DNA甲基化及其檢測(cè)65

1、武漢大學(xué)中南醫(yī)院基因診斷中心鄭 芳表觀遺傳學(xué)表觀遺傳學(xué)DNA甲基化甲基化DNA甲基化檢測(cè)方法甲基化檢測(cè)方法研究進(jìn)展研究進(jìn)展一、表觀遺傳學(xué)一、表觀遺傳學(xué)基因型相同基因型相同現(xiàn)象現(xiàn)象1 1：一個(gè)生物體的不同組織基因表達(dá)模式截然不同一個(gè)生物體的不同組織基因表達(dá)模式截然不同表達(dá)模式迥異表達(dá)模式迥異 現(xiàn)象現(xiàn)象3 3： 腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，腫瘤抑制基因被過量地甲基化而導(dǎo)致失去活性，而基因的而基因的DNADNA序列并不發(fā)生變化。序列并不發(fā)生變化?，F(xiàn)象現(xiàn)象4 4：橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳，葉徒相似，其實(shí)味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長(zhǎng)，其

2、味其實(shí)味不同。同一種水果，在不同產(chǎn)地生長(zhǎng)，其味道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。道，大小，外觀可能相差很遠(yuǎn)。Basket ball player？Singer？President？TV host？如果他們出生在不同如果他們出生在不同的地方的地方基因環(huán)境表型相同的基因型相同的基因型 不同的表型不同的表型 ? ? 什么是表觀遺傳學(xué)？什么是表觀遺傳學(xué)？ 表觀遺傳學(xué)：表觀遺傳學(xué)： 基因序列無變化基因序列無變化 基因功能發(fā)生變化基因功能發(fā)生變化 可遺傳并且是可逆的可遺傳并且是可逆的 表觀遺傳學(xué)機(jī)制：表觀遺傳學(xué)機(jī)制： DNADNA甲基化甲基化 組蛋白修飾組蛋白修飾 RNA RNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干

3、擾，microRNA, long non-coding microRNA, long non-coding RNARNA等等) ) 基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的基因型不變的情況下，影響表型并能遺傳的現(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳?，F(xiàn)象，稱為表觀遺傳或后生遺傳。表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組表觀遺傳學(xué)研究的是在基因組DNA序列不變的序列不變的情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳情況下，在表型上具有的穩(wěn)定的、可遺傳(或潛或潛在的可遺傳性在的可遺傳性)的變化。的變化。DNA sequence codingEpigenetic programming廣泛，多樣，廣泛，多樣，復(fù)雜復(fù)雜DNA甲基化甲基

4、化 染色質(zhì)重塑染色質(zhì)重塑 RNARNA調(diào)控（調(diào)控（RNARNA干擾，干擾， 非編碼非編碼RNA:microRNA, RNA:microRNA, long non-coding RNA long non-coding RNA等等) )表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳學(xué)目前的主要研究發(fā)現(xiàn) 二、二、 DNA甲基化甲基化DNA甲基化甲基化組蛋白翻譯后修飾組蛋白翻譯后修飾RNA機(jī)制機(jī)制1950年，年，Wyatt在在Nature上首次指出測(cè)序結(jié)果上首次指出測(cè)序結(jié)果表明表明DNA可能存在第可能存在第5堿基。堿基。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶： DNMT胞嘧啶： Cytosine5-甲基胞嘧啶： 5-Methylct

5、osineS-腺苷-甲硫氨酸： SAM S-腺苷- 高半胱氨酸：SAH 1）廣泛性廣泛性 2）可遺傳性可遺傳性 3）可逆性可逆性 4）組織特異性組織特異性CpG島島(CpG islands) 在結(jié)構(gòu)基因在結(jié)構(gòu)基因5端附近的調(diào)控區(qū)段，端附近的調(diào)控區(qū)段， CG二聯(lián)二聯(lián)核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于核苷常常以成簇串聯(lián)的形式排列，含量大于50%。 預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)軟件 http:/pbil.univ-lyon1.fr/software/cpgprod_query.html http:/www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/cpgplot/A: A: 未甲基化或低度甲未甲基化或低度甲

