實(shí)驗(yàn)三 血清γ-球蛋白的分離、純化及鑒定(七年制)

1、血清血清球蛋白的球蛋白的分離純化與鑒定分離純化與鑒定劉曉如【實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康摹? 1學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純學(xué)習(xí)鹽析法、凝膠層析和離子交換層析分離純 化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用化蛋白質(zhì)的基本原理及應(yīng)用2 2掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用掌握醋酸纖維薄膜電泳技術(shù)的原理及應(yīng)用3 3了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路了解蛋白質(zhì)分離純化的總體思路【實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)方法】 一、鹽析法粗分一、鹽析法粗分-球蛋白球蛋白 二、凝膠過(guò)濾方法脫鹽二、凝膠過(guò)濾方法脫鹽 三、離子交換層析方法純化三、離子交換層析方法純化-球蛋白球蛋白 四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定四、醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定-球蛋白的純度球蛋

2、白的純度【基本原理基本原理】 蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定蛋白質(zhì)的分離、純化及鑒定是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性是研究蛋白質(zhì)化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。質(zhì)及生物學(xué)功能的重要手段之一。 不同蛋白質(zhì)的不同蛋白質(zhì)的分子量、溶解度分子量、溶解度及在一定條件下，及在一定條件下，帶帶電的情況電的情況等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分等都有所不同。利用這些性質(zhì)的差別，可分離純化各種蛋白質(zhì)。離純化各種蛋白質(zhì)。分離蛋白質(zhì)的方法分離蛋白質(zhì)的方法分離方法分離方法沉淀法沉淀法鹽析法鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法層析法層析法 電學(xué)法電學(xué)法電泳法電泳法等電聚焦等電聚焦超速離心法超速離心法離子交換層析離子交換層析吸附層析吸

3、附層析凝膠過(guò)濾（分子篩）凝膠過(guò)濾（分子篩）親和層析親和層析在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互在分離純化時(shí)，根據(jù)情況選用幾種方法，相互配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的。配合才能達(dá)到分離純化一種蛋白質(zhì)的目的?！净驹砘驹怼?本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)采用硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過(guò)硫酸銨鹽析、葡聚糖凝膠過(guò)濾、離子交換層析濾、離子交換層析方法，分離純化血清方法，分離純化血清-球蛋白。最后用球蛋白。最后用醋酸纖維素薄膜電泳法醋酸纖維素薄膜電泳法鑒定鑒定-球蛋白的純度。球蛋白的純度。 分段鹽析去除雜蛋白分段鹽析去除雜蛋白凝膠層析脫鹽凝膠層析脫鹽交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮交聯(lián)葡聚糖吸水濃縮醋酸纖維素薄膜電泳鑒定

4、醋酸纖維素薄膜電泳鑒定離子交換層析純化離子交換層析純化 鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度的鹽析法是根據(jù)不同蛋白質(zhì)在不同濃度的中性鹽溶液中中性鹽溶液中溶解度溶解度不同，分別析出，達(dá)到不同，分別析出，達(dá)到彼此分離的方法。彼此分離的方法。 本實(shí)驗(yàn)在本實(shí)驗(yàn)在半飽和硫酸銨半飽和硫酸銨溶液中，清蛋白溶液中，清蛋白溶解，溶解，球蛋白將沉淀球蛋白將沉淀析出，經(jīng)離心所得的沉析出，經(jīng)離心所得的沉淀即為球蛋白的粗提液。淀即為球蛋白的粗提液。定義定義：加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)加入大量中性鹽以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。 原理原理: : 破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素

5、：破壞蛋白質(zhì)兩個(gè)穩(wěn)定因素： 水化膜和電荷層水化膜和電荷層中性鹽：中性鹽：(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4、NaNa2 2SOSO4 4、NaClNaCl等。等。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：蛋白質(zhì)不變性，常用。蛋白質(zhì)不變性，常用。鹽析步驟鹽析步驟取離心管一支加入血清取離心管一支加入血清 2ml加入加入2ml 0.9%氯化鈉搖勻氯化鈉搖勻邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和邊攪拌混勻邊緩慢滴加飽和(NH4)2SO4 4ml上清液（主要含清蛋白）上清液（主要含清蛋白）傾去傾去靜置靜置10min，再離心（，再離心（5000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分）分）10min沉淀用沉淀用1ml 0.9%氯化鈉攪拌溶解氯化鈉攪拌溶解逐滴加飽和逐滴加

