制藥用水微生物檢查方法的驗(yàn)證

1、微生物檢查方法驗(yàn)證微生物檢查方法驗(yàn)證 介紹內(nèi)容介紹內(nèi)容一、微生物的基礎(chǔ)知識(shí)一、微生物的基礎(chǔ)知識(shí)二、微生物檢查方法驗(yàn)證二、微生物檢查方法驗(yàn)證 微生物基礎(chǔ)知識(shí)微生物基礎(chǔ)知識(shí) 微生物（微生物（microorganism, microbe）是一些）是一些 肉眼看不見(jiàn)的微小生物的總稱。肉眼看不見(jiàn)的微小生物的總稱。 微生物（微生物（microorganism）包括細(xì)菌、支原）包括細(xì)菌、支原 體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌體、螺旋體、衣原體、立克次體、病毒及真菌 （霉菌、酵母菌和放線菌）等。（霉菌、酵母菌和放線菌）等。 微生物的特點(diǎn)微生物的特點(diǎn) 種類多種類多 分布廣分布廣 迄今為止，我們知道的微生

2、物約有迄今為止，我們知道的微生物約有10萬(wàn)種，目前萬(wàn)種，目前已知的種類只占地球上實(shí)際存在的微生物總數(shù)的已知的種類只占地球上實(shí)際存在的微生物總數(shù)的20%。 微生物的特點(diǎn)微生物的特點(diǎn) 各體小，面積大各體小，面積大 物體的表面積和體積之比稱為表面積物體的表面積和體積之比稱為表面積 大腸埃希菌的表面積是人的大腸埃希菌的表面積是人的30萬(wàn)倍。萬(wàn)倍。 微生物的特點(diǎn)微生物的特點(diǎn) 吸收多吸收多 轉(zhuǎn)化快轉(zhuǎn)化快 如大腸埃希菌在合適條件下，每小時(shí)可以消如大腸埃希菌在合適條件下，每小時(shí)可以消 耗相當(dāng)于自身重量耗相當(dāng)于自身重量2000倍的數(shù)量，而人體則倍的數(shù)量，而人體則 需要需要40年之久。年之久。 微生物的特點(diǎn)微生物

3、的特點(diǎn) 適應(yīng)強(qiáng)適應(yīng)強(qiáng) 易變異易變異 微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分微生物按其結(jié)構(gòu)、化學(xué)組成及生活習(xí)性等分為三大類：為三大類： 細(xì)菌（細(xì)菌（bacterium）屬于原核細(xì)胞型微生物，其）屬于原核細(xì)胞型微生物，其特點(diǎn)是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式特點(diǎn)是具有細(xì)胞壁、原始的核質(zhì)，以二分裂方式繁殖。繁殖。 細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌體積微小，是無(wú)色半透明的，用肉眼直接觀細(xì)菌體積微小，是無(wú)色半透明的，用肉眼直接觀 察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過(guò)顯微鏡放大數(shù)百察難以看到，其結(jié)構(gòu)和形狀須經(jīng)過(guò)顯微鏡放大數(shù)百 倍至上千倍才能觀察。倍至上千倍才能觀察。一般以微米（一般以微米（m）作為測(cè)量單位。）作為測(cè)

4、量單位。在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌在細(xì)菌學(xué)中，按其形態(tài)可分為球菌、桿菌、弧菌 和螺桿菌。和螺桿菌。經(jīng)革蘭染色法（經(jīng)革蘭染色法（Gram stain）可將細(xì)菌分成兩大）可將細(xì)菌分成兩大類：即革蘭陽(yáng)性菌（類：即革蘭陽(yáng)性菌（G+）和革蘭陰性菌（）和革蘭陰性菌（G-）。）。 真菌（真菌（fungus；eumycetes） 是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報(bào)道是具有真核和細(xì)胞壁的生物。種類很多，已報(bào)道的種超過(guò)的種超過(guò)10萬(wàn)個(gè)。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的萬(wàn)個(gè)。大多是由纖細(xì)管狀菌絲構(gòu)成的菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在菌絲體。許多菌絲在一起統(tǒng)稱菌絲體。菌絲體在基質(zhì)上生長(zhǎng)的形態(tài)

