綜合實(shí)驗(yàn)步驟教材

1、RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄步驟組織RNA提?。?、將標(biāo)本約100mg放入研缽，立即加入液氮，研碎后，立即加入 TRIZOL 1mL,研磨10min（清亮）后，轉(zhuǎn)入1.5ml EP管，上下顛倒10次，室溫靜置 5min。標(biāo)本為組織時，12000轉(zhuǎn)離心10min取上清，轉(zhuǎn)下步。2、每加入1ml TRIZOL在EP管中加入氯仿0.2mL,震蕩15s后，靜置5min， 然后12000轉(zhuǎn)離心15mi n。3、將上層水相移入另一 EP管中（寧缺毋濫），并加入約0.5mL異丙醇，震 蕩混勻后靜置5min， 12000轉(zhuǎn)離心10min.4、棄上清加1mL 75%DEPC乙醇（-20 預(yù)冷），漂浮RNA沉淀，（脾臟 需

2、用Tip吹打以去盡雜質(zhì)），以7500轉(zhuǎn)離心5min。5、棄上清，置于工作臺開風(fēng)機(jī)干燥 30min，待RNA沉淀變成半透明時， 加入DEPC水20uL/40uL，如果沉淀不溶解，置于 55-60度溫箱水浴5min 左右。-70度保存或立即逆轉(zhuǎn)錄。靜脈血RNA提?。?、將5mL靜脈血于EDTA抗凝管中，放4C冰箱2h左右；2、3000轉(zhuǎn)離心5min，吸取上清置于1.5mL離心管；3、加4mL NS于下層血細(xì)胞中，吹打混勻以懸浮細(xì)胞；4、 加4mL大鼠淋巴細(xì)胞分離液到15mL離心管中，將血細(xì)胞懸液緩緩加到 裝有大鼠淋巴細(xì)胞分離液的離心管中；2000轉(zhuǎn)離心25min;5、小心吸取云霧層（即單個核細(xì)胞）

3、，7500轉(zhuǎn)離心5分鐘，去上清；6、以1ml NS重懸細(xì)胞，吹打洗滌，6500轉(zhuǎn)離心5min，吸盡上清，存于-80C 或加入TRIZOL/裂解液。逆轉(zhuǎn)錄步驟（MBI試劑盒）:1、05.mL EP管中加入DEPC 水10uLRNA1uLOligo1uL置于 PCR儀中 70E 5min （編號 XIER101 ）2、放入冰中5min3、點(diǎn)離5秒，加入5 X緩沖液4uLRnase抑制劑1uLdNTP2uL置于 PCR儀中 37C 5min （編號 XIER102 ）4、加入逆轉(zhuǎn)錄酶1uL，用tip頭吹打混勻，放入PCR儀中42r 60min, 70C 10min （編號 XIER103 ）,然后-

4、20C保存PCR步驟（25uL體系）：模板1uLSense1uLAnti-sense1uLTaqMIX12.5 uL去離子水加至25uL RNA濃度測定：取1uL RNA原液稀釋至250uL，測定其A260和A280的值,般A260/280的比值在1.8-2.0之間滿足實(shí)驗(yàn)要求RNA原液濃度=A260X稀釋倍數(shù)（250） 40 （ng/丄）Western blotting、主要試劑的配制（所有單位均為g/mL）丙稀酰胺29g+甲叉雙丙稀酰胺1g= 100ml，儲于1、丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺 棕色瓶，4 C避光保存。2、10%SDS、10%APS3、Tris-甘氨酸電泳緩沖液30.3gTris,

5、 187.7g甘氨酸，10gSDS,用蒸餾水溶解至1L,得10X緩沖液。4、 轉(zhuǎn)移緩沖液2.9g甘氨酸、5.8gTris堿、0.375g SDS 200mL甲醇，定容1L5、 麗春紅染液儲存液麗春紅S 2g三氯乙酸30g磺基水楊酸30g加水至100ml用時上述儲存液稀釋10倍即成麗春紅S使用液。使用后應(yīng)予以廢棄。6考馬斯亮藍(lán)染色液 1g考馬斯亮藍(lán)R-250用250mL的異丙醇攪拌溶解，再 加入100mL的冰醋酸，均勻攪拌，再加入 650mL的去離子水，均勻攪拌。濾紙 過濾后室溫保存。7、考馬斯亮藍(lán)脫色液醋酸100mL，乙醇50mL，蒸餾水850mL、制膠SDS薰丙師降農(nóng)羅膠的宥效分H范圍蜒性

6、drWffiS/kDfl131210 7,55.01D-4312-6C 20-8036 網(wǎng)IjL V出 丙蠟I用肥雙丙第禾胺的分子比是1：魏* A-iO配制Trh甘翼 5DS豪再坤HI啟薇膠電泳積晨膠帛用淳液一一一配常刁迥費(fèi)頼變膠所冃卷頤矗亦臥”123456BW*1,1Z,11,73.44.1S.5再嫦華良魁倉權(quán)（!fl.170 J30.50,670.83l.C】”31,71-0Tris ( PH6-R )0.250.50.630.751.01.1510% SDS山(HO D2D.03Q.040430,06O.GS10幕過黨寵讓（!）O.OL0.020舫0.04戰(zhàn)腐0.06O.OfiXITME

