譜儀：USB400、tristan光纖光譜儀（300-1000nm）u 實驗內容：找到合適的光纖光譜儀積分時間。調節(jié)光纖探頭位置，找到距離待測樣品的合適位置。測量不同濃度下光敏劑熒光相對強度。激光激勵與熒光質量分析儀兩種方法下測量結果進行對比。熒光質量分析儀獲得不同濃度PSD007光敏劑測量結果5506006507007500500000100000015000002000000

19、250000030000003500000 IntensityWavelength(nm) non 0.019625ug/ml 0.038125ug/ml 0.07625ug/ml 0.15625ug/ml 0.3125ug/ml 0.625ug/ml 1.25ug/ml 2.5ug/ml 5ug/ml0.00.10.20.30.40.50.60.70100000200000300000400000500000600000 IntenstiyWavelength(nm)Equationy = a + bAdj. R-Squar1ValueStandard ErPolynomial Fit of

20、 BIntercept1733.337461.07953E-11Polynomial Fit of BSlope813347.324462.89101E-110123450100000020000003000000 IntensityWavelength(nm)Equationy = a + b*xAdj. R-Square0.992590.97107ValueStandard ErrorC1Intercept65870.3401539641.97061C1Slope674488.2486220598.61145BIntercept1733.3374622560.00022BSlope8133

21、47.3244669933.7598熒光特征峰614nm處相對強度與光敏劑濃度之間線性關系濃度范圍0.019ug/ml-5ug/ml濃度范圍0.019ug/ml-0.625ug/ml理想定標線性關系曲線熒光質量分析儀PSD007孵化白血病腫瘤細胞測量結果低濃度45050055060065070075005000100001500020000 Intensitywavelength(nm) 0.3906ug 0.7812ug 1.5625ug 3.125ug405nm光源激發(fā)下不同孵化濃度腫瘤細胞光敏劑熒光強度4505005506006507007500500010000150002000025

22、00030000 IntensityWavelength(nm) 0.39065ug 0.78125ug 1.5625ug 3.125ug405nm光源激發(fā)下腫瘤細胞裂解后光敏劑熒光強度560 580 600 620 640 660 680 700 720 740050000100000150000200000 IntensityWavelength(nm) 6.25ug 12.5ug 25ug 50ug 100ug560580600620640660680700720740050000100000150000200000250000300000350000400000450000500000

23、 IntensityWavelength(nm) 0ug 6.25ug 12.5ug 25ug 50ug 100ug裂解前激發(fā)腫瘤細胞獲得光敏劑熒光強度（高濃度孵化）裂解后激發(fā)純光敏劑熒光強度（高濃度孵化）PSD007孵化白血病腫瘤細胞測量結果高濃度孵化濃度為（6.25ug/ml-100ug/ml）PSD007，浸入細胞內濃度與光敏劑熒光特征峰（616nm）強度的線性關系孵化細胞后離體定標線性關系曲線熒光質量分析儀0.00.10.20.30.40.50.6020000400006000080000100000120000140000160000180000 IntensityConcentra

24、tion(ug/ml)Equationy = a + b*xAdj. R-Square0.9765ValueStandard ErrorBIntercept23812.97056191.75581BSlope243708.2685418846.8168光譜儀405nm激光器待測樣品光纖探頭高精度三維手動位移臺激光器連接頭光譜儀連接頭405nm激勵下PSD007的熒光光譜信號45050055060065070075080002500500075001000012500150001750020000 wavelength(nm)Intenstiy(a.u.) 100ug/ml 50ug/ml 25

25、ug/ml 12.5ug/ml 6.25ug/ml 3.125ug/ml 1.56ug/ml 0.78ug/ml 0.39ug/ml 0ug/ml低濃度光敏劑與激發(fā)熒光特征峰值(614.9nm)的線性關系0.00.51.01.52.02.53.03.50100020003000400050006000 Intensity(a.u.)concentration(ug/ml) B Linear Fit of BEquationy = a + b*xAdj. R-Square0.96433ValueStandard ErrorBIntercept358.82385212.08039BSlope137

26、6.24188131.73089405nm激發(fā)下的線性標定曲線LD光源405nm激光激發(fā)下白血病腫瘤細胞熒光信號460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 7400200400600800100012001400160018002000 IntenstiyWavelength(nm) 50ug/ml 25ug/ml 12.5ug/ml 6.25ug/mlNon460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 7400100200300400500 Intensity

27、Wavelength(nm)100ug/ml 50ug/ml 25ug/ml 12.5ug/ml 6.25ug/ml 3.125ug/ml裂解前細胞內光敏劑的熒光光譜信號裂解后的熒光光譜信號405nm激光激發(fā)裂解后提取PSD007熒光光譜500600700050010001500200025003000 IntenstiyWavelength(nm) Y:0.39ug/ml Y:0.79ug/ml Y:1.56ug/ml Y:3.125ug/ml注：裂解前注：裂解前405nm激光激發(fā)腫瘤細胞未發(fā)現熒光信號激光激發(fā)腫瘤細胞未發(fā)現熒光信號0.050.100.150.200.250.30250300

28、350400450500550600650 Intensityconcentration(ug/ml)Equationy = a + b*Adj. R-Square0.99302ValueStandard ErrorBIntercept158.1282915.10855BSlope1636.4506279.12096孵化濃度（ug/ml）100502512.56.25浸入濃度（ug/ml）熒光質量分析儀0.5902910.3605720.204140.1177780.07524激光激發(fā)0.430620.2693620.2195620.1389330.07609孵化濃度為（6.25ug/ml-50ug/ml）PSD007，浸入細胞內濃度與光敏劑熒光特征峰（613nm）強度的線性關系兩種實驗條件下同樣待測樣品獲得光敏劑孵化濃度推算結果如下表兩種實驗條件下同樣待測樣品獲得光敏劑孵化濃度推算結果如下表生物組及其腫瘤實驗研究u實驗方案：激發(fā)光源：405nm連續(xù)激光器、熒光質量分析儀待測樣品：PSD007浸入小鼠直腸及小鼠皮下植入腫瘤組織光線探頭：平頭多纖芯NA=0.22醫(yī)用光纖光譜儀：USB400、tristan光纖光譜儀（300-1000nm）u 實驗內容：小鼠分別采用涂抹與靜脈注射兩種方式給藥。405nm激光激發(fā)不同給藥時間的光敏劑熒