生物技術綜合大實驗-GFP純化

1、生物技術綜合大實驗實驗報告GFP的分離與純化 姓 名： 專業(yè)班級 院 系： 指導教師： 完成日期 GFP的分離與純化摘要： GFP，在生物領域應用廣泛。本實驗回顧了GFP提取純化過程，包括細菌破碎、GFP沉淀、疏水過濾層析、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析等步驟，來獲得較純的GFP，并運用SDS-PAGE來檢測純化效果。關鍵詞：GFP 應用進展 層析 SDS-PAGE綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一類存在于這些腔腸動物體內的生物發(fā)光蛋白。1962年Shimomura等首先從多管水母(Aequorin victoria)中分離出一種分子量為20kDa

2、的稱為Aequorin的蛋白。由于水母整體熒光及提取的蛋白質顆粒熒光都呈綠色，因此，人們將這種蛋白命名為綠色熒光蛋白。1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結構；1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞和線蟲中表達了GFP，開創(chuàng)了GFP應用研究的先河，之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細胞中表達，GFP在細胞學、分子生物學和醫(yī)學、病毒學等領域中迅速掀起了一股熱潮；1997年10月1822日在美國NewJersey專門召開了一次關于GFP的國際會議。1994年錢永健改造了GFP，使得GFP的熒光變強、變色。由此和Shimomura、Martin Chalfie

3、共享了2008年諾貝爾化學。從此，熒光蛋白帶來了生物技術的新革命。GFP本身是一種酸性，球狀，可溶性天然熒光蛋白，分子量約27×103，一級結構為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽。在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰為473 nm；發(fā)射光譜max=508509nm。GFP性質極其穩(wěn)定，易耐受高溫處理，甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質。其變性需在90或pH<4.0或pH>12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理，一旦恢復中性環(huán)境，或去除變性劑，雖然變性的蛋白質并不能完全復性，但是復性蛋白質同天然蛋白質對溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是

4、，它們在很大的pH范圍內(pH712.2)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。根據Sheen等的研究，GFP在受體內表達時，其穩(wěn)定性并不亞于CAT蛋白，因而可以得到持續(xù)時間較長的熒光。GFP的性質和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團結構的穩(wěn)定性密不可分的。GFP表達后折疊，在氧存在的條件下，使66位氨基酸殘基的a、鍵間脫氫。由6567位的氨基酸殘基(Ser-Tyr-Gly)環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色團(基于組成生色團的元件不同，可將已知的GFP及其變種分為7種，每一種都有一組不同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長)。GFP無需再加任何底物和輔助

5、因子，在紫外或藍光激發(fā)下就能發(fā)熒光，在450490 nm藍光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10 min以上，不像其他熒光素，熒光容易淬滅。GFP在生物領域的最新應用進展包括多種技術。（1）顯像技術是利用熒光蛋白有多種顏色，且穩(wěn)定、無毒，所以熒光蛋白可使得動物體內復雜的系統(tǒng)結構可視化；（2）一般的熒光染料標記的微生物，由于其生長快、分裂多，染料可在短時間內被稀釋，所以不能實時準確地觀察微生物侵入活體動物以及細胞的過程。近年發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白可用于示蹤流行性病毒對活體細胞的感染，流行性病毒可被實時監(jiān)控，借助于這一新技術，我們可以更深入地研究其感染方式；（3）由于熒光蛋白發(fā)光團的形成不具物種專一性，可發(fā)出

6、熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質而發(fā)光，所以轉入宿主細胞后的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，對多數宿主的生理無影響，也是理想的報告基因；（4）熒光蛋白由于其獨特的光信號轉導機制，適于用作活細胞內的光學感受器?，F(xiàn)在許多研究者將具有信號轉導功能的分子識別位點結合到熒光蛋白分子上來設計成生物感受器；（5）利用GFP可顯色的特點，我們還可對需要的物質進行篩選和純化。由于新型病毒的鑒別特征有限，使得傳統(tǒng)的抗體生產方法不能被有效運用，生產抗體便遇到了極大的困難，而GFP的發(fā)現(xiàn)及其在分子生物學中的應用解決了這一難題。1.材料1.1實驗材料含GFP融合質粒，Top10菌株1.2實驗試劑溶液：50mM 葡萄糖，10