6、基化的啟動(dòng)子能夠允基化的啟動(dòng)子能夠允許轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。許轉(zhuǎn)錄正常進(jìn)行。B: B: 甲基化的甲基化的CpGsCpGs阻阻止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，止轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，因此阻止轉(zhuǎn)錄。因此阻止轉(zhuǎn)錄。C: MBP ( Me-CpG C: MBP ( Me-CpG binding protein ) binding protein ) 也也阻止轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)阻止轉(zhuǎn)錄因子和啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。子區(qū)的結(jié)合。其他，如改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，其他，如改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，DNA 修復(fù)修復(fù)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)癌基因代謝癌基因代謝 凋亡凋亡分化分化細(xì)胞周期細(xì)胞周期DNA甲基化甲基化DNADNA甲基化的功能甲基化的功能 三、三、DNA甲基

7、化檢測(cè)手段甲基化檢測(cè)手段 DNA甲基化檢測(cè)方法總覽 主要檢測(cè)途徑主要檢測(cè)途徑3-1 基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法3-2 不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法不基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法 3-1基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法質(zhì)譜分析質(zhì)譜分析水解核苷酸質(zhì)譜分析圖圖6 PMVK基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序結(jié)果基因擴(kuò)增產(chǎn)物反向測(cè)序結(jié)果圖圖7 TRIB3基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序結(jié)果基因擴(kuò)增產(chǎn)物正向測(cè)序結(jié)果應(yīng)用二：應(yīng)用二： 重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后PCR克隆測(cè)序(Bisulfite-sequence PCR，BSP) 注： A：癌組織；B：癌旁組織；：未甲基化；：甲基化43A43BM43AE43A4

8、3BE43B(369bp)43BBSP克隆測(cè)序結(jié)果BSP克隆測(cè)序甲基化率三維圖形應(yīng)用三：應(yīng)用三：甲基化特異性PCR (methylafion-specific PCR，MS-PCR)甲基化特異性甲基化特異性PCRPCR U M U M U M ladder100150200250MSP法檢測(cè)抑癌基因法檢測(cè)抑癌基因RASSF1A啟動(dòng)子區(qū)的甲基化啟動(dòng)子區(qū)的甲基化圖圖 MSP檢測(cè)組織切片檢測(cè)組織切片DNA甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化狀態(tài)電泳圖片甲基化特異性甲基化特異性PCR（MSP）結(jié)果，）結(jié)果，U為非甲基化，為非甲基化，M為甲基化。為甲基化。 MSP擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳圖注：注：M表示表示 甲基化，甲基化

9、，U表示未甲基化表示未甲基化 B1-B6B1-B6為高脂血癥組六例標(biāo)本，為高脂血癥組六例標(biāo)本，D1-D5D1-D5為正常對(duì)照組五例標(biāo)本；為正常對(duì)照組五例標(biāo)本； H H2 2O O為陰性對(duì)照；為陰性對(duì)照；m m為為50bpMarker50bpMarker。SREBP-1SREBP-1基因啟動(dòng)子區(qū)基因啟動(dòng)子區(qū)CpGCpG島甲基化狀態(tài)島甲基化狀態(tài)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便；敏感性高。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：引物設(shè)計(jì)要求高；只能作定性研究；存在重亞硫酸鹽處理不完全導(dǎo)致的假陽性；只能了解部分位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。應(yīng)用四：結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysi

10、s，COBRA)結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法甲基化甲基化特異性特異性的限制性內(nèi)切酶：的限制性內(nèi)切酶：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶甲基化甲基化敏感性敏感性的限制性內(nèi)切酶：的限制性內(nèi)切酶：可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶可以識(shí)別甲基化的胞嘧啶圖圖 1-1 MSRE-PCR1-1 MSRE-PCR原理圖原理圖注：左圖DNA無甲基化, DNA被切斷, 無法得到PCR產(chǎn)物; 右圖DNA有甲基化, DNA保持完整,可以獲得PCR產(chǎn)物.采用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶技術(shù)結(jié)合PCR的方法（MSRE-PCR）篩選在肝癌與癌旁組織中有甲基化差異的基因。圖1-3：DNM基因瓊脂糖

11、凝膠電泳圖M21AE 17B 17BE17A17AE21A空21B21BE100bp250bp150bp400bp500bp注：M：Marker；E：加酶體系；A：癌組織；B：癌旁組織；空：水空白優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：方法相對(duì)簡(jiǎn)單；可進(jìn)行甲基化水平的定量研究；需要樣本量少。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：只能獲得特殊酶切位點(diǎn)甲基化情況。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 可同時(shí)檢測(cè)基因組內(nèi)多個(gè)CpG位點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果易解釋，成本低廉。缺點(diǎn)缺點(diǎn)：由于CG僅限于內(nèi)切酶識(shí)別序列中，因此非識(shí)別序列的CG將被忽略；只有檢測(cè)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵性位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)時(shí)，該檢測(cè)方法的結(jié)果才有意；需要樣本量大；存在酶消化不完全引起的假陽性的問題；不適用于混合樣本。 應(yīng)用五：甲基

12、化敏感性單鏈構(gòu)象分析（methylation specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA）甲基化敏感性單鏈構(gòu)象分析優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：能夠方便的應(yīng)用于任何序列的甲基化狀態(tài)分析；能夠?qū)谆牡任换蜻M(jìn)行半定量； 可以提示甲基化狀態(tài)分布的不均勻性。缺點(diǎn)缺點(diǎn)： 只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區(qū)分開，而較低水平的則不易分開，有時(shí)會(huì)因甲基化的CpG位點(diǎn)隨機(jī)和不均勻分布導(dǎo)致電泳條帶出現(xiàn)擁擠、拖尾的現(xiàn)象，故敏感性及準(zhǔn)確性略低； 檢測(cè)片段不宜過長(zhǎng)。應(yīng)用六：應(yīng)用六：化分析化分析方法方法啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)啟動(dòng)子區(qū)甲基化芯片技術(shù)HRMHRM技術(shù)： 用于篩

13、選大量樣本，獲得感興趣的CpGCpG位點(diǎn) 鑒定感興趣的CpG CpG 島 。HRM技術(shù)原理技術(shù)原理 HRMHRM技術(shù)原理技術(shù)原理 HRM特點(diǎn) 高靈敏性：可檢測(cè)低達(dá)0.1%0.1%甲基化程度。 高通量：1 1次可同時(shí)檢測(cè)不超過384384樣本，適用于大樣本多位點(diǎn)甲基化掃描。 高重復(fù)性：重復(fù)性100%100%。 使用范圍廣：不受堿基位點(diǎn)局限。 操作簡(jiǎn)便：只需設(shè)計(jì)特異引物，無須序列特異性探針，無需測(cè)序。 標(biāo)本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術(shù)標(biāo)本，也可用于微量的穿刺或活檢標(biāo)本、血液標(biāo)本、糞便標(biāo)本等非手術(shù)標(biāo)本的檢測(cè)。 應(yīng)用十：焦磷酸測(cè)序法 是由4種酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和三

14、磷酸腺苷雙磷酸酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng) 每一輪測(cè)序反應(yīng)體系中只加入一種dNTP。如果該dNTP與模板配對(duì)，則會(huì)在DNA聚合酶的作用下，添加到測(cè)序引物的3末端，同時(shí)釋放出一個(gè)分子的焦磷酸(PPi)。摻入的dNTP和釋放的PPi是等量的ATP硫酸化酶催化PPi與5-磷酰硫酸（APS）結(jié)合形成ATP，然后在熒光素酶的催化作用下，生成的ATP和熒光素結(jié)合形成氧化熒光素，同時(shí)產(chǎn)生可見光。CCD感應(yīng)器檢測(cè)到光信號(hào)后，Pyrogram轉(zhuǎn)化為檢測(cè)峰，每個(gè)峰的高度（光信號(hào)）與摻入的核苷酸數(shù)目呈正比Apyrase不斷降解未摻入的核苷酸和ATP，淬滅光信號(hào)，再生反應(yīng)體系焦磷酸測(cè)序法（Pyroseq

