生物制藥課件2-1說課材料

1、生物制藥課件2-1細 菌3、糖類 利用細菌可制取葡聚糖、聚果糖、脂多糖，還可生產(chǎn)單糖和寡糖。4、核苷酸類 5-AMP、5-肌苷酸、核苷及磷酸核糖。5、維生素 VB1、VB2、VB6、煙酸、生物素等。6、酶 -淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、幾丁質(zhì)酶等。放 線 菌 放線菌是最重要的抗生素產(chǎn)生菌，已有1000多種抗生素約2/3產(chǎn)自放線菌，其代謝產(chǎn)物也是重要的資源：1、氨基酸2、核苷酸類3、維生素（B族維生素、胡蘿卜素等）4、酶（高溫蛋白酶、中性和堿性蛋白酶、纖 維素酶、淀粉酶、脂肪酶等）真 菌 1、真菌是生產(chǎn)工業(yè)酶制劑的主要資源（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶等）2、有機酸（檸檬酸、葡萄糖酸蘋果酸、抗壞

2、血酸等）3、核酸及其有關(guān)物質(zhì)4、維生素（核黃素、-胡蘿卜素）5、多糖酵 母 菌 1、酵母菌富含肌醇，維生素B1、B2、B6，尼克酸類胡蘿卜素等。2、蛋白質(zhì)與多肽（白地霉的蛋白質(zhì)含量為菌體量的50%左右，是良好的食品與飼料）3、核酸（酵母菌富含RNA2.67%-10.0%，DNA0.03%-0.516%，因此酵母是核酸工業(yè)的原料）開發(fā)生物新資源 1、動植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng) 利用動植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)產(chǎn)生生物藥品是細胞工程技術(shù)一大應用領(lǐng)域。 如用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)產(chǎn)生生物堿、甾類、糖甙、香料、色素、殺蟲劑； 如用動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)生物活性分子，如激素、免役淋巴細胞活素、單克隆抗體、各種疫苗。開發(fā)生物新資

3、源 2、應用基因重組技術(shù)建立“工程菌”或“工程細胞” 將所需要的基因在宿主細胞內(nèi)表達，制造各種生物活性物質(zhì)，是生物制藥工業(yè)的重要發(fā)展領(lǐng)域，尤其適合于含量低、活性高的一些微量物質(zhì)的生產(chǎn)。生物活性物質(zhì)的存在方式 生物活性物質(zhì)的存在方式與其生物功能 生物分子間的作用力生物活性物質(zhì)存在方式與其生物功能 從生物活性物質(zhì)的生物功能推斷其存在部位和分布方式 生物活性物質(zhì)分為“胞內(nèi)”與“胞外”兩種存在部位?！鞍狻蔽镔|(zhì)是由細胞產(chǎn)生，再釋放出來的，因此兩者沒有嚴格界限。 尿中的尿激酶是由腎細胞產(chǎn)生的；血中的-球蛋白來自-淋巴細胞；而合成酶類，代謝酶類遺傳物質(zhì)和代謝中間產(chǎn)物則存在于胞內(nèi),如DNA聚合酶,細胞色素C

4、等。生物活性物質(zhì)存在方式與其生物功能電子傳遞系統(tǒng)物質(zhì)包括黃素蛋白，細胞色素類以及糖類，脂肪酸合成、氧化和氧化磷酸化有關(guān)的酶系大部分存在于線粒體中。消化酶雖然可分泌到胞外，但難以從消化道進行收集，只能由相應的腺體提取分離，而且這些酶在細胞內(nèi)剛合成時常常是以無活性的酶原形式存在，提取時需要預先激活。細胞內(nèi)的生物活性物質(zhì)有些游離在胞漿中，有些結(jié)合于質(zhì)膜或器膜上，或存在于細胞器內(nèi)。因此，對于胞物質(zhì)的提取要先破碎細胞，對于膜上物質(zhì)則要選擇適當?shù)娜軇┦蛊鋸哪ど先芙庀聛?。生物分子間的作用力生物分子的基本骨架各原子與基團間都是共價結(jié)合,整個分子的一級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定.但分子間的連接主要是通過一些非共價鍵如氫鍵、金屬鍵

5、、范德華力、疏水力、堿基堆積力所維系，鍵的性質(zhì)差別較大，與生物分子的生物功能十分密切。生物分子的分離的原則：u在不損傷分子基本結(jié)構(gòu)前提下，采取不同方 法解離；u分離操作條件溫和，確保立體結(jié)構(gòu)不受破壞；生物活性物質(zhì)的存在特點 生物材料組成的復雜性 生物活性物質(zhì)存在的特點生物材料組成的復雜性 生物材料中化學組成十分復雜。不同生物含有不同種類的活性物質(zhì)同種生物，在細胞與細胞之間，組織與組織之間，由于細胞類型、年齡、分化程度的不同，都會改變活性物質(zhì)的組成。生物活性物質(zhì)存在的特點1、生物活性物質(zhì)在生物體材料中含量較低，雜質(zhì)含量很高，而且生理活性愈高的成分，含量往往愈低胰島素在胰臟中的含量約為萬分之二；脫

6、氧核糖核酸酶含量為十萬分之四；膽汁中膽紅素含量為萬分之5-8。 因此直接從生物材料生產(chǎn)含量極低的生物活性物質(zhì)沒有太大的工業(yè)價值。生物活性物質(zhì)存在的特點2、生物材料中的生化組成數(shù)量大，種類多u目的物與雜質(zhì)的理化性質(zhì)如溶解度，分子量，等電點等都十分接近，分離、純化較困難u純化過程中生物材料中有效成分的生理活性處于不斷變化中 可能被材料中自身的代謝酶所破壞，或為微生物所分解，還可能在制備過程中受到酸、堿、鹽、重金屬離子、機械攪拌、溫度等作用而改變其生理活性。 因此，整個操作過程要把防止目的物的失活作用放在首位。生物材料的準備 生物藥物的制造主要包括以下工藝過程： 生物材料的選取與預處理； 從生物材料

