常用標(biāo)記技術(shù)上課用學(xué)習(xí)課程

1、標(biāo)記技術(shù)的種類按標(biāo)記物分酶學(xué)標(biāo)記熒光標(biāo)記同位素標(biāo)記基因標(biāo)記BrdU標(biāo)記熒光染料標(biāo)記免疫磁珠MTT比色法第1頁/共45頁第一頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。標(biāo)記技術(shù)的種類按標(biāo)記方法分免疫標(biāo)記技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)第2頁/共45頁第二頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。一、免疫標(biāo)記技術(shù)一、免疫標(biāo)記技術(shù) 定義：定義：是將抗原與抗體用可以微量檢測的標(biāo)是將抗原與抗體用可以微量檢測的標(biāo)記物（如記物（如熒光素?zé)晒馑?、酶酶、放射性同位素放射性同位素等）進(jìn)行等）進(jìn)行標(biāo)記，在與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，標(biāo)記，在與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，是目前應(yīng)用最廣泛的測定復(fù)合物中的標(biāo)記物，是目前應(yīng)

2、用最廣泛的免疫學(xué)檢測技術(shù)。免疫學(xué)檢測技術(shù)。 通過標(biāo)記物的放大作用，提高了免疫技術(shù)的通過標(biāo)記物的放大作用，提高了免疫技術(shù)的敏感性。敏感性。第3頁/共45頁第三頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。一、免疫標(biāo)記技術(shù)一、免疫標(biāo)記技術(shù)第4頁/共45頁第四頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)常用的免疫標(biāo)記物質(zhì)類別 標(biāo)記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學(xué)發(fā)光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒

3、膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 第5頁/共45頁第五頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。（1）酶免疫技術(shù)v酶免疫分析法（EIA）是指用酶標(biāo)記的抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。它將抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對底物高效催化作用結(jié)合起來，通過酶作用于底物后顯色，以顏色變化判斷試驗結(jié)果，可經(jīng)酶標(biāo)測定儀酶標(biāo)測定儀作定量分析，敏感度可達(dá)ng/ml甚至pg/ml水平。v常用方法：酶聯(lián)免疫吸附試驗、酶免疫組合法v常用于標(biāo)記的酶有辣根過氧化物酶（HRP）、堿性磷酸酶（AP）等。第6頁/共45頁第六頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。第7頁/共45頁第七頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。第8頁/共45頁第八頁，編

4、輯于星期日：十四點 五十六分。第9頁/共45頁第九頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。第10頁/共45頁第十頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：是指將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使抗原抗體反應(yīng)在固相載體表面進(jìn)行，通過洗滌將固相上的抗原抗體復(fù)合物與液相中的游離成分分開。 分類：雙抗體夾心法、間接法、BAS-ELISA。第11頁/共45頁第十一頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)記一抗檢測液相中的可溶性抗原檢測液相中的可溶性抗原將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗將已知

5、抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記二抗檢測液相中未知抗體檢測液相中未知抗體將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)記抗原或抗體記抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體檢測液相中的可溶性抗原或抗體第12頁/共45頁第十二頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。ELISAELISA( (雙抗體夾心法雙抗體夾心法) )檢測檢測HBsAgHBsAg原理示意原理示意測 抗 原第13頁/共45頁第十三頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。ELISA-間接法測未知抗體第14頁/共45頁第十四頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。競爭法競爭法抗原、抗體抗原、抗體測定管對照管第15頁/共45頁第

6、十五頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 BAS-ELISA:以生物素-親和素-過氧化物酶復(fù)合物作為指示劑，組成一種新的生物放大系統(tǒng)，進(jìn)一步提高檢測的敏感度。 一個親和素分子可以結(jié)合四個生物素分子，結(jié)合非常穩(wěn)定。親和素和生物素可以與酶、抗體、熒光素等分子結(jié)合，而不影響后者的生物活性。一個抗體分子可偶聯(lián)90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親和素。因此大大提高檢測的敏感度。第16頁/共45頁第十六頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀第17頁/共45頁第十七頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀第18頁/共45頁第十八頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。（2）免疫熒光技術(shù)

7、免疫熒光技術(shù)是免疫標(biāo)記技術(shù)中發(fā)展最早的一種，是用化學(xué)方法使熒光素標(biāo)記的抗體（或抗原）與組織或細(xì)胞中的相應(yīng)抗原（或抗體）結(jié)合，進(jìn)行定性定位檢查抗原或抗體的方法。 常用的熒光色素： 異硫氰酸熒光素（FITC）黃綠色熒光 藻紅蛋白（PE）紅色熒光第19頁/共45頁第十九頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。1.1.直接熒光法直接熒光法 優(yōu)點：優(yōu)點：簡單、特異簡單、特異 缺點：缺點：檢查每種抗檢查每種抗原均需制備相應(yīng)的原均需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體，特異性熒光抗體，敏感性低于間接法。敏感性低于間接法。（2）免疫熒光技術(shù)將抗原抗體反應(yīng)的特異性和敏感性與顯微示蹤的精確性相結(jié)合。第20頁/共45頁第二十頁，編