6、飽和(NH4)2SO4 2ml, ,搖勻搖勻靜置靜置10min，再離心，再離心（5000轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)/分）分）10min傾棄上清液（主要含傾棄上清液（主要含、球蛋白）球蛋白）沉淀即為初步純沉淀即為初步純化的化的球蛋白球蛋白加入加入0.0175mol/L磷酸緩沖液磷酸緩沖液（pH=6.3)1ml溶解溶解球蛋白球蛋白粗提液粗提液二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽二、葡聚糖凝膠柱層析脫鹽 欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量欲去除鹽析法分離得到的球蛋白粗提液中大量鹽，通常有兩種方法：鹽，通常有兩種方法： 凝膠層析法、透析凝膠層析法、透析本試驗(yàn)采用本試驗(yàn)采用葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠SephadexSephadex G

7、25 G 25層析層析方法方法除去球蛋白粗提液中的鹽除去球蛋白粗提液中的鹽硫酸銨硫酸銨，以便下一步用離子，以便下一步用離子交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。交換層析方法進(jìn)一步提純球蛋白。 凝膠層析凝膠層析原理：原理：P31凝膠層析法是按混合物各組分凝膠層析法是按混合物各組分分子量分子量大小大小不同隨不同隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。流動(dòng)相經(jīng)過(guò)層析柱的時(shí)間不同而被分離的技術(shù)。 是一類(lèi)具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，是一類(lèi)具有三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的干燥顆粒，凝膠凝膠直徑大于凝膠網(wǎng)孔的直徑大于凝膠網(wǎng)孔的不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只不能進(jìn)入凝膠內(nèi)部，只能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，所以流程短、

8、能沿著凝膠顆粒間的間隙隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，所以流程短、流速快，首先流出層析柱；而流速快，首先流出層析柱；而直徑小于凝膠直徑小于凝膠網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長(zhǎng)，后流出層析柱，經(jīng)過(guò)一定網(wǎng)孔能自由出入，洗脫時(shí)間長(zhǎng)，后流出層析柱，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間時(shí)間。 凝膠柱層析脫鹽凝膠柱層析脫鹽數(shù)學(xué)模型 Vo Vi VtViVi凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）凝膠孔內(nèi)水（內(nèi)水）VoVo顆粒間水（外水）顆粒間水（外水）VgVg凝膠體積凝膠體積總體積總體積VtVt= = Vi Vi + +VoVo+ +VgVgKdKd 分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分配系數(shù)：精確衡量混合物中某一待分離成分在凝膠柱內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分分離成分在凝膠柱

9、內(nèi)的洗脫行為，反映物質(zhì)分子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一子進(jìn)入凝膠顆粒的程度，是溶質(zhì)分子大小的一個(gè)函數(shù)個(gè)函數(shù)VeVe洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫洗脫體積：分離物被洗脫時(shí)所用的洗脫液體積液體積 K Kd d=(V=(Ve e-V-Vo o)/V)/Vi i 洗脫曲線(xiàn)：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃洗脫曲線(xiàn)：以洗脫體積為橫坐標(biāo)，各物質(zhì)濃度度/ /吸光度為縱坐標(biāo)作圖吸光度為縱坐標(biāo)作圖（1 1）完全被排阻的極端大分子，）完全被排阻的極端大分子，VeVe= =VoVo，KdKd=0=0（2 2）中等分子，）中等分子，VeVe= =VoVo+ +KdKdViVi，00KdKd11（3 3）完全