15、uencing）焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序 焦磷酸測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：焦磷酸測(cè)序的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高，可測(cè)到鄰近CpG區(qū)域的單個(gè)甲基化水平，甚至包括測(cè)序的引物區(qū)域。除常規(guī)的檢測(cè)位點(diǎn)變化情況外，還可準(zhǔn)確計(jì)算頻率變化。 對(duì)于檢測(cè)位點(diǎn)要求低，可檢測(cè)未知序列信息，覆蓋到人類基因組的所有CpG位點(diǎn)；對(duì)于樣品要求低，適用于新鮮、冷凍和FFPE樣本。焦磷酸測(cè)序法的局限性利用該方法測(cè)定在人類基因組中大量存在且DNA甲基化高發(fā)的重復(fù)元件Alu和LINE-1(long-interpread nucleotide element)的甲基化率，以它們的甲基化水平代表人類基因組DNA甲基化的總

16、體水平。但是該方法的得到的不是嚴(yán)格意義上的全基因組DNA甲基化率，并不能精確的反映全基因組DNA甲基化水平的實(shí)際情況。 總結(jié)：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法總結(jié)：基于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的方法MSP, methylation-specific PCR; Ms-SnuPE, methylation-sensitive single nucleotide primer extension；Ms-SSCP, methylation-sensitive single-stranded conformational polymorphism; MS-REs, methylation-sensitive restri

17、ction endonucleasessample throughput versus genome coverage. sample throughput versus genome coverage. A plot of sample throughput against genome coverage for various DNA methylation techniques. Throughput is determined by the number of samples that can be analysed per experiment, based on large euk

18、aryotic genomes. Coverage is determined by the number of CpGs in the genome that can be analysed per experiment. Daniel Zilberman et al. Development 134, 3959-3965 (2007)不同甲基化檢測(cè)方法的檢測(cè)通量 3-2 3-2 整體甲基化水平的檢測(cè)方法整體甲基化水平的檢測(cè)方法 全基因組整體甲基化水平的分析全基因組整體甲基化水平的分析先將DNA樣品經(jīng)過鹽酸或氫氟酸裂解為單個(gè)堿基（A, T, 5C, G, 5mC), 水解產(chǎn)物通過色譜柱或毛細(xì)

19、管，將結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，紫外光測(cè)定吸收峰值，計(jì)算5mC/(5mC+5C)的積分面積得出基因組整體的甲基化水平。相比HPLC, HPCE方法更加簡(jiǎn)便，快速，經(jīng)濟(jì)。兩種方法測(cè)定基因組DNA甲基化水平的敏感性均較高。Resolution of nucleosides obtained from enzymatic hydrolysis of genomic DNA from human cancer cell line HT29 by HPCE.mC, 5-methylcytidine; A, adenosine;C, cytidine;G, guanosine; T, thymidine.總體甲基化總體甲基化=100%=100%5mC/(5mC+5C5mC/(5mC+5C）生物質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)生物質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)DNADNA總體總體甲基化水平甲基化水平應(yīng)用二：生物質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用二：生物質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜分析法是通過對(duì)被測(cè)樣品離子的質(zhì)荷比質(zhì)荷比的測(cè)定來進(jìn)行分析的一種分析方法。被分析的樣品首先要離子化，然后利用不同離子在電場(chǎng)或磁場(chǎng)的運(yùn)動(dòng)行為的不同，把離子按質(zhì)荷比（m/z）分開而得到質(zhì)量