7、中提取有效活性物質(zhì)； 有效成分的分離，純化； 后處理及制劑生物材料的選取選取生物材料時需考慮其來源、價格、目的物含量，雜質(zhì)的種類，數(shù)量和性質(zhì)等1、有效成分的含量u生物品種 根據(jù)目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關(guān)鍵。 如制備催乳素，不選用禽類，魚類，微生物，應以哺乳動物為材料。u合適的組織器官 如制備胃蛋白酶只能選用胃為原料；免役球蛋白從血液或富含血液的胎盤組織提取；透明質(zhì)酸酶由睪丸提取等。u生物的生長期生物的生長期對生理活性物質(zhì)的含量影響很大。 如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃為材料，成年牛、羊胃不適用； 提取胸腺素應選用幼年動物胸腺為原料。同時，動物的營養(yǎng)狀況，產(chǎn)地、季

8、節(jié)對活性物質(zhì)的含量也有影響。選取生物材料時需考慮其來源、價格、目的物含量，雜質(zhì)的種類，數(shù)量和性質(zhì)等1、有效成分的含量u生物品種 根據(jù)目的物的分布，選擇富含有效成分的生物品種是選材的關(guān)鍵。 如制備催乳素，不選用禽類，魚類，微生物，應以哺乳動物為材料。u合適的組織器官 如制備胃蛋白酶只能選用胃為原料；免役球蛋白從血液或富含血液的胎盤組織提取；透明質(zhì)酸酶由睪丸提取等。u生物的生長期生物的生長期對生理活性物質(zhì)的含量影響很大。 如凝乳酶只能以哺乳期小牛、仔羊的第四胃為材料，成年牛、羊胃不適用； 提取胸腺素應選用幼年動物胸腺為原料。同時，動物的營養(yǎng)狀況，產(chǎn)地、季節(jié)對活性物質(zhì)的含量也有影響。選取生物材料時需

9、考慮其來源、價格、目的物含量，雜質(zhì)的種類，數(shù)量和性質(zhì)等1、有效成分的含量生物材料的選取2、雜質(zhì)情況難于分離的雜質(zhì)會增加工藝的復雜性，嚴重影響收率、質(zhì)量和經(jīng)濟效益。應避免與目的物性質(zhì)相似的雜質(zhì)對純化過程的干擾。如胰臟含有磷酸單脂酶和磷酸二脂酶，兩者難于分開，故不選用胰臟為原料制備磷酸單脂酶，而改用前列腺為原料，因它不含磷酸二脂酶，使操作較為簡化。2、雜質(zhì)情況難于分離的雜質(zhì)會增加工藝的復雜性，嚴重影響收率、質(zhì)量和經(jīng)濟效益。應避免與目的物性質(zhì)相似的雜質(zhì)對純化過程的干擾。生物材料的選取3、來源應選用來源豐富的材料，盡量不與其他產(chǎn)品爭原料，最好一物多用，即綜合利用。如用胰臟生產(chǎn)彈性蛋白酶和激肽釋放酶，胰

10、島素與胰酶等；用人胎盤生產(chǎn)-球蛋白，胎盤脂多糖及胎盤水解物；用人尿生產(chǎn)尿激酶、HCG等生物材料的采集與保存生物活性物質(zhì)易矢活與降解，因此1、采集時必須保持材料的新鮮。防止腐敗、變質(zhì)與微生物污染 如胰臟采摘后要及時，防止胰島素活力下降；膽汁不可在空氣中久置，以防止膽紅素氧化；酶原提取要及時，防止酶原激活轉(zhuǎn)變?yōu)槊干锊牧系牟杉c保存2、生物材料的采摘必須快速、及時速凍，低溫保存3、選取材料要求完整，盡量不帶入無用組織4、符合衛(wèi)生要求，不可污染生物及其他有害物質(zhì)生物材料的采集與保存生物材料的保存方法：u速凍u凍干u有機溶劑脫水u制成“丙酮粉”u浸存于丙酮與甘油中生物材料的采集與保存動物細胞的培養(yǎng)與保

11、存動物細胞培養(yǎng)技術(shù)是1907年R.G帕拉遜在試管內(nèi)對蛙的神經(jīng)組織培養(yǎng)成功后建立的后來陸續(xù)成功培養(yǎng)了哺乳動物、昆蟲、魚類等各種動物細胞。利用培養(yǎng)的細胞生產(chǎn)疫苗、干擾素、尿激酶、促紅細胞生成素和單克隆抗體等已進入工業(yè)化生產(chǎn)動物細胞的培養(yǎng)與保存動物細胞制藥:由于動物細胞培養(yǎng)（animal cell culture)在規(guī)模和可靠性方面都不斷發(fā)展，而且從中得到的蛋白質(zhì)也被證明是安全有效的，因此人們對動物細胞培養(yǎng)的態(tài)度已經(jīng)發(fā)生了改變。實際上，對于一些人用和獸用的重要蛋白質(zhì)藥物，尤其是那些相對較大、較復雜或糖基化（glycosylated)的蛋白質(zhì)來說，動物細胞培養(yǎng)是首選的生產(chǎn)方式。動物細胞的培養(yǎng)與保存動物

