實驗三紅細胞計數(shù)血紅蛋白測定及白細胞分類計數(shù)上課用

1、1 紅細胞計數(shù)、血紅蛋白測定及白細胞分類計數(shù)2紅細胞計數(shù)（一）原理用等滲稀釋液將血液稀釋并充入計數(shù)池后，于顯微鏡下計數(shù)。（二）試劑與器材Hayem液（氯化高汞、氯化鈉、結(jié)晶硫酸鈉）血細胞計數(shù)板3（三）操作 2ml稀釋液+10ul血液，洗滌，振蕩，混勻，充池，高倍鏡計數(shù)中央大方格周圍四個及中央五個中方格內(nèi)細胞總數(shù)。45（四）計算細胞數(shù)/525 10 200 106 =細胞數(shù)/100 1012/L（五）質(zhì)量保證1.取血部位不當; 2.稀釋倍數(shù)不準3.血液凝固; 4.混合不均勻，充液不當5.白細胞的影響6.血漿自身凝集素或球蛋白過高，紅細胞易聚集。6（六）臨床意義1、增多（1）相對性增多（2）絕對性

2、增多（3）真性紅細胞增多癥2、減少（1）造血物質(zhì)減少 （2）紅細胞破壞過多（3）紅細胞丟失過多（4）骨髓造血功能衰竭3、紅細胞計數(shù)和血紅蛋白測定的關(guān)系7二、血紅蛋白測定（HiCN法）（一）原理w血細胞經(jīng)血紅蛋白轉(zhuǎn)化液溶血后，除SHb外，其他血紅蛋白均被高鐵氰化鉀氧化成Hi，與CN結(jié)合生成穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白。它的最大吸收峰在540nm，測定A，得血紅蛋白濃度。w（二）試劑、器材w文齊氏液、721分光光度計8（三）操作5ml血紅蛋白轉(zhuǎn)化液+20ul血液，振蕩，混勻，5min后721分光光度計上測定。波長540nm。轉(zhuǎn)化液調(diào)零，1cm比色杯。9（四）結(jié)果報告1. A/44 /1 64458/10

3、00 251=A 367.7（g/L）2.標準曲線法測定參考標準品的A值，以Hb濃度為橫坐標，A值為縱坐標，繪制通過零點的曲線，查表。3. K值法: K=Hb總和 /A值總和 Hb濃度= A K10（五）質(zhì)量保證1.丙球蛋白異常，白細胞異常增多，SHb疾病時，測定液體發(fā)生渾濁，可增加NaCl，消除影響。2.廢液的處理每升加次氯酸鈉35ml，敞開過夜。CN-氧化成CO2和N2，或水解CO32-和NH4+。3、對分光光度計相關(guān)參數(shù)的校正。11（六）方法學(xué)評價該方法結(jié)果穩(wěn)定可靠，操作簡便，為標準方法，但有一定毒性。除了該方法外，還有SDS-Hb法和沙利氏法等，但SDS本身質(zhì)量差異大，摩爾消光系數(shù)、標

4、準液有待研究，為次選方法。沙利氏法誤差大，已經(jīng)被基本淘汰。12血涂片制備、白細胞分類計數(shù)血涂片制備、白細胞分類計數(shù)13血涂片制備血涂片制備實驗原理：實驗原理： 使用推片將血液在載玻片上制成血膜。使用推片將血液在載玻片上制成血膜。實驗步驟：實驗步驟：1、采血：直接用潔凈的玻片蘸一滴血（使用毛細血管采血的方、采血：直接用潔凈的玻片蘸一滴血（使用毛細血管采血的方法）。法）。2、推片：左手平置載玻片，右手持推片從后方或前方接近血滴，、推片：左手平置載玻片，右手持推片從后方或前方接近血滴，使血液沿推片的邊緣展開適當?shù)膶挾?，立即將推片與載玻片呈使血液沿推片的邊緣展開適當?shù)膶挾?，立即將推片與載玻片呈30-4

5、5度角，輕壓推片邊緣將血液推制成厚薄適當?shù)难科?，血度角，輕壓推片邊緣將血液推制成厚薄適當?shù)难科科瑧?yīng)呈舌狀，頭、體、尾清晰可見。涂片應(yīng)呈舌狀，頭、體、尾清晰可見。3、干燥：將推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。、干燥：將推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。4、標記：在載玻片的一端用記號筆編號。、標記：在載玻片的一端用記號筆編號。141516血涂片制備血涂片制備注意事項：注意事項：1、要制備良好的血涂片，玻片必須干凈。、要制備良好的血涂片，玻片必須干凈。2、最好使用非抗凝血制備，也可以、最好使用非抗凝血制備，也可以EDTA抗凝血制備?？鼓苽?。3、血膜應(yīng)厚薄適當，頭尾及兩側(cè)應(yīng)有

6、一定的空隙。、血膜應(yīng)厚薄適當，頭尾及兩側(cè)應(yīng)有一定的空隙。4、血涂片必須充分干燥后方可固定染色，否則細胞尚未牢固地吸、血涂片必須充分干燥后方可固定染色，否則細胞尚未牢固地吸附在玻片上，在染色過程中容易脫落。附在玻片上，在染色過程中容易脫落。5、蘸在玻片上的血液量要適度，過多或過少均會影響涂片的結(jié)果。、蘸在玻片上的血液量要適度，過多或過少均會影響涂片的結(jié)果。17血涂片染色血涂片染色實驗原理：實驗原理： 不同種類的細胞及細胞的不同成分對酸性或堿性染料的親和力不同種類的細胞及細胞的不同成分對酸性或堿性染料的親和力不同，因而瑞氏染色后各種血細胞顯示出各自的染色特征。不同，因而瑞氏染色后各種血細胞顯示出各