10、滲透的小分子，）完全滲透的小分子，VeVe= =VoVo+ +ViVi， KdKd=1=11 1、層析柱保持垂直。層析柱保持垂直。2 2、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。、放蒸餾水，排出空氣，關(guān)閉出口。3 3、加入攪拌均勻的、加入攪拌均勻的SephadexG-25懸液，調(diào)節(jié)流速懸液，調(diào)節(jié)流速10滴滴/min，使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至使凝膠均勻沉降，不斷補(bǔ)充，直至18cm。4、上留上留1-2mm的水，關(guān)閉出口。的水，關(guān)閉出口。 床面上要保持少許床面上要保持少許水，水， ，用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降，用玻棒輕輕攪動(dòng)，讓凝膠自然沉降， 使表面平整。使表面平整。1、加樣：、加樣：用滴管將鹽析后

11、樣品加入柱床面，打開(kāi)出口使樣用滴管將鹽析后樣品加入柱床面，打開(kāi)出口使樣品品 溶液滲入凝膠。溶液滲入凝膠。2、洗脫：、洗脫：加入洗脫液，打開(kāi)出口，保持流速加入洗脫液，打開(kāi)出口，保持流速10滴滴/min，收收 集洗脫液，每管收集集洗脫液，每管收集1ml。用。用。3、保存：、保存：，保，保存存 含量高的進(jìn)一步純化含量高的進(jìn)一步純化 不斷加洗脫液，使不斷加洗脫液，使全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備全部流出，為下次實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10上樣上樣球蛋白，球蛋白， 粗提液粗提液 裝柱裝柱 葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-25， 柱高柱高18-20cm流速：每分鐘流速：每分鐘10滴左右滴左右收

12、集收集 20滴換滴換一支試管一支試管. .層析后洗脫液檢測(cè)層析后洗脫液檢測(cè)白色比色板白色比色板, ,洗凈備用。洗凈備用。一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測(cè)一塊在各孔滴加奈氏試劑（檢測(cè)NHNH4 4+ +）, ,另一塊另一塊滴加滴加20%20%璜基水楊酸（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。璜基水楊酸（檢測(cè)蛋白質(zhì)）。不用滴管不用滴管, ,避免污染避免污染, ,直接倒直接倒用用“-”-”表示無(wú)現(xiàn)象，用表示無(wú)現(xiàn)象，用“+”, “+”, “+”+”, “+”, “+”等表示顏色深淺等表示顏色深淺1 . 凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞凝膠柱的制備質(zhì)量決定分離效果的好壞 。 2. 加樣分離時(shí)，滴速越慢，分離效果越好。加樣分離時(shí)，

13、滴速越慢，分離效果越好。 以管號(hào)為橫軸，蛋白以管號(hào)為橫軸，蛋白質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫質(zhì)含量為縱軸繪制洗脫曲線(xiàn)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。曲線(xiàn)，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 1. 1. 通過(guò)使用通過(guò)使用進(jìn)一步進(jìn)一步 純化純化-球蛋白脫鹽液，得到較純的球蛋白脫鹽液，得到較純的-球蛋白溶液球蛋白溶液 2. 2. 學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用學(xué)習(xí)了解離子交換層析方法的基本原理和應(yīng)用 離子交換層析是一種常用的、通過(guò)使用各種類(lèi)型的離離子交換層析是一種常用的、通過(guò)使用各種類(lèi)型的離子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通子交換劑達(dá)到分離純化目的的層析方法。離子交換劑是通過(guò)化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固

14、體物過(guò)化學(xué)反應(yīng)將帶電基團(tuán)引入到惰性支持物上形成的固體物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽(yáng)離質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)中作為固定相。如果其帶負(fù)電，則能結(jié)合陽(yáng)離子，成為子，成為陽(yáng)離子交換劑陽(yáng)離子交換劑；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，；如果其帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱(chēng)為稱(chēng)為陰離子交換劑陰離子交換劑?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇不同的離子交?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需要，選擇不同的離子交換劑進(jìn)行離子交換層析。換劑進(jìn)行離子交換層析。 DEAE DEAE （二乙基氨基乙基）纖維素二乙基氨基乙基）纖維素含有可離子化的堿含有可離子化的堿基，可與氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑?；膳c氫離子結(jié)合，成為帶正電荷的陰離子交換劑。