12、細胞的生長培養(yǎng)液：u平衡鹽溶液u天然培養(yǎng)基u合成培養(yǎng)液動物細胞的培養(yǎng)與保存u平衡鹽溶液1、具有維持滲透壓，控制酸堿平衡作用2、供給細胞生存所需要的能量和離子3、是配置各種培養(yǎng)基的基礎溶液 常用的有Hanks平衡鹽溶液 及Earle平衡鹽溶液動物細胞的培養(yǎng)與保存u天然培養(yǎng)基1、有血漿、鼠尾膠原、雞胚浸出液、血清等；2、該培養(yǎng)基營養(yǎng)成分高，成分復雜，來源受限制動物細胞的培養(yǎng)與保存u合成培養(yǎng)基 是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬配方組成1、如199培養(yǎng)液，Eagle培養(yǎng)液，DMEM培養(yǎng)液，F(xiàn)12培養(yǎng)液，RPM1640等；2、只能維持動物細胞的生存；3、要使細胞繁殖，還要補充適量天然培養(yǎng)基，常用的

13、是人血清或牛血清，尤其是同源血清效果更好；動物細胞的培養(yǎng)與保存u合成培養(yǎng)基 是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學物質(zhì)模擬配方組成4、血清對細胞附著和保護有明顯作用，且能中和毒物，使細胞不受損害；5、但血清中含有600多種蛋白質(zhì)，給產(chǎn)物分離、純化增加了困難，也提高了成本，因此目前正在轉(zhuǎn)向使用人工無血清培養(yǎng)基用于制藥的動物細胞1、由動物細胞表達和合成的蛋白質(zhì)具有正確的氨基酸序列；2、在加工過程中還能以正確的方式進行折疊和修飾，且大多數(shù)能以天然形式分泌到培養(yǎng)基中，從而確保了所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)具有與天然產(chǎn)物一致的生物活性、免疫原性和體內(nèi)壽命；3、這些特點使得動物細胞成為表達和生產(chǎn)基因工程抗體、蛋白質(zhì)疫苗和治療藥

14、物等生物產(chǎn)品的理想宿主。用于制藥的動物細胞常用的細胞系包括CHO（Chinese hamster ovary)，MRC-5人淋巴母細胞，BHK，鼠雜交瘤細胞（hybridoma cell)系，重組NS0，SP2/0，F(xiàn)Rhl-2，BIRMA-1細胞系，BL-2細胞，ES-15ES-4細胞系，MS201細胞系等。動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)大規(guī)模哺乳動物細胞培養(yǎng)（animal cell culture）的主要障礙： 供氧限制 副產(chǎn)物積累 更加智能化的過程控制 動物細胞對機械剪切力的極度敏感 培養(yǎng)貼壁細胞系動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)u由于貼壁型細胞系放大存在困難，所以許多產(chǎn)品現(xiàn)在使用懸浮培養(yǎng)細胞系，包括懸浮適應

15、的CHO細胞系或鼠骨髓瘤細胞。u通過恰當?shù)姆磻髟O計或加入保護劑如Pluromic F68，可將攪拌和通氣造成的機械剪切損傷減至最小懸 浮 培 養(yǎng)動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)u由于貼壁型細胞系放大存在困難，所以許多產(chǎn)品現(xiàn)在使用懸浮培養(yǎng)細胞系，包括懸浮適應的CHO細胞系或鼠骨髓瘤細胞。u通過恰當?shù)姆磻髟O計或加入保護劑如Pluromic F68，可將攪拌和通氣造成的機械剪切損傷減至最小懸 浮 培 養(yǎng)動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)u可以通過設計更加智能化的灌流補 料系統(tǒng)（不斷除去代謝廢物），或 使用Lonza設計的谷氨酰胺合成酶表 達系統(tǒng)（降低了代謝廢物的形成）， 來減少代謝副產(chǎn)物的積累。懸 浮 培 養(yǎng)動物細胞的大

16、規(guī)模培養(yǎng)貼 壁 培 養(yǎng)貼壁培養(yǎng)在工業(yè)放大上存在其特有的問題：因為貼壁細胞有貼壁需求，為了得到最大的細胞密度，反應器的比表面積就需要最大化。培養(yǎng)方式的選擇 究竟選擇何種培養(yǎng)方式進行放大生產(chǎn)，要以產(chǎn)品和市場為導向進行選擇。當然，懸浮培養(yǎng)具有易放大的特點，可以按照1：5的放大速率是迅速達到10000L的規(guī)模，設備具有一定的通用性：但貼壁培養(yǎng)更容易達到高密度培養(yǎng)。動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)培養(yǎng)方式的選擇 有的產(chǎn)品如凝血因子在培養(yǎng)液中極不穩(wěn)定，只能采用灌流培養(yǎng)方式進行生產(chǎn)； 而有的產(chǎn)品，如抗體，相對較為穩(wěn)定，就可以采取批式培養(yǎng)。對于市場就可以滿足要求，如Amgen的thEPO動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng) 在選擇培養(yǎng)方

17、式之前，除了考察目的產(chǎn)物的性質(zhì)之外，宿主細胞的特性也是決定性的因素之一。CHO細胞也可經(jīng)過有目的的馴化，改變原來貼壁、依賴血清的生長特性，可以在無蛋白培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)而不改變目的產(chǎn)物的單細胞產(chǎn)率。培養(yǎng)方式的選擇動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)發(fā)酵過程的控制 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素很多，除了攪拌、溶氧、pH、溫度等因素的影響之外，如何控制細胞的代謝，減少有害廢物如乳酸及氨在發(fā)酵液中的積累，成為動物細胞發(fā) 酵專家的課題。動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)化學限定培養(yǎng)基的開發(fā) 開發(fā)無血清培養(yǎng)基的主要目的是用成分明確的新材料來替代不確定的血清成分，而又能保留血清的基本功能。但是，許多血清替代物仍面臨與血清同樣的問題。