7、mM EDTA ，25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液：0.2M NaOH，1% SDS；溶液：3M醋酸鉀，2M 醋酸；無水乙醇，75%乙醇，TE Buffer，0.1M預冷 CaCl2，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素，阿拉伯糖，液氮，飽和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶，苯基瓊脂糖凝膠CL-4B，DEAE-纖維素；Lysis Buffer（50mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0）；Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) ； Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)；PEG10000，

8、Loading Buffer，溴酚藍，丙烯酰胺，Tris，SDS，過硫酸銨，TEMED，Gly，SDS，甘油，-巰基乙醇，溴酚藍，甲醇，考馬斯亮藍，乙酸等。1.3實驗儀器高速冷凍離心機,移液槍，超聲波破碎儀，梯度混合器，恒流泵,層析柱,色譜儀,自動記錄儀,SDS-PAGE電泳裝置。2.方法2.1 質粒的提取具體方法如下：1.取1.5ml菌液，12000rpm離心1min，棄上清液；2.加100l溶液，充分懸浮；3.加200l溶液，溫和混勻，室溫5min；4.加150l溶液，混勻，冰浴5min；12000rpm離心8min，將上清加入一新的1.5ml EP管中；5.加800l無水乙醇至上清液中，

9、混勻，-20放置10min，12000rpm離心8min，棄上清；6.70%乙醇洗DNA一次，離心棄上清；在超凈臺中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；7.加40l TE Buffer溶解DNA，4備用。2.2 感受態(tài)的制備及轉化具體方法如下：1. 取1.5ml Top10菌液，在4，4000rpm離心10min，棄上清；2. 加200l預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作）；3. 冰浴15min后再4，4000rpm，離心10min，棄上清；4. 加200l預冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作），4備用；5. 將1l質粒和感受態(tài)細胞混合，冰浴15-30min；5.42熱激

10、90s；7.立即放在冰上，冰浴3-5min；8.加入800l LB液體培養(yǎng)基，37，150rpm培養(yǎng)45-60min（主要用來使Top10恢復正常生長）；9.取200l菌液涂布在LB（加入Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培養(yǎng)基上。37培養(yǎng)過夜。2.3擴大培養(yǎng)具體方法如下：1、取涂有含GFP質粒Top10的平板，選擇單克隆（選擇在紫外燈照射下有綠色熒光的單菌落）；2、挑取綠色熒光的單菌落，接種至試管中（含4ml的LB液體培養(yǎng)基，加有100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37，200rpm振蕩培養(yǎng)至對數生長期，約3-4h；3、將上述搖好的菌，按1:100轉接至250ml

11、LB液中（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖2mg/ml），37，200rpm培養(yǎng)過夜。2.4 細菌破碎具體方法如下：1.3000g離心10min培養(yǎng)好的菌，紫外燈觀察，棄上清，沉淀用液氮凍融；2.用30ml lysis buffer（50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）懸浮沉淀；3.向懸浮液中加15mg溶菌酶，混勻，室溫溶解10min；4.400w功率下，超聲處理10min；5.9000g，15min離心破碎液，紫外燈觀察，留上清備用；（1號樣品）；6.選取合適的濃度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP：一般(NH4)2SO4濃度為30%時，雜蛋白的沉淀量是最大，濃度達到7

12、0%時GFP沉淀量達到最大（附：(NH4)2SO4濃度與含量表）；體積為10ml：(NH4)2SO4飽和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.433.133.94.725.616.627、向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室溫放置20min，9000rpm離心15min，轉移上清至另一試管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混勻，室溫放置至少20min，9000rpm離心15min，棄上清，留沉淀備用。2.5 疏水作用層析（苯基瓊脂糖凝膠）具體方法如下：1.將沉淀的GFP，用10ml 2M (NH4)

13、2SO4/lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，離心10min，留上清；（2號樣品）2.用3倍體積平衡Buffer（2M (NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.將“1”中的上清上柱，用3倍柱體積的Wash Buffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外燈檢查，GFP快流出時，準備收集；5.將收集液透析過夜。（3號樣品）。2.6離子交換層析（DEAE-纖維素）具體方法如下步驟：1.將透析后所得的透析液9000rpm離心10min