15、血清血清、球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為：球蛋白、清蛋白的等電點(diǎn)為： 清蛋白清蛋白pI= =4.64， 2球蛋白球蛋白 pI= =5.06， 球蛋白球蛋白pI= =5.12， 球蛋白球蛋白pI= =7.3 本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)采用0.0175 mol/l pH6.5 NH4Ac緩沖液緩沖液進(jìn)行洗脫。此進(jìn)行洗脫。此pH，DEAE帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的帶正電荷，可與帶負(fù)電荷的、-球蛋白和清蛋白結(jié)合，而球蛋白和清蛋白結(jié)合，而帶正電荷的帶正電荷的-球蛋白球蛋白不與不與DEAEDEAE結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來(lái)結(jié)合，首先從層析柱中洗脫出來(lái)，首先收集，首先收集到的既是純化的到的既是純化的-球蛋白。球蛋白。 將脫

16、鹽后的球蛋白加于將脫鹽后的球蛋白加于DEAE柱上（方法同柱上（方法同凝膠過(guò)濾），用凝膠過(guò)濾），用0.0175 mol/l pH 6.3 NH4Ac緩沖液洗脫，流速緩沖液洗脫，流速10滴滴15滴滴/分，用小試管連分，用小試管連續(xù)收集流出液（約續(xù)收集流出液（約1.0 ml/管），用管），用20%20%磺基水楊磺基水楊酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況酸溶液檢查蛋白質(zhì)分布情況，收集含量最高的部，收集含量最高的部分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來(lái)的是分，濃縮作純度鑒定。用該緩沖液洗脫下來(lái)的是球蛋白。球蛋白。. .使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。使用離心機(jī)的操作注意事項(xiàng)。. .裝柱時(shí)檢查是否漏水。裝柱時(shí)檢查是否漏水

17、。. .裝柱后凝膠裝柱后凝膠均一無(wú)斷層，無(wú)氣泡，柱床面平整均一無(wú)斷層，無(wú)氣泡，柱床面平整。. .柱床面保持有緩沖液。柱床面保持有緩沖液。. .加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。加樣時(shí)動(dòng)作緩慢輕柔，不要破壞柱床面的平整。. .每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被每用一次滴管，請(qǐng)用水清洗干凈，防止試劑及被測(cè)樣品交叉污染。測(cè)樣品交叉污染。 利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大利用葡聚糖凝膠富含羥基，吸水，不允許大分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量分子蛋白進(jìn)入微孔的特性，在樣品溶液中加少量凝膠，離心，濃縮蛋白。凝膠，離心，濃縮蛋白。 每每mlml純化純化球蛋白溶液加球蛋白溶液加

18、SephadexSephadex G-25 0.25 g G-25 0.25 g，搖動(dòng)搖動(dòng)2 23 3分鐘，離心分鐘，離心3000r/min3000r/min，5 5分鐘，上清即為濃縮分鐘，上清即為濃縮-球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。球蛋白（或用冷凍干燥儀使其濃縮）。 1 1、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。、以醋酸纖維薄膜作為支持體的一種電泳方法。2 2、在、在pH8.6pH8.6巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中巴比妥緩沖液中，血清蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中均帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。均帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。3 3、帶電荷多、分子量相對(duì)小的泳動(dòng)速度快；帶電荷、帶電荷多、分子量相對(duì)小的泳動(dòng)速度快；帶電荷少、分子量相對(duì)大的泳動(dòng)速度慢。少、分子量相對(duì)大的泳動(dòng)速度慢。 清蛋白清蛋白 1 2 加樣線(xiàn)加樣線(xiàn)加樣線(xiàn)加樣線(xiàn)純化蛋白純化蛋白對(duì)照對(duì)照樣品樣品 點(diǎn)樣點(diǎn)