18、動物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的保存保 存 方 法v組織塊保存法v組織懸浮保存法v單層細胞保存法v低溫冷凍保存組織塊保存法如人胚胎腎塊在40C可保存2周，具體方法是取出新生胎兒腎臟剪成小塊，洗滌后加生長培養(yǎng)液，于40C過夜，換液一次，可置冰箱保存。動物細胞的保存組織懸浮保存法如用胰蛋白酶分散的新鮮猴腎細胞懸浮液，40C保存1024小時后，離心收集細胞，用新鮮生長培養(yǎng)液再懸浮，于40C至少可保存3周。動物細胞的保存單層細胞保存法本法是通過降低溫度來延長細胞的正常代謝時間。如人羊膜細胞280C可保存1個月，人二倍體細胞300C可保存2周，中間換液可保存1個月。動物細胞的保存低溫冰凍保存法將細胞凍存于

19、700C低溫冰箱中或液氮中，再低溫冰箱中可凍存1年以上 ， 在 液 氮 中 可 長 期 保 存 。v細胞凍存速度v保存劑v凍結(jié)方法v凍存細胞的復蘇動物細胞的保存低溫冰凍保存法微生物菌種的選育與保存1、菌種的分離微生物種類繁多，易于培養(yǎng)，是工業(yè)化生產(chǎn)各種生物藥物的主要材料。v含菌樣品的收集v富集培養(yǎng)v菌種的純化微生物菌種的選育與保存1、菌種的分離微生物菌種的選育與保存含菌樣品的收集根據(jù)微生物的生態(tài)特點，從自然界取樣，分離所需菌種。v如到堆積和腐爛纖維素的地方取樣分離纖維素酶產(chǎn)生菌；v到溫泉附近取樣分離高溫蛋白酶產(chǎn)生菌；微生物菌種的選育與保存富集培養(yǎng)收集到的樣品若含所需要的菌較多，可直接分離；若含

20、所需要的菌很少，就需要進行富集培養(yǎng)。v通過富集培養(yǎng)，使所需的菌大量生長，以利篩選；v同時控制溫度，pH或營養(yǎng)成分即可；微生物菌種的選育與保存菌種純化在自然條件下，各種類型的菌混雜在一起生活，需要進行分離，以獲得的純種。v稀釋分離法；v劃線分離法；微生物菌種的選育與保存2、菌種的篩選v篩選對象的選擇v培養(yǎng)方式的確定微生物菌種的選育與保存篩選對象的選擇篩選前，先要考慮哪些微生物是篩選的對象。v如有報道，則可根據(jù)文獻收集可能性最大的微生物進行篩選；v如無報道，則可根據(jù)一般常識，以不同的種屬代表，先進行廣泛比較。微生物菌種的選育與保存培養(yǎng)方式的確定v固體培養(yǎng) 常用麩皮、稻末、米糠等農(nóng)副產(chǎn)品作為營養(yǎng)源，

21、加少量水，制成固體培養(yǎng)基，接種猴在適合的溫度下培養(yǎng)，使菌生長，并形成所需的活性物質(zhì)。v液體培養(yǎng) 用三角瓶裝適量的液體培養(yǎng)基，接種后，在搖床上震蕩培養(yǎng)一定時間。此條件與發(fā)酵罐相似，篩出的菌種適合于發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)。微生物菌種的選育與保存隨機選擇法一般程序： 采用誘變劑誘變處理微生物，增殖培養(yǎng)，經(jīng)過稀釋涂布，隨機選擇部分或全部單菌落，逐個測定他們的生物活性，最后挑出產(chǎn)量或其他性能比親代菌株優(yōu)秀的突變株。v常用的誘變劑有堿基類似物 5-溴尿嘧啶，5-溴脫氧尿苷，羥氨，亞硝酸，烷化劑，紫外線照射，電離輻射。微生物菌種的選育與保存一般從兩方面考慮：v根據(jù)環(huán)境因素考慮添加誘導物核降低阻遏物濃度；v從遺傳學角

22、度考慮將生產(chǎn)菌種誘發(fā)突變成為組成型和增加基因拷貝的途徑來達到分離高產(chǎn)菌株的目的根據(jù)代謝的調(diào)節(jié)機理選擇高產(chǎn)突變株微生物菌種的選育與保存3、菌種的選育無論抗生素、氨基酸、核苷酸或酶制劑的發(fā)酵生產(chǎn)，從自然界直接分離菌種，都不能立即適應實際生產(chǎn)需要。只有通過誘變，選育才能使產(chǎn)量成倍，成百倍地提高。v隨機選擇法v根據(jù)代謝的調(diào)節(jié)機理選擇高產(chǎn)突變株。微生物菌種的選育與保存4、菌種的保藏v菌種的退化和防止 退化隨時間的推移菌種的一個或多個特性逐步減退或消失，最終導致營養(yǎng)細胞的死亡，一般把菌株的生活力，產(chǎn)孢子能力的衰退和特殊產(chǎn)物產(chǎn)量的下降統(tǒng)稱為退化。菌種退化現(xiàn)象的綜合比較鑒別：v單位容積中發(fā)酵液的活性物質(zhì)含量；

23、v瓊脂平皿上的單菌落形態(tài)；v不同培養(yǎng)時期菌體細胞的形態(tài)和主要遺傳特征；v發(fā)酵過程的pH變動情況；v發(fā)酵液的氣味、色澤微生物菌種的選育與保存菌種退化的防止v防止基因突變基因突變是菌種退化的一個重要原因，減少突變是防止退化的重要措施，應用低溫保藏法可以減少突變的發(fā)生微生物菌種的選育與保存菌種退化的防止v采用雙重缺陷型利用營養(yǎng)缺陷型作為生產(chǎn)菌株時，回復突變可導致產(chǎn)量下降，采用雙重缺陷標志可間接而有效地防止突變微生物菌種的選育與保存菌種退化的防止v制定科學管理制度使用菌種時大批制作平行的菌種斜面，少轉(zhuǎn)接傳代微生物菌種的選育與保存菌種退化的防止v分離單菌落在建立新菌株和使用過程中認真進行單菌落分離，再多