7、D 1)O.Q010.002帆0030.004D.OOS0.00ft10012,3in* sos0.05040.150.20.2S030”斗0.Su畀過噴曲館a0.050 J035DM0.250*30.40.5TEMED (|0.0G30.00&0.Q090.0120.015Q.Olfi0 G240.031,94.05.S7.911,9Li.y19點(diǎn)昶駕丙烯粧胺福合粧1.73.35.06,78.510.0Z16.71.5 itid/L T C pH8 R )ra2-53.45.0A.3T.S10,012.5in% sdsft.050.1nasC.2a. 250.35.4侗轉(zhuǎn)過曉釀容（!a/i0

8、45Q.25ft.A(J.4(MTEMED !)o.oaia.0040,00&o.oa0.0i0.0120.4U0 4212%t術(shù)t.B24.96.66,29.913.Z血秸丙烯Bfc抜推含菽（E2.06 0101201A.020.01-5 moVL Ttib(陽6 啟)1.32,5J.85.0心彳210.QL“10% SDSo.os0.1Eh 150.20.25030.40,5tnD.050,10.15040,250.30.40.5TEWED Q.OGZOg0.006(LOOS0.010.012IhOUD.Q3水1.1J,3Xd4+*5.?6.P気21U5如貉丙烯從墻iS合液（!2.55,0

9、7,510.012.515.0M-D25.01.5 tiwA/L Tni pH 目冶)1.)2,S38齊&6形7.510,012.J10% SJSn.05fi.lQ,1SOJ0.2S0.30.4G/C.M04*15O,ZQ,Z3a,30.4fl5TEMED 2 (如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行，常 用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液，3g檸檬酸二鈉+0.4g檸檬 酸+蒸餾水=1L )。( 4 )5% 正常山羊血清( PBS 稀釋)封閉(免疫熒光用 10%)，室溫孵育20min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37 C孵育1-2 h或4 C過夜(如 果選擇4C過夜，需37

10、C復(fù)溫45min,防止脫片)。封閉血清最常用的是 二抗動物的非免疫血清，用PBS稀釋為3%-10%溶 液孵育切片，以封閉吸附位點(diǎn)。其它無關(guān)蛋白，如牛血清白蛋白也常用。封閉時 間一般為10-30min。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果 最佳；孵育時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后 37 度復(fù)溫 45min。 Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在細(xì)胞免 疫組織化學(xué)或組織免疫組化(10um厚切片)推薦使用，作為細(xì)胞通透劑，在膜 上打孔。( 5 ) PBS 沖洗， 5min 3 次。(6 )滴加適量生物素(b

11、iotin)標(biāo)記二抗工作液，37 C孵育30min (同時 配制鏈霉卵白素工作液，因其配好 30min 后才能使用)。( 7 ) PBS 沖洗， 5min 3 次。(8 )滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(avidin)工作液，37 C孵育 30min。( 9 ) PBS 沖洗， 5min 3 次。( 10 ) DAB 顯色劑顯色 3-15min。( 11 ) 自來水 充分沖洗， 蘇木素復(fù)染(數(shù)秒或不染) ，脫水，透明，封片。PK-4001試劑盒內(nèi)容:A：封閉用血清B :生物素標(biāo)記二抗PK-4001 :生物素標(biāo)記羊抗兔IgGC:卵白素D:生物素化辣根酶工作液的配制1、稀釋液:可以采

12、用多種緩沖液對本系列產(chǎn)品進(jìn)行稀釋，最常用的的稀釋液是中 性的磷酸鹽緩沖液（10mM PBS ）。2、封閉血清：稀釋比例1:503、生物素化抗體:稀釋比例1:2004、 ABC復(fù)合物:將試劑C和D按1:100的稀釋比例等量混合，放置30分鐘后方 可使用。貼心提示1、本系列檢測試劑盒適用于絕大多數(shù)組織，但對于內(nèi)源性生物素含量比較豐富 的組織（如腎臟、肝臟等），應(yīng)選用非生物素檢測系統(tǒng)。2、本品為濃縮液，需預(yù)先稀釋方可使用，稀釋后的液體不能長期保存。3、如以每張切片加入1滴（約50）計(jì)算，1/4Kit可做750張切片，1Kit可做 3000張切片。Weil髓鞘染色法1 試劑配制A液：蘇木精1g,無水酒

13、精100ml，溶解后備用B液:硫酸鐵胺4g,蒸餾水100ml,溶解后備用C液：鐵氰化鉀12.5g,硼砂2.5g,蒸餾水1000mLD液：綜合染液，A液1份，B液1份，蒸餾水2份，混勻2 實(shí)驗(yàn)方法(1) 石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，將切片轉(zhuǎn)入 D液染色20min;(2) 取出切片充分水洗后，置于 B液分色，至灰質(zhì)和白質(zhì)可以區(qū)別為止(3) 自來水沖洗，蒸餾水洗滌2次；(4) 置于C液中分色片刻，取出后蒸餾水洗滌；(5) 常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固3結(jié)果判斷正常神經(jīng)髓鞘被深蘭色至黑色， 灰質(zhì)至深黃色至無色，變性和潰變的 髓鞘不著色。1、石蠟切片和冰凍切片的比較？(1) 要求做冰凍切片的不一定能

