大學(xué)生實驗創(chuàng)新計劃安排項目報告書

1、大學(xué)生實驗創(chuàng)新計劃項目結(jié)題報告書項目名稱：七彩山雞源大腸桿菌產(chǎn) ESBLs的檢測及藥敏分析主持人：施沖旭所在學(xué)院：牧醫(yī)工程學(xué)院專業(yè)年級：08級動物醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：潘玉善職稱講師起止年月：2009 年10月至2010年3 月填寫日期：2010年4 月 14日七彩山雞源大腸桿菌產(chǎn)ESBLs的檢測及藥敏分析施沖旭、杜艷麗、馮芬芬、黃旭東、翟明勝指導(dǎo)老師：潘 玉善摘要：采用全自動微生物鑒定系統(tǒng)（Vitek-32 ）鑒定了 8株七彩山雞源大腸桿菌，并對分離菌進行超廣譜3-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的檢測，及對14種抗菌藥和2種復(fù)方藥物進行敏感性測定。結(jié)果顯示，分離的8株菌大腸桿菌均不產(chǎn)ESBLs，對藥敏試驗結(jié)

2、果表明該珍禽養(yǎng)殖場分離的大腸桿菌對獸醫(yī)臨床中常用的 3大類抗菌藥（氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類）9種藥物均 產(chǎn)生高度耐藥，顯示出嚴重的多重耐藥性。關(guān)鍵詞：七彩山雞；大腸桿菌； 超廣譜3內(nèi)酰胺酶（ESBLs）;藥敏分析七彩山雞是珍禽品種中養(yǎng)殖比較簡單、抗病力強、市場銷路大，已在我國南北各地得到普及發(fā)展的優(yōu)良珍禽品種。 但近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖區(qū)域的擴 大，一些常見條件性致病菌如大腸桿菌，也像肉雞場、蛋雞場那樣常發(fā)，給養(yǎng)殖 戶帶來很大的損失。目前，雞大腸桿菌病的治療主要依靠抗菌藥， 但隨著抗菌藥 的廣泛、大量甚至不規(guī)范使用，細菌耐藥性的產(chǎn)生越來越嚴重，給臨床預(yù)防和控 制該病造成很大困難。20

3、09年 7月，滎陽某珍禽有限公司飼養(yǎng)的 七彩山雞于20日齡時開始發(fā)病，經(jīng) 藥物治療無效后，送我室求診，根據(jù)其發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化及Vitek-32 全自動微生物鑒定儀鑒定，確診為大腸桿菌感染。為探明該雞場藥物防治失敗的 原因，本試驗對臨床分離的8株雞大腸桿菌進行了 ESBLs檢測，并用標準K-B紙片 法測定了 8株菌對14種抗菌藥物及2種復(fù)方藥物的敏感性，以便為掌握雞大腸桿 菌產(chǎn)ESBLs情況以及臨床合理選擇抗菌藥提供科學(xué)理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料菌株來源8株試驗菌源于 2009年7月自滎陽某珍禽有限公司送檢患病死亡的七彩山雞 肝臟和心臟分離，并經(jīng)Vitek-32全自動細菌鑒定儀

4、鑒定的大腸桿菌。質(zhì)控菌株： 大腸埃希氏菌ATCC25922 （由中國普通微生物菌種保存中心提供），肺炎克雷伯 菌 ATCC700603 （由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部提供） 。藥敏紙片藥敏紙片：頭抱他啶CAZ、頭抱噻肟CTX、氨曲南AZT均為30卩g片，頭 抱他啶/棒酸CAZ/CA、頭抱噻肟/棒酸CTX/CA均為30 /10卩片；阿米卡星（AN ）、 氨芐西林（AM）、環(huán)丙沙星（CIP）、慶大霉素（GM）、鏈霉素（S）、妥布霉素（TM）、 新霉素（N）、米諾環(huán)素（MNO）、多西環(huán)素（DO）、氨芐西林/舒巴坦（AM/SU）、左氧 氟沙星（LVF）、諾氟沙星（NOR）、磷霉素（FOS）、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶（

5、SXT），以 上藥物均為北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。1.1.3 培養(yǎng)基麥康凱瓊脂、 MH 瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯均購自廣東環(huán)凱微生物科技公司，SS瓊脂購自杭州天和微生物試劑有限公司。1.1.4 儀器VITEK-32 全自動微生物鑒定系統(tǒng)和 GNI 革蘭氏陰性菌鑒定卡： 法國生物梅 里埃公司產(chǎn)品；超凈工作臺（蘇凈集團安泰公司制造） ，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海躍進醫(yī)療器械廠）等。1.2 方法1.2.1 細菌的分離、鑒定無菌從病死雞中挑取少許心、肝組織接種于 TSB 增菌液中增菌培養(yǎng) 18 h， 再次劃線接種于麥康凱瓊脂平板上和 SS瓊脂平板上，37C恒溫培養(yǎng)18 h后挑取 在麥康凱瓊脂平