24、制作平行的菌種斜面微生物菌種的選育與保存菌種退化的防止v選擇培養(yǎng)條件選擇有利高產(chǎn)菌株（或其他有利性狀）而不利于低產(chǎn)菌株（或其他不利性狀）的培養(yǎng)條件微生物菌種的選育與保存常用的菌種保藏方法保藏方法的原則：v使菌種不死亡v使菌種的原有特性不變斜面保存法礦油法冷凍干燥法組織與細胞的破碎2、化學法用稀酸、稀堿、濃鹽、有機溶劑或表面活性劑（如膽酸鹽、氯化十二烷基吡啶）處理細胞，可破壞細胞結(jié)構(gòu)釋放出內(nèi)容物組織與細胞的破碎3、生物法v組織自溶法 利用組織中自身酶的作用改變、破壞細胞結(jié)構(gòu)，釋放出目的物稱為自溶。自溶過程酶原被激活為酶既便于提取又提高了效率，但不適用于易受酶降解的目的物的提取組織與細胞的破碎3、

25、生物法v酶解法用外來酶處理生物材料如用溶菌酶處理某些細菌；用胰酶處理豬腦生產(chǎn)腦安泰；用作專一性分解的酶還有：細菌蛋白酶、纖維素酶、蝸牛酶、酯酶等組織與細胞的破碎3、生物法v噬菌體法 用噬菌體感染細菌、裂解細胞，釋放出內(nèi)容物組織與細胞的破碎1、物理方法v磨切法v壓力法壓榨、高壓、減壓v震蕩法超聲波震蕩破碎細的菌細胞，頻率 10200kHz，該法產(chǎn)熱較多，注意冷卻細胞器的分離為獲得結(jié)合在細胞器上的一些生化成分或酶系，常常要先得到特定的細胞器再進一步分離有效成分，所得細胞器的含量和純度可用電鏡觀察。勻漿破碎細胞離心分離細胞器的分離差速離心分離各種細胞器勻漿700g10 分0.34mol/L蔗糖上清沉

26、淀（細胞核、膜碎片）8500g10 分8500g10 分上清沉淀（線粒體、溶酶體）上清（細胞質(zhì)可溶性成分）沉淀（微粒體）第 二節(jié) 生物活性物質(zhì)的提取 提取 是利用制備目的物的溶解特性，將目的物與細胞的固形成分或其他結(jié)合成分分離，使其由固相轉(zhuǎn)入液相或從細胞內(nèi)的生理狀態(tài)轉(zhuǎn)入特定溶液環(huán)境的過程。一、物質(zhì)的性質(zhì)與提取浸漬用冷溶劑溶出固體材料中的物質(zhì)浸煮用熱溶劑溶出目的物液-液提取將目的物從某一溶劑系統(tǒng)轉(zhuǎn) 入另一溶劑系統(tǒng)提取的分類物質(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇要取得好的提取效果，最重要的是要針對生物材料和目的物的性質(zhì)選擇合適的溶劑系統(tǒng)與提取條件。溶解性質(zhì)、分子量、等電點、存在方式、穩(wěn)定性、比重、粒度、粘度、

27、目的物含量，主要雜志種類及溶解性質(zhì)，有關(guān)酶類的特征等。 其中，最主要的是目的物與主要雜質(zhì)在溶解度方面的差異以及它們的穩(wěn)定性生物材料及其目的物與提取有關(guān)的一些性狀：物質(zhì)的性質(zhì)與提取方法的選擇v對酶類藥物提取要防止輔酶的丟失和其他失活因素的干擾；v對蛋白質(zhì)類藥物要防止其高級結(jié)構(gòu)的破壞，即變性作用，應避免高熱，強烈攪拌，大量泡沫，強酸、堿及重金屬離子的作用；v多肽類及核酸類藥物需注意避免酶的降解作用，提取過程應在低溫并添加某些酶抑制劑；v對脂類藥物應特別注意防止氧化，減少與空氣的接觸，如添加抗氧化劑，通氮氣及避光等。提取過程中的一些注意事項：活性物質(zhì)的保護措施v采用緩沖系統(tǒng) 防止提取過程重某些酸堿基

28、團的解離導致溶液pH值的大幅度變化，使某些活性物質(zhì)變性失活或因pH變化影響提取效果對于一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護措施：磷酸鹽緩沖液，檸檬酸緩沖液，Tris緩沖液，醋酸緩沖液，硼酸緩沖液等活性物質(zhì)的保護措施v添加保護劑 防止某些生理活性物質(zhì)的活性基團及酶的活性中心受破壞。對于一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護措施：如巰基是許多活性蛋白質(zhì)和酶的催化活性基團，極易被氧化，故提取時，常添加某些還原劑，如半胱氨酸，-巰基乙醇，還原型谷胱甘肽等。提取某些酶時常加入適量底物以保護活性中心活性物質(zhì)的保護措施v抑制水解酶的作用 抑制水解酶對目的物的作用是提取操作中

29、的最重要保護性措施之一，可根據(jù)不同水解酶的性質(zhì)采用不同方法。對于一些生物大分子，如蛋白質(zhì)、酶及核酸類藥物常采用下列保護措施：如需要金屬離子激活的水解酶（如DNAse）常加入EDTA或用檸檬酸緩沖液，以降低或除去金屬離子使酶活力受到抑制。二、物質(zhì)的性質(zhì)與溶解度 是固相分子間的相互作用及固-液兩相分子間兩種作用力綜合平衡的結(jié)果，前者是“阻力”后者是“助力”。溶解度溶劑的選擇原則是減少“阻力”，增加“助力”。即最大限度地削弱生物分子間的作用力，盡可能地增加目的分子與溶劑分子間的相互作用力物質(zhì)溶解度的一般規(guī)律其涵義是相似物溶解于相似物v溶質(zhì)與溶劑分子結(jié)構(gòu)上的相似；v溶劑與溶質(zhì)分子間的作用力相似?！跋嗨?/p>