5、稱為菌落?；|(zhì)上生長(zhǎng)的形態(tài)稱為菌落。 真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼真菌的形態(tài)具有多樣性，大小不一，大的用肉眼可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至可以看到，小的用普通光學(xué)顯微鏡放大數(shù)倍乃至千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單千倍方可觀察到。其形態(tài)分單細(xì)胞、多細(xì)胞，單細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（細(xì)胞呈圓形或卵圓形，如酵母菌（yeast）。多）。多細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團(tuán)。細(xì)胞由菌絲和孢子組成，并交織成團(tuán)。 藥品污染常見(jiàn)的真菌藥品污染常見(jiàn)的真菌 毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬毛霉屬、根霉屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬 一、毛霉屬（一、毛霉屬（Mucor Mic

6、heli ex Fries）毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分毛霉屬在自然界分布很廣，常用于發(fā)酵工業(yè)。并引起水分高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。高的糧食及食品的霉?fàn)€變質(zhì)。根霉屬（根霉屬（RhizopusEhrenberg） 根霉屬?gòu)V泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅根霉屬?gòu)V泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在潮濕的糧食及食品上能迅速蔓延生長(zhǎng)，引起糧食及食品的腐爛。速蔓延生長(zhǎng)，引起糧食及食品的腐爛。 曲霉屬（曲霉屬（Aspergillus） 曲霉屬的菌絲無(wú)色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。曲霉屬的菌絲無(wú)色、淡色或表面凝聚有色物質(zhì)，為有隔的多細(xì)胞。本屬的常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌有本屬的常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌

7、有8個(gè)種，具有強(qiáng)烈的致癌性。個(gè)種，具有強(qiáng)烈的致癌性。 青霉屬青霉屬菌絲無(wú)色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無(wú)菌絲無(wú)色或有色，為有隔的多細(xì)胞。分生孢子梗從菌絲垂直生出，無(wú)足細(xì)胞，頂端不膨大，無(wú)頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級(jí)分足細(xì)胞，頂端不膨大，無(wú)頂囊，產(chǎn)生一輪至數(shù)輪分叉，在最后一級(jí)分枝的小梗上，長(zhǎng)出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬枝的小梗上，長(zhǎng)出成串的分生孢子，形似掃帚狀，稱為帚狀枝。本屬的常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌有的常見(jiàn)產(chǎn)毒霉菌有9個(gè)種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)個(gè)種，其中展青霉可產(chǎn)生展青霉素，是一種神經(jīng)毒素，并具有致畸、致突變和致癌性；毒素，并具有致畸、致突

8、變和致癌性； 霉菌菌落形態(tài) 霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài)霉菌在孟加拉紅培養(yǎng)基上的形態(tài) 酵母菌顯微鏡下形態(tài)酵母菌顯微鏡下形態(tài) 微生物檢查法微生物檢查法 微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、微生物限度檢查方法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、 輔料受微生物污染程度的方法。輔料受微生物污染程度的方法。 檢查項(xiàng)目包括檢查項(xiàng)目包括 細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。細(xì)菌數(shù)、霉菌數(shù)、酵母菌數(shù)及控制菌檢查。檢查方法檢查方法 多用平皿法、薄膜過(guò)濾法、涂抹法和多用平皿法、薄膜過(guò)濾法、涂抹法和 MPN 法。法。 檢查方法的驗(yàn)證檢查方法的驗(yàn)證 試驗(yàn)環(huán)境試驗(yàn)環(huán)境 無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度無(wú)菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈

9、度 10 000 級(jí)下的局部潔級(jí)下的局部潔 凈度凈度 100 級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。 檢驗(yàn)依據(jù)檢驗(yàn)依據(jù) 單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法的的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。 -2010版藥典版藥典 隔離系統(tǒng)的應(yīng)用隔離系統(tǒng)的應(yīng)用 應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的應(yīng)用隔離系統(tǒng)重要的目的是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染保證無(wú)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，實(shí)是保護(hù)產(chǎn)品免受外源性污染保證無(wú)菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，