6、板和SS瓊脂平板上單個典型菌落進行純培養(yǎng)。經(jīng)涂片、染色、 鏡檢，證實為純培養(yǎng)物， 將其作為試驗受試菌株。 然后經(jīng) Vitek-32 全自動微生物 鑒定系統(tǒng)進行鑒定。1.2.2 ESBLs 的檢測按美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）推薦的表型確證試驗法進行：將濃度 為0.5個麥氏單位的受試菌液用無菌棉簽涂布于 MH 平板，分別兩兩對應(yīng)貼上頭 抱他啶（CAZ，30卩g片），頭抱他啶/棒酸（CAZ/CA，30卩g/10卩g片、，頭 抱噻肟（CTX , 30卩前）,頭抱噻肟/棒酸（CTX/CA , 30卩g/10卩g片）紙片， 37C培養(yǎng)16 h,測量抑菌圈大小。當(dāng)兩組藥物中有任意一組中有加 CA的

7、抑菌圈 直徑比不加CA的抑菌圈直徑相差5 mm即確定為產(chǎn)ESBLs菌株。藥物敏感性試驗采用標準K-B紙片法，測定藥物對細菌的抑菌圈大?。╩m）,試驗結(jié)果按照 CLSI標準判讀敏感、中介和耐藥。2結(jié)果與分析2.1細菌分離鑒定結(jié)果臨床分離的8株細菌在麥康凱瓊脂平板和 SS瓊脂平板上均形成粉紅色菌 落；分離株經(jīng)純化培養(yǎng)后，經(jīng)Vitek全自動細菌鑒定儀和GNI+革蘭氏陰性菌鑒定 卡鑒定，結(jié)果為大腸桿菌。2.2 ESBLs檢測結(jié)果8株山雞大腸桿菌產(chǎn)ESBLs的表型確認試驗結(jié)果見表1,從表1可以看出： 在確證試驗中8株菌由CTX或CAZ在加酶抑制劑與不加酶抑制劑的抑菌圈直徑 差均小于5 mm,確認為不產(chǎn)E

8、SBLs菌株。各藥對質(zhì)控菌的抑菌圈均符合 CLSI 規(guī)定的標準。表18株七彩山雞大腸桿菌疑似產(chǎn) ESBLs的菌株的表型確認試驗結(jié)果（抑菌圈直徑單位:mm）菌株bacterial頭抱噻 肟CTX頭抱噻肟/棒酸 CTX/CA陰性/陽 性（-/+）頭抱他 啶CAZ頭抱他啶/棒酸 CAZ/CA陰性/陽 性（-/+）E.coli 13232-2827-E.coli 23232-2827-E.coli 33332-2826-E.coli 43132-2827-E.coli 531312726E.coli 63031- 2626E.coli 73031- 2626E.coli 83233- 28272.3藥

9、敏試驗結(jié)果用標準K-B紙片法測定14種藥物和2種復(fù)方藥對細菌的抑菌圈大小（mm）, 試驗結(jié)果按照CLSI標準判讀敏感、中介和耐藥。測定結(jié)果如表2和表3。表214種藥物和2種復(fù)方對8株山雞大腸桿菌的抑菌圈大?。▎挝唬?mm）藥物 Antimicrobialage ntE.coli1E.coli2E.coli3E.coli4E.coli5E.coli6E.coli7E.coli8氨卞西林（AM）66666666氨卞西林/舒巴坦（AM/SU ）1715151716151420頭孢他啶（CAZ ）2828282827262628頭孢噻肟（CTX ）3232333131303032阿米卡星（AN ）66

10、666666慶大霉素（GM ）66666666鏈霉素（S）66666666妥布霉素（TM ）66666666新霉素（N）2120141918181818米諾環(huán)素（MNO ）202061119191714多西環(huán)素（DO）1818661918186環(huán)丙沙星（CIP）666966610左氧氟沙星（LVX ）666969610諾氟沙星（NOR）6661066610磺胺甲惡唑/甲氧卞啶（SXT）666969610磷霉素（FOS3535333531323030表38株臨床分離菌對試驗中所用抗菌藥的耐藥情況藥物An timicrobial age nt 敏感株 中介株 耐藥株 耐藥率（%）100氨芐西林（A