30、相溶”原則水在生化物質(zhì)提取中的作用v水是高度極化的極性分子，具有很高的介電常數(shù)；v在水溶液中，水分子自身形成氫鍵的趨勢很強，有極高的分子內(nèi)聚力；v水分的存在可使其他生物分子間的氫鍵減弱，而與水分子形成氫鍵；水是提取生化物質(zhì)的常用溶劑v水合作用水分子使溶質(zhì)分子的離子鍵解離，可促使蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子與水形成了水合分子或水合離子從而促使它們?nèi)芙庥谒蛩芤褐?。三、提取效?無論采用什麼巧妙的提取方法，在生物材料中總要殘留部分目的物，殘留量的多少取決于所選擇的溶劑系統(tǒng)的種類、用量、提取次數(shù)以及操作條件。四、影響提取的因素 1、溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度隨提取溫度的升高而增加，而且較高的溫度可以降

31、低物料的粘度，有利于分子擴散和機械攪拌。應用有機溶劑提取生化成分時，一般在較低的溫度下進行提取，一方面是為了減少溶劑揮發(fā)損失和生產(chǎn)安全；另一方面是為了減少活力損失。三、提取效率 殘留量公式：Xn=X0KW/(KW+L)X0 目的物的總量，gK目的物 的固相/液相的分配系數(shù)L溶劑體積，mLW生物材料重量，gn提取次數(shù)2、酸 堿 度多數(shù)生化物質(zhì)在中性條件下甲穩(wěn)定，所以提取用的溶劑系統(tǒng)原則上應避免過酸或過堿，pH值一般應控制在49范圍內(nèi)。為了避免目的物的溶解度，往往要避免在目的物的等電點附近進行提取。3、鹽 濃 度鹽離子存在能減弱生物分子間離子鍵及氫鍵的作用力，稀鹽溶液對蛋白質(zhì)等生物大分子有助溶作用

32、，這是由于鹽離子作用于生物大分子表面，增加了表面電荷，使之極性增加，水合作用增強，促使形成穩(wěn)定的雙電層，此現(xiàn)象稱為“鹽溶”。氯化鈉溶液，磷酸鹽緩沖液，焦磷酸鈉緩沖液，醋酸緩沖液，檸檬酸緩沖液。五、提取方法 1、用酸、堿、鹽水溶液提取用酸、堿、鹽水溶液可以提取各種水溶性、鹽溶性的生化物質(zhì)。這類溶劑提供了一定的離子強度，pH值及相當?shù)木彌_能力。提 取 方 法2、用表面活性劑提取表面活性劑分子兼有親水和疏水基團，在分布于水-油界面時有分散、乳化和增溶作用。表面活性劑又稱“去垢劑”。表面活性劑可分為陰離子型，陽離子型，中性與非離子型去垢劑。離子型表面活性劑作用強，但易引起蛋白質(zhì)等生物大分子的變性，非離

33、子表面活性劑變性作用小，適合于用水，鹽系統(tǒng)無法提取的蛋白質(zhì)活酶的提取。提 取 方 法3、有機溶劑提取用有機溶劑提取生化物質(zhì)可分為：v固-液提取v液-液提?。ㄝ腿。┨?取 方 法3、有機溶劑提取v固-液提取 常用于水不溶性的脂類、脂蛋白、膜蛋白結(jié)合酶等常用的有機溶劑有：甲醇乙醇、丙酮、丁醇等極性溶劑以及乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。選用有機溶劑的原則：相似相溶提 取 方 法3、有機溶劑提取v液-液萃取 是利用溶質(zhì)在兩個互不混溶的溶劑中溶解度的差異將溶質(zhì)從一個溶劑相向另一個溶劑相轉(zhuǎn)移的操作。影響液-液萃取的因素主要有：目的物在兩相的分配比（分配系數(shù)K）有機溶劑用量提 取 方 法3、有機溶劑提取液-液

34、萃取時溶劑的選擇要注意以下幾點：選用溶劑必須具有較高選擇性，各種溶質(zhì)在所選的溶劑中之分配系數(shù)差異越大越好；在萃取后，溶質(zhì)與溶劑要容易分離與回收；兩種溶劑的密度相差不大時，易形成乳化，不利于萃取液的分離；要選用無毒，不易燃燒的價廉易得的溶劑第 三節(jié) 生物活性物質(zhì)的濃縮與干燥一、生物活性物質(zhì)的濃縮v蒸發(fā)蒸發(fā)v減壓濃縮減壓濃縮v鹽析濃縮鹽析濃縮v有機溶劑沉淀濃縮有機溶劑沉淀濃縮v用葡聚糖凝膠（用葡聚糖凝膠（Sephadex）濃縮）濃縮v用聚乙二醇濃縮用聚乙二醇濃縮v超濾濃縮超濾濃縮v真空減壓濃縮與薄膜濃縮真空減壓濃縮與薄膜濃縮生物活性物質(zhì)的濃縮2、有機溶劑沉淀濃縮在生物大分子的水溶液中，逐漸加入乙醇