8、輯于星期日：十四點 五十六分。 2.2.間接法間接法 優(yōu)點：優(yōu)點：敏感性高、只需制備一種熒光素標(biāo)記抗體，就可用于檢測同種動物的多種敏感性高、只需制備一種熒光素標(biāo)記抗體，就可用于檢測同種動物的多種抗原。抗原。第21頁/共45頁第二十一頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 3.3.放射免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)(radiommunoassay,RIA)(radiommunoassay,RIA)是指將同位素分析的高靈敏度與抗原抗是指將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測定方法。體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標(biāo)記免疫測定方法。第22頁/共4

9、5頁第二十二頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。假設(shè)受檢標(biāo)本中不含抗原時的反應(yīng)條件為：假設(shè)受檢標(biāo)本中不含抗原時的反應(yīng)條件為： 4 4（AgAg* *）2 2（AbAb）2 2（AgAg* *AbAb）2 2（AgAg* *）在標(biāo)本中存在抗原時，舉例如下：在標(biāo)本中存在抗原時，舉例如下：4 4（AgAg* *）4 4（AgAg）（）（2Ab2Ab）1 1（AgAg* *AbAb）3 3（AgAg* *）1 1（AgAbAgAb）3 3（AgAg）第23頁/共45頁第二十三頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 膠體金顆粒的基礎(chǔ)金核并非是理想的圓球核，較小的膠體金顆?；臼菆A球形的，較大的膠體金顆粒（

10、一般指大于30nm以上的）多呈橢圓形。在電子顯微鏡下可觀察膠體金的顆粒形態(tài)。v金免疫測定技術(shù)是指對體液中抗原、抗體含量定量測定的技術(shù)，包括斑點金免疫滲濾試驗和免疫層析試驗。4.金免疫技術(shù)第24頁/共45頁第二十四頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。斑點金免疫滲濾試驗：是指將抗原或抗體點加在固相載體硝酸纖維素薄膜上，制成抗原或抗體包被的微孔濾膜并貼置于吸水材料上，依次在膜上滴加標(biāo)本、免疫金及洗滌液等試劑并與硝纖膜上的相應(yīng)抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)，過量試劑很快滲入吸水材料中?？乖贵w反應(yīng)后，形成大分子膠體金復(fù)合物，從而使陽性結(jié)果在膜上呈現(xiàn)紅色斑點。金免疫層析試驗：第25頁/共45頁第二十五頁，編輯于星期

11、日：十四點 五十六分。技術(shù)要點第26頁/共45頁第二十六頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。第27頁/共45頁第二十七頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。斑點金免疫滲濾試驗：金免疫層析試驗：是指用膠體金標(biāo)記技術(shù)和蛋白質(zhì)層析技術(shù)結(jié)合的以微孔濾膜為載體的快速固相膜免疫分析技術(shù)。將各種反應(yīng)試劑分點固定在試紙條上，檢測標(biāo)本加在試紙條的一端，通過毛細(xì)血管作用，使樣品溶液在層析材料上泳動，樣本中的待測物與層析材料中的反應(yīng)試劑發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，形成的復(fù)合物被富集或固定在層析條上的特定區(qū)域（檢測線），通過標(biāo)記免疫技術(shù)顯色。第28頁/共45頁第二十八頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。1.雙抗體夾心法免疫層析

12、試驗雙抗體夾心法測大分子抗原 第29頁/共45頁第二十九頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。2.競爭法 免疫層析試驗競爭法測小分子抗原原理圖 第30頁/共45頁第三十頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。3間接法 為了消除待測血清標(biāo)本中大量的非特異性IgG與特異性IgG競爭結(jié)合金標(biāo)記抗人IgG，降低了試驗敏感性，膠體金間接免疫層析法測抗體常設(shè)計成反流免疫層析法(圖22-4)。第31頁/共45頁第三十一頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。第32頁/共45頁第三十二頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 測定時先將緩沖液加在D處層析至C處使金標(biāo)物復(fù)溶，然后將標(biāo)本加在E處使其與染料一起在膜的層析作用下向

13、F端移動，若標(biāo)本中有待測抗體存在，則與膜上抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，待有色染料延伸至膜上標(biāo)記線G處時，在F處加緩沖液，合上測試卡，A處的強大吸水作用使膜上液體反向流動，標(biāo)本中非特異性IgG及無關(guān)物向E處反向?qū)游?，隨后而來的金標(biāo)羊抗人抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，出現(xiàn)棕紅色線條。無棕紅色線條出現(xiàn)則表明血清中無特異性抗體。第33頁/共45頁第三十三頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。（5）化學(xué)發(fā)光技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫測定（CLIA）：是用化學(xué)發(fā)光劑直接標(biāo)記抗原或抗體（化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物），與待測標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原、磁顆粒性的抗原或抗體反應(yīng)，通過磁場把結(jié)合狀態(tài)（沉淀部分）和游離狀態(tài)的化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物分離