10、實(shí)現(xiàn)一次檢出的要求?，F(xiàn)一次檢出的要求。是保護(hù)操作人員安全。是保護(hù)操作人員安全。 隔離系統(tǒng)隔離系統(tǒng)應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須應(yīng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無(wú)菌檢查的要求。符合無(wú)菌檢查的要求。 日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。日常檢驗(yàn)還需對(duì)試驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)控。 方法驗(yàn)證的必要性方法驗(yàn)證的必要性為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，真實(shí)性，選擇正確的檢驗(yàn)方法是至關(guān)重要的。因此試驗(yàn)前必須對(duì)選擇的方法進(jìn)行驗(yàn)法是至關(guān)重要的。因此試驗(yàn)前必須對(duì)選擇的方法進(jìn)行驗(yàn)證。證。 證明所采用的方法是適宜的，確認(rèn)所采用的方法適宜于證明所采用的方法是適宜的，

11、確認(rèn)所采用的方法適宜于被檢供試品的微生物污染的檢驗(yàn)。被檢供試品的微生物污染的檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素檢驗(yàn)結(jié)果的影響因素供試品的組分供試品的組分 抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化抑菌劑、增溶劑、乳化劑及抗氧化 劑，這劑，這 些組分在一定濃度下對(duì)微生些組分在一定濃度下對(duì)微生 物起一定的抑制作用也可對(duì)污染菌物起一定的抑制作用也可對(duì)污染菌 造成損傷。造成損傷。環(huán)境影響環(huán)境影響 不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài)不同類型的微生物及不同的存活狀態(tài) 對(duì)環(huán)境的抗性是不同的。對(duì)環(huán)境的抗性是不同的。檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)條件檢驗(yàn)條件 如培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗(yàn)人員的操作誤如培養(yǎng)基的質(zhì)量、檢驗(yàn)人員的操作誤 差等。差等。 試驗(yàn)

12、全方面驗(yàn)證試驗(yàn)全方面驗(yàn)證 如試驗(yàn)環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液的制備，滅菌方法等全部進(jìn)如試驗(yàn)環(huán)境，培養(yǎng)基，供試液的制備，滅菌方法等全部進(jìn) 行驗(yàn)證。行驗(yàn)證。 當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求時(shí)，就可認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下該供試當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)符合要求時(shí)，就可認(rèn)為在該試驗(yàn)條件下該供試 品對(duì)微生物無(wú)抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)，供試品檢品對(duì)微生物無(wú)抑菌作用或抑菌作用可忽略不計(jì)，供試品檢 驗(yàn)結(jié)果可真實(shí)的體現(xiàn)。驗(yàn)結(jié)果可真實(shí)的體現(xiàn)。驗(yàn)證方法驗(yàn)證方法菌液制備菌液制備 5050100cfu/ml100cfu/ml。驗(yàn)證方法驗(yàn)證方法 試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、釋劑對(duì)照組。試驗(yàn)組、菌液組、供試品對(duì)照組、釋劑對(duì)照組。結(jié)果判斷結(jié)果判斷 供試品組、

13、對(duì)照組、供試品組、對(duì)照組、稀釋劑對(duì)照組的稀釋劑對(duì)照組的菌回收率菌回收率 均不低均不低70% 70% 。驗(yàn)證方法驗(yàn)證方法 按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法按供試液的制備和細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)所規(guī)定的方法及下列要求進(jìn)行。及下列要求進(jìn)行。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)各試驗(yàn)菌的回收率應(yīng)逐一進(jìn)行驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各次獨(dú)立的平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各 試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。試驗(yàn)菌株試驗(yàn)菌株 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、 白色念珠菌、白色念珠菌、 黑曲霉、枯草桿菌。黑曲霉、枯草桿菌。菌液制備菌液制備 同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。同計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查。 （1）試驗(yàn)組）試驗(yàn)組 平皿法平皿法 取最低稀釋級(jí)供試液取最低稀釋級(jí)供試液1ml和和50100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基脂培養(yǎng)基(平行制備平行制備2個(gè)平皿個(gè)平皿)，按平皿法測(cè)定其，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。菌數(shù)。 薄膜過(guò)濾法薄膜過(guò)濾法 取最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖取最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入洗，在最后一次的沖洗液中加入50100c