35、，丙酮等有機溶劑，可以使生物物質(zhì)的溶解明顯降低，從溶液中沉淀出來，這也是濃縮樣品的常用方法。其優(yōu)點：溶劑易于回收，樣品不必透析除鹽在低溫操作下，對多種生物大分子較為穩(wěn)定生物活性物質(zhì)的濃縮3、用葡聚糖凝膠(Sephadex）濃縮向1L左右的稀樣品溶液中，加入固體的干葡聚糖凝膠G-25，緩慢攪拌30分鐘，葡聚糖凝膠吸水膨脹，進行吸濾，生物大分子全部留在溶液中，如此重復數(shù)次，可在短時間內(nèi)使溶液濃縮到100mL。生物活性物質(zhì)的濃縮1、鹽析濃縮用添加中性鹽的方法來使某些蛋白質(zhì)（或酶）從稀溶液中沉淀出來，從而達到樣品濃縮目的。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度是由蛋白質(zhì)周圍親水基團與水形成水化膜的程度，以及蛋白質(zhì)分

36、子帶有電荷的情況決定的。當用中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液，中性鹽對水分子的親和力大于蛋白質(zhì)，于是蛋白質(zhì)分子周圍的水化膜層減弱乃至消失。同時，中性鹽加入蛋白質(zhì)溶液后，由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質(zhì)表面電荷大量被中和，更加導致蛋白溶解度降低，使蛋白質(zhì)分子之間聚集而沉淀。常用的中性鹽有：硫酸銨，硫酸鈉，硫酸鎂，硫酸鉀生物活性物質(zhì)的濃縮4、用聚乙二醇濃縮將待濃縮液放入透析袋，袋外敷以聚乙二醇，袋內(nèi)的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在極短的時間內(nèi)，可以濃縮幾十倍至上百倍。生物活性物質(zhì)的濃縮5、超濾濃縮應用不同型號超濾膜濃縮不同分子量的生物大分子。超濾濃縮有：固定末端式系統(tǒng)，攪拌式系統(tǒng)，管狀流動式系統(tǒng)，細管流式系統(tǒng)

37、生物活性物質(zhì)的濃縮6、真空減壓濃縮與薄膜濃縮v真空減壓濃縮在生物藥物生產(chǎn)中使用較為普遍，具有生產(chǎn)規(guī)模較大，蒸發(fā)溫度較低，蒸發(fā)速度較快等優(yōu)點。濃縮目的：除去揮發(fā)性溶劑，保持物料的 生物活性。二、生物活性物質(zhì)的干燥干燥是使物質(zhì)從固體或半固體狀經(jīng)除去存在的水分內(nèi)或它種溶劑，從而獲得干燥物品的過程。干燥的目的：提高藥物或藥劑的穩(wěn)定性，以利保存與運輸；使藥物或藥劑有一定的規(guī)格標準；便于進一步處理生物活性物質(zhì)的干燥水分在干燥的物料中，有三種存在形式v表面水v毛細管中的水v細胞內(nèi)的水水分在固體物料中的存在形式可能是單一的，也可能是多樣的。因此，干燥應緩慢進行，使各種形式的水能被逐步去除。生物活性物質(zhì)的干燥常

38、用的干燥法有：v減壓干燥v噴霧干燥v冷凍干燥第 四節(jié) 生物物質(zhì)的分離純化方法一、生物制藥中分離、制備方法的特點二、生物制藥中分離制備方法的基本原理三、分離純化的基本程序和實驗設計四、分離純化方法步驟優(yōu)劣的綜合評價五、制備物均一性的鑒定一、生物制藥中分離、制備方法的特點生化分離技術(shù)包括：v生化分離分析v生化制備v生化分離分析主要對生物體內(nèi)各組分加以分離后進行定性、定量鑒定，它不一定要把某組分從混合物中分離提取出來；v生化制備主要是為了獲得生物體內(nèi)某一單純組分。生物制藥中分離、制備方法的特點生化制藥中分離、制備方法有下列特點：1、生物材料組成非常復雜；一種生物材料常含有成千上萬中成分，各種化合物的

39、形狀、大小、分子量和理化性質(zhì)都各不相同；不少化合物迄今未知；生物活性物質(zhì)在分離進程中仍處于不斷代謝變化中，因此，常無固定操作方法。生物制藥中分離、制備方法的特點4、生物制藥中的分離方法幾乎都在溶液中進行，各種參數(shù)（溫度、pH、離子強度等）對溶液中各種組分的綜合影響常無法固定，以致許多實驗設計理論性不強。很多實驗結(jié)果常帶有很大的經(jīng)驗成分，因此，要使實驗獲得重復，從材料、方法、條件及試劑藥品等都必須嚴格地加以規(guī)定。生物制藥中分離、制備方法的特點2、有些化合物在生物材料中含量極微，因此分離操作步驟多，不易獲得高收率；3、生物活性成分離開生物體后，易變性，破壞，分離進程必須十分小心地保護這些化合物的生

40、理活性，這也是生物制藥中分離、制備的難點；生物制藥中分離、制備方法的特點6、生物產(chǎn)品最后均一性的證明與化學上純度的概念不完全相同因生物分子對環(huán)境反應十分敏感，結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系比較復雜，故對其均一性的評估常常是有條件的，或者只能通過不同角度測定，最后才能給出相對“均一性”的結(jié)論。二、生物制藥中分離制備方法的基本原理生化制藥中的分離制備技術(shù)大都根據(jù)混合物中不同組分分配率的差別，把他們分配于可用機械方法分離的兩個或幾個物相中（如有機溶劑抽提、鹽析、結(jié)晶等）。或者將混合物置于某一物相（大多數(shù)是液相）中，外加一定作用力，使多組分分配于不同區(qū)域，從而達到分離目的（如電泳、超離心、超濾等）生物制藥中分離、制備