14、，棄去沉淀；(4號樣品)2.用3倍體積的Start Buffer（A液）平衡柱子；3.將“1”中所得的上清液上柱，再用3倍柱體積的Start buffer洗柱子；4.梯度洗脫GFP；梯度液：Start Buffer A液（20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）；Elution Buffer B液（20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0）；紫外燈觀察，GFP快流出來時，準備收集；5.將收集液透析過夜（透析液為A液）。2.7凝膠過濾層析（交聯(lián)葡聚糖）具體方法如下：1.將透析液置入含pEG10000的培養(yǎng)皿中，濃縮至體積約2ml；（5號樣品）2.用20mM Tris-HCl

15、，pH7.0，3倍柱體積平衡柱子；3.將“1”中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外燈檢測，GFP快流出時，收集，備用。（6號樣品）。2.8 SDSPAGE具體方法如下：將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20保存?zhèn)溆谩?.按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。2.分離膠的制備按下列成分配制分離膠：試劑體積ddH2O8.2 mL30%丙烯酰胺混合液6.68mL1.5M Tris(pH8.8)5.0mL10%SDS0.1 mL10

16、%過硫酸銨0.1 mLTEMED0.04 mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，并為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數次，用濾紙吸干凝膠頂端的水。3.濃縮膠的制備按下列成分配制2mL 5%的積層膠：試劑體積ddH2O7.35mL30%丙烯酰胺混合液1.3mL1.5M Tris (pH6.8)1.25mL10%SDS0.1mL10%過硫酸銨0.1mLTEMED0.1mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避

17、免產生氣泡；4.待積層膠凝固后，小心拔下梳子；5.將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20L各樣品；6.樣品在積層膠中電泳時，使用80V電壓，待溴酚藍帶進入分離膠后，將電壓升至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源；7.卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液（50%甲醇、0.05%考馬斯亮藍、10%乙酸、40%ddH2O）中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之后取出染色的凝膠并回收染液，以備再用，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液（與染色液同，只是無考馬斯亮藍）中，在水平搖床上脫色48h，

18、其間更換脫色液34次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結果并拍照（本次實驗中只染色45min，脫色1h左右）。（注：由于濃縮膠制備過程中凝固太快，所以最后未使用濃縮膠而只用分離膠進行的SDS-PAGE）。3.結果3.1 挑取單菌落在暗示中，用紫外燈照射下，發(fā)現(xiàn)單菌落發(fā)出綠色熒光。3.2 細菌破碎中第一步離心后圖片細胞破碎后，蛋白質流出細胞外，在紫外照射下，整個細胞破碎液發(fā)出綠色熒光。3.3疏水層析結果（借鑒第一組的圖）雜蛋白峰GFP峰疏水層析時，利用GFP和其他蛋白疏水性不同，分開從柱子里流出來。蛋白記錄儀可通過出現(xiàn)波峰的形勢記錄蛋白的含量。GFP是較純的蛋白，量大顯示出峰值高；而雜蛋白量

19、少出現(xiàn)不規(guī)則的峰。3.4離子交換層析GFP峰離子交換層析利用是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。3.5凝膠過濾層析凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據蛋白質的大小和形狀，即蛋白質的質量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質，使蛋白質混合物中的物質按分子大小的不同進行分離。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。3.6 SDS-PAGE結果圖其中樣品1為細菌破碎樣，樣品2為疏水層析前離心樣，樣品3為疏水層析樣，樣品4為離子交換層析前離心

20、樣，樣品5為離子交換層析后的透析濃縮樣，樣品6為凝膠過濾層析樣。標出來的為GFP條帶，大小在2535kDa。4.分析討論4.1實驗評價及該進措施從最后的電泳圖可以看出，前3個樣品出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，整個條帶都明亮，說明雜蛋白質較多，隨著運用多種純化技術，GFP純度越來越高，故在樣品4、5、6的條帶中，蛋白的分子量主要在2535kDa。圖中提取的蛋白質純度較高，所以本次試驗較為成功。關于后續(xù)的進一步純化，可采用結晶和重結晶方法來進一步提高蛋白質的純度，