11、M）氨芐西林/舒巴坦（AM/SU ）710頭抱他啶（CAZ）800頭抱噻肟（CTX ）800阿米卡星（AN ）008慶大霉素（GM ）008鏈霉素（S）008妥布霉素（TM ）008新霉素（N）701米諾環(huán)素（MNO ）512多西環(huán)素（DO）503環(huán)丙沙星（CIP）008左氧氟沙星（LVX ）008諾氟沙星（NOR）008磺胺甲惡唑/甲氧芐啶008磷霉素（FOS）8000010010010010087.52537.51001001001000注：新霉素是按阿米卡星的判斷標準按照CLSI的耐藥判斷標準，由表3可見，分離的8株大腸桿菌對&內(nèi)酰胺 類抗生素中頭抱菌素類藥物高度敏感， 而氨芐西林全部耐

12、藥；本次分離的雞大腸 桿菌對氟喹諾酮類藥物（環(huán)丙沙星、加諾氟沙星、左氧氟沙星）全部耐藥；對氨 基糖苷類抗生素（慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、妥布霉素、新霉素）除新霉素 外其余全部耐藥，提示這幾株菌對氨基糖苷類抗生素高水平耐藥； 對磺胺類藥物 也全部耐藥，僅對多西環(huán)素和米諾環(huán)素敏感。由此可以看出，該雞場分離的大腸 桿菌對獸醫(yī)臨床中常用的3大類抗菌藥（氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類）9種藥物均產(chǎn)生高度耐藥，顯示出嚴重的多重耐藥性。3討論本次試驗分離、鑒定的七彩山雞源大腸桿菌，通過ESBLs的檢測發(fā)現(xiàn)分離菌全部不產(chǎn)ESBLs，該養(yǎng)雞場存在的雞大腸桿菌產(chǎn) ESBLs并不嚴重，但是藥敏 試驗結(jié)果表明分離的

13、大腸桿菌對獸醫(yī)臨床中常用抗菌藥呈現(xiàn)嚴重的多重耐藥性。 分離的雞大腸桿菌對3大類抗菌藥（氟喹諾酮類、氨基糖苷類、磺胺類）9種藥物均產(chǎn)生高度耐藥，這種嚴重的多重耐藥現(xiàn)象也解釋了該雞場藥物無法控制大腸 桿菌發(fā)病的原因。一些文獻都報道了對七彩山雞源大腸桿菌的藥敏試驗，但與藥敏結(jié)果差異比較大，這可能與不同地區(qū)養(yǎng)殖場的用藥習(xí)慣有關(guān)， 也可能是隨著時 間推移，細菌的耐藥不斷傳播和擴散，應(yīng)引起足夠的重視。針對一些養(yǎng)殖場，在疾病發(fā)生時缺乏有效的藥物進行治療現(xiàn)狀， 為避免耐藥性的進一步發(fā)展， 防止對人類造成危害， 應(yīng)盡量減少抗生素的使用， 加強生物安 全措施的實施，走健康、生態(tài)養(yǎng)殖。即使要用，臨床上也應(yīng)做到合理使

14、用抗菌藥 物，如采取聯(lián)合用藥、輪換用藥等方式，每次用藥前，最好結(jié)合藥敏試驗來選擇 最合適的、有針對性的抗菌藥物。此外，還可以考慮使用中草藥、微生態(tài)制劑等 其它產(chǎn)品來部分替代目前常用的抗菌藥， 達到少用抗菌藥， 從而降低或減緩細菌 耐藥性的產(chǎn)生和擴散，促進養(yǎng)禽業(yè)的健康快速發(fā)展。根據(jù)產(chǎn)ESBLs和藥敏結(jié)果，推薦該珍禽公司用復(fù)方氨芐西林、 復(fù)方阿莫西林、 多西環(huán)素進行治療， 如果腸道 感染才考慮使用新霉素。參考文獻：1 Bradford P A. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization, epid

15、emiology, and detection of this important resistance threat.J. Clin Microbiol Rev,2001,14(4):933-951.2 Neu HC. The crisis in antibiotic resistanceJ.Science, 1992, 257(5073): 1064.3 Clinical and laboratory standards institute: Performance Standards forAntimicrobial Susceptibility Testing; Eighteenth Informational Supplement. CLSI document M100-S18S. Wayne Pennsylvania, CLSI, 2008, 28(1):1-83.4 宋立, 寧宜寶 , 張秀英 , 等. 中國不同地區(qū)家禽大腸桿菌血清型分布和耐藥 性比較研究 J. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2005, 38(7):1466-1473.5 劉曉華, 張林波 , 沙里金