14、做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得 出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織 的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。(2) 冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化 時不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗 原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時，目錄上 都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都 可，那就都能做。(3) 石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫， 而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中

15、，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。2、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合，就像導(dǎo)彈精確地命中目標(biāo)一樣。另一方面，即使是同一個抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾 種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗 體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就 低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體

16、的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異 性染色（可以通過封閉等避免）。（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于 Wester n blotti ng，或免疫組化、 免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。（3）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗 體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克??；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。（5）生產(chǎn)廠家的選擇。如santa Cruz公司抗體一般1ml，價格2100元左右；而chemicon公司一抗一般100，價格2800

17、元左右。這兩個廠家的同一種抗體 它的實(shí)際效價穩(wěn)定是不同的，我一般用后者抗體做免疫組化效果較好，而前者做Wester n blotti ng 效果還可以。3、在什么情況下使用Triton-X100（1）Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚， 是一種去污劑。在免疫 組織化學(xué)（10um厚切片） 和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100作為細(xì)胞通 透劑，在膜上打孔。（2）其作用原理：Triton X-100可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。（3）Triton

18、 X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。4、封閉血清的選擇原則是什么？（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的 假陽性?。?）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能 和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié) 合，會造成背景。（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。5、抗體孵育條件的比較？（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育 時間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般 37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出后 37度復(fù)溫45min。（2）二抗一般室溫或37度30mi

19、n-1h，具體時間需要摸索。6、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達(dá)較弱的抗 原可能有用，4度和37度時分子運(yùn)動方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度 小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提咼了并易造成非特異染色。（3） 其實(shí)，我更贊同后一種說法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度過 夜拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯！7、DAB顯色時間如何把握？（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現(xiàn)淺 棕色本底時即可沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾

20、十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可 能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長， 需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗 體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性 蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能 說明你的抗體濃度過低或孵育時間過短 （最好一抗4度過夜）；另一方面就是封 閉時間過長。8、免疫組化結(jié)果如何分析？（1）陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個視野， 人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組36張不同動物組織切片，然后進(jìn)行組間比 較即可。（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切

21、片上選擇相同區(qū)域、 相同條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。（3） 評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（ 03分為 陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評分（14分為025%、 2650%、5175%、76100%）,最終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是 你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間 交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決

22、定 族重新暴露，提高抗原檢測率。（2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。（3）微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時間和濃度是什么？（1）一般3%過氧化氫滅活時間短點(diǎn)，可以10min左右；而0。3%過氧化 氫則可以適當(dāng)延長封閉時間，一般 1030mi n。（2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或 PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作 用，過氧化氫孵育時間過長易引起脫片。（3）現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。11、如何才能充分脫蠟？（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟

23、存留于切片上，將會引起染色 不均勻、陽性物時隱時現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須徹底脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)， 脫蠟時間較短；（2）脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時間不需很多， 3-5分鐘就已足夠。如 果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時間需要延長， 10-20分鐘或 更長。（3）當(dāng)天切的切片，燒烤2小時后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將 可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加 溫10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快

24、，效果更好?？傊?，操作時應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的 時間，原則上是要徹底、干凈、完全地脫去切片上的蠟。12、如何最大限度地降低組織非特異性染色？（1）縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制。這是最重要的一條。（2）抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看（3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞 多的組織），需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清 封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；（5）縮短DAB孵育時間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；（6）

25、適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時間，在一抗、二抗或 SP孵育之后的 浸洗尤為重要；（7）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。13、蘇木素復(fù)染時間的把握？（1）蘇木素復(fù)染時間要看當(dāng)時的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情 況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分 化時間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗， 然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭 即可。（3）如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時間的選擇？（

26、1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗 孵育完后，將它們在一個缸內(nèi)洗，這樣就會造成交叉污染，影響最后的結(jié)果。正 確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的 PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污 染的機(jī)會。（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。沖洗切片，取出切片，將 PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來， 不要拿起切片將PBS對準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的 PBS有一定的沖擊力，很 容易使切片周邊引起松動，導(dǎo)致切片的脫落。（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結(jié)合的物質(zhì)。沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景， 此

27、種做法一是浪費(fèi)時間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為， 用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能徹底沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它 條件，沖洗好于切片上再注入 PBS，持續(xù)2分鐘左右就完全足夠了。（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利 于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。（5）常用試劑的配制和使用。在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得最多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡?個染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液?？梢娋彌_液在整個染色中都起至關(guān)鍵的作用， 緩沖液的過

28、酸或偏堿，都將影響染色的結(jié) 果。15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均 勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容 易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛(wèi) 生紙從邊緣上慢慢吸水。（6） 修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到 EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問 題上著手。（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用 PBS的時候盡量 用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注