41、方法的特點5、為了保護目的物的生理活性及結(jié)構(gòu)上的完整性，生物制藥中分離方法多采用溫和的“多階式”方法進行，即“逐級分離”為了純化一種生化物質(zhì)常常要聯(lián)用幾個，甚至十幾個步驟，并不斷變換各種不同類型的分離方法，才能達到目的。二、生物制藥中分離制備方法的基本原理生物大分子分離純化的主要原理：1、根據(jù)分子形狀和大小不同進行分離。如差速離心，超速離心，膜分離（透析，電滲析）與超濾法，凝膠過濾法；2、根據(jù)分子電離性質(zhì)（帶電性）的差異進行分離。如離子交換法，電泳法，等電聚焦法；二、生物制藥中分離制備方法的基本原理3、根據(jù)分子極性大小及溶解度不同進行分離。如溶劑提取法，逆流分配法，分配層析法，鹽析法，等電點沉

42、淀法；4、根據(jù)物質(zhì)吸附性質(zhì)的不同進行分離。如選擇性吸附與吸附層析法；5、根據(jù)配體特異性進行分離親和層析法。三、分離純化的基本程序和實驗設計對于生物體內(nèi)某一組分，特別是未知結(jié)構(gòu)的組分的分離制備設計大致可分為五個基本階段：v確定制備物的研究目的及建立相應的分析鑒定方法；v制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預備實驗；v材料處理及抽體方法的選擇；v分離純化方法的摸索；v產(chǎn)品的均一性測定。三、分離純化的基本程序和實驗設計分離純化是生化制備的核心操作。由于生化物質(zhì)種類成千上萬，因此分離純化的實驗方案也千變?nèi)f化，沒有一種分離純化方法可適用于所有物質(zhì)的分離純化，同時一種物質(zhì)也不可能只有一種分離純化方法。三、分離純化的基

43、本程序和實驗設計1、分離純化早期使用方法的選擇選擇原則是： 從低分辨能力到高分辨能力，而且負荷量較大者為合適。三、分離純化的基本程序和實驗設計2、各種分離純化方法的使用程序v生化物質(zhì)的分離都是在液相中進行，故分離方法主要根據(jù)物質(zhì)的分配系數(shù)，分子量大小，離子電荷性質(zhì)及數(shù)量和外加環(huán)境條件的差別等因素為基礎；v安排純化順序時，還要考慮有利于減少工序，提高效率；v對于一未知物通過各種方法的交叉應用，有助于進一步了解目的物的性質(zhì)。三、分離純化的基本程序和實驗設計3、分離后期的保護性措施v必需注意避免產(chǎn)品的損失；v為了取得足夠量的樣品，需要加大原材料的用量。五、制備物均一性的鑒定均一性： 是指所獲得的制備

44、物只具有一種完全相同的成分。v均一性的評價常須經(jīng)過數(shù)種方法的驗證才能肯定。v生物分子純度鑒定方法很多，常用的有：溶解度法，化學組成分析法，電泳法，免疫學方法，離心沉降分析法，各種色譜法，生物功能測定法，以及質(zhì)譜法等四、分離純化方法步驟優(yōu)劣的綜合評價v分辨能力v重現(xiàn)性v方法本身回收率v對每一步驟方法的優(yōu)劣記錄，體現(xiàn)在所得產(chǎn)品重量及活性平衡關(guān)系上第 五節(jié) 生物制藥中試放大工藝設計一、生物制藥中試放大工藝特點二、中試放大方法與內(nèi)容一、生物制藥中試放大工藝特點v收率穩(wěn)定，質(zhì)量可靠；v操作條件已經(jīng)確定；產(chǎn)品，中間體及原料的分析方法已經(jīng)制定；v生物材料的資源（包括菌種，細胞株等）已確定并已系統(tǒng)鑒定；v進行

45、過物料平衡，“三廢”問題已有初步的處理方法；v提出中試規(guī)模及所需材料的規(guī)格和數(shù)量；v提出安全生產(chǎn)的要求一、生物制藥中試放大工藝特點在考察工藝條件的研究階段中，必須注意和解決下列問題：v原輔材料規(guī)格的過渡試驗v設備選型與材料質(zhì)量試驗v反應條件限度試驗v原輔材料，中間體及產(chǎn)品質(zhì)量分析方法研究v下游工藝的研究二、中試放大方法與內(nèi)容中試放大方法：v經(jīng)驗放大法v相似放大法v數(shù)學模型放大法v經(jīng)驗放大法主要是借經(jīng)驗通過逐級放大（實驗裝置，中間裝置，中型裝置和大型裝置）來摸索反應器的特征。 制藥工藝研究中試放大主要采用經(jīng)驗放大法，這是化工科研中采用的主要方法。二、中試放大方法與內(nèi)容中試放大的研究內(nèi)容主要有：v

46、工藝路線與各步反應方法的最后確定v設備材質(zhì)與型號的選擇v反應器的規(guī)模選擇及反應器攪拌器型式與攪拌速度的考察v生產(chǎn)反應條件的研究v工藝流程與操作方法的確定二、中試放大方法與內(nèi)容中試放大的研究內(nèi)容主要有：v物料衡算v安全生產(chǎn)與“三廢”防治措施研究v原輔材料，中間體的物理性質(zhì)和化工常數(shù)的測定v原輔材料，中間體質(zhì)量標準的制定v消耗定額，原料成本，操作工時與生產(chǎn)周期等的計算第 六節(jié) 生物制藥工藝技術(shù)的發(fā)展一、生物制藥工藝的發(fā)展二、生物藥物制劑工藝的發(fā)展生物制藥工藝的發(fā)展一、生物藥物類型與品種的發(fā)展v生化藥物1、治療酶與診斷用酶u超氧化物歧化酶（SOD）豬、牛、馬SOD已投放市場u凝血酶由人、牛、豬血或兔腦提取分離，也可由酵母、細菌產(chǎn)生uL-天冬酰胺酶由大腸桿菌，粘質(zhì)賽氏桿菌產(chǎn)生u尿激酶由人尿提取