7、自的染色特征。實驗步驟：實驗步驟：1、待血涂片干燥后，用蠟筆在兩端劃線，以防染色時染液外溢。、待血涂片干燥后，用蠟筆在兩端劃線，以防染色時染液外溢。將玻片平置于染色架上，滴加染液將玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其迅速蓋滿血涂片，滴，使其迅速蓋滿血涂片，約約0.5-1 min后，滴加等量的或稍多的緩沖液，用吸耳球?qū)恃螅渭拥攘康幕蛏远嗟木彌_液，用吸耳球?qū)恃禋猓谷疽撼浞只旌?。片吹氣，使染液充分混合?、沖洗：室溫染色、沖洗：室溫染色5-10min后用流水沖去染液，待干。后用流水沖去染液，待干。3、觀察結(jié)果：將干燥后的血片置顯微鏡下觀察。用低倍鏡觀察血、觀察結(jié)果：將干燥后的血片

8、置顯微鏡下觀察。用低倍鏡觀察血涂片體尾交界處血細胞平鋪的部分。涂片體尾交界處血細胞平鋪的部分。18血涂片染色血涂片染色注意事項：注意事項：1、未干透的血膜不能染色，否則細胞容易脫落。、未干透的血膜不能染色，否則細胞容易脫落。2、染液的量應(yīng)適度，過少易揮發(fā)沉淀。、染液的量應(yīng)適度，過少易揮發(fā)沉淀。3、染色時間的長短與染液濃度、染色時溫度及血細胞的多少有關(guān)。、染色時間的長短與染液濃度、染色時溫度及血細胞的多少有關(guān)。4、沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖洗以防染料沉著在血涂片、沖洗時不能先倒掉染液，應(yīng)以流水沖洗以防染料沉著在血涂片上。上。5、染色過淡，可以復(fù)染，復(fù)染時應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好環(huán)境，、染色過

9、淡，可以復(fù)染，復(fù)染時應(yīng)先加緩沖液，創(chuàng)造良好環(huán)境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液而不能先加染液。而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液而不能先加染液。6、血細胞中的各種有機物質(zhì)特別是蛋白質(zhì)對染色環(huán)境中氫離子濃、血細胞中的各種有機物質(zhì)特別是蛋白質(zhì)對染色環(huán)境中氫離子濃度十分敏感。染色環(huán)境偏酸，增強伊紅著色，紅細胞和嗜酸粒細度十分敏感。染色環(huán)境偏酸，增強伊紅著色，紅細胞和嗜酸粒細胞偏紅，細胞核呈淡藍或不著色，染色環(huán)境偏堿，增強天青著色，胞偏紅，細胞核呈淡藍或不著色，染色環(huán)境偏堿，增強天青著色，所有細胞呈灰藍色，顆粒深藍。所有細胞呈灰藍色，顆粒深藍。19白細胞分類計數(shù)白細胞分類計數(shù)實驗原理：實驗原理

10、： 血細胞經(jīng)涂片、固定和染色后，根據(jù)不同的形態(tài)和染色特征可血細胞經(jīng)涂片、固定和染色后，根據(jù)不同的形態(tài)和染色特征可將各種白細胞區(qū)分開來，計數(shù)一定數(shù)量的白細胞并進行分類、匯將各種白細胞區(qū)分開來，計數(shù)一定數(shù)量的白細胞并進行分類、匯總，可計算出各種白細胞所占的百分比。總，可計算出各種白細胞所占的百分比。實驗步驟：實驗步驟：1、血涂片的制備與染色。、血涂片的制備與染色。2、鏡檢：使用低倍鏡瀏覽全片，觀察細胞的著色、分布情況。高、鏡檢：使用低倍鏡瀏覽全片，觀察細胞的著色、分布情況。高倍鏡檢查有無異?；蛲鈦砑毎?。最后選擇血涂片體尾交界處染色倍鏡檢查有無異?；蛲鈦砑毎?。最后選擇血涂片體尾交界處染色良好、分布均

11、勻的區(qū)域，滴香柏油一滴，在油鏡下按一定順序?qū)α己谩⒎植季鶆虻膮^(qū)域，滴香柏油一滴，在油鏡下按一定順序?qū)σ曇爸兴姷陌准毎M行分類。要避免重復(fù)計數(shù)或漏計，不可主視野中所見的白細胞進行分類。要避免重復(fù)計數(shù)或漏計，不可主觀選擇視野。共計數(shù)觀選擇視野。共計數(shù)100-200個白細胞。計數(shù)時還要觀察血細個白細胞。計數(shù)時還要觀察血細胞的形態(tài)、分布、染色情況，并注意有無寄生蟲及其他異常改變。胞的形態(tài)、分布、染色情況，并注意有無寄生蟲及其他異常改變。3、結(jié)果匯總：統(tǒng)計各類白細胞所占百分率，并計算絕對值。、結(jié)果匯總：統(tǒng)計各類白細胞所占百分率，并計算絕對值。20白細胞分類計數(shù)白細胞分類計數(shù)注意事項：注意事項：1、載玻片的質(zhì)量；、載玻片的質(zhì)量；2、血膜的質(zhì)量；、血膜的質(zhì)量；3、染色；、染色；4、各種白細胞的觀察與識別；、各種白細胞的觀察與識別；5、如染色過深，可用甲醇或乙醇適當脫色；染色過淺時可用緩沖、如染色過深，可用甲醇或乙醇適當脫色；染色過淺時可用緩沖液將染液稀釋后復(fù)染。液將染液稀釋后復(fù)染。6、發(fā)現(xiàn)有核紅細胞時應(yīng)單獨計數(shù)，不計入、發(fā)現(xiàn)有核紅細胞時應(yīng)單獨計數(shù)，不計入