14、開來，然后加入發(fā)光促進(jìn)劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，通過對發(fā)光強度的檢測進(jìn)行定量或定性檢測。 常用的發(fā)光劑是：吖啶酯類發(fā)光劑。第34頁/共45頁第三十四頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。 基本原理：基本原理：利用已知的核苷酸序列利用已知的核苷酸序列DNADNA片段作為探片段作為探針，按照堿基配對的互補原則去識別組織切片或細(xì)針，按照堿基配對的互補原則去識別組織切片或細(xì)胞涂片中的待測胞涂片中的待測DNADNA或或RNARNA，并與之特異結(jié)合，即，并與之特異結(jié)合，即DNADNA經(jīng)變性處理（如熱、酸、堿），堿基間的氫經(jīng)變性處理（如熱、酸、堿），堿基間的氫鍵發(fā)生斷裂，使雙鏈鍵發(fā)生斷裂，使雙鏈DNADNA解離成單鏈。

15、當(dāng)終止變解離成單鏈。當(dāng)終止變性處理，逐漸恢復(fù)溫度及性處理，逐漸恢復(fù)溫度及pHpH值時，被分開的單鏈值時，被分開的單鏈自動地復(fù)性形成原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。由于堿基是嚴(yán)自動地復(fù)性形成原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。由于堿基是嚴(yán)格配對的，因此一種探針格配對的，因此一種探針DNADNA只能與待檢標(biāo)本互補只能與待檢標(biāo)本互補DNADNA結(jié)合。因此將標(biāo)記有結(jié)合。因此將標(biāo)記有同位素同位素、熒光素、生物素?zé)晒馑?、生物素或地高辛或地高辛的探針的探針DNADNA固定在標(biāo)本上，用放射自顯影技固定在標(biāo)本上，用放射自顯影技術(shù)或免疫組織化學(xué)技術(shù)可顯示出探針術(shù)或免疫組織化學(xué)技術(shù)可顯示出探針DNADNA相結(jié)合的待相結(jié)合的待測測DNADNA或或RNA

16、.RNA.二、原位分子雜交技術(shù)二、原位分子雜交技術(shù)第35頁/共45頁第三十五頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。二、原位分子雜交技術(shù)二、原位分子雜交技術(shù)變性劑（尿素）、酸堿、熱、有機溶劑（乙醇）第36頁/共45頁第三十六頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。二、原位分子雜交技術(shù)二、原位分子雜交技術(shù) 1.1.核酸探針的制備核酸探針的制備 2.2.核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記 3.3.待測組織細(xì)胞標(biāo)待測組織細(xì)胞標(biāo)本中本中DNADNA或或RNARNA的檢的檢測測第37頁/共45頁第三十七頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。二、原位分子雜交技術(shù)二、原位分子雜交技術(shù) 1.1.核酸探針的制備核酸探針的制備（

17、一）探針的概念：（一）探針的概念：探針（探針（probeprobe） 指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被指能與特定靶分子發(fā)生特異性相互作用，并能被特殊方法所檢測的分子。特殊方法所檢測的分子。 例如抗原例如抗原- -抗體、生物素抗體、生物素- -親和素等均可看成是探親和素等均可看成是探針與靶分子的相互作用。針與靶分子的相互作用?；蛱结樆蛱结?指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異互補雜交，雜交后又能被特殊方法檢測的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素又能被特殊方法檢測的已知被標(biāo)記（同位素或非同位素標(biāo)記）的核苷酸鏈標(biāo)記）的核苷酸鏈。第38頁/共45頁第三十八頁

18、，編輯于星期日：十四點 五十六分。（二）探針種類（二）探針種類（1 1）基因組）基因組DNADNA探針探針 為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼為某一基因的全部或部分序列，或某一非編碼序列。序列。（2 2）cDNAcDNA探針探針 以以mRNAmRNA為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補于為模板經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化產(chǎn)生的互補于mRNAmRNA的的DNADNA鏈。鏈。 （3 3）RNARNA探針探針 以以DNADNA兩條鏈中的任意一條為模板轉(zhuǎn)錄生成兩條鏈中的任意一條為模板轉(zhuǎn)錄生成RNARNA。具高雜交效率，但易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜。具高雜交效率，但易于降解和標(biāo)記方法復(fù)雜。（4 4）寡核苷酸探針）寡核苷酸探針第39頁/共45頁第三十九頁，編輯于星期日：十四點 五十六分。v2.2.核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記（一）、標(biāo)記物（一）、標(biāo)記物放射性同位素標(biāo)記物放射性同位素標(biāo)記物非放射同位素標(biāo)記物非放射同位素標(biāo)記物二、原位分子雜交技術(shù)二、原位分子雜交技術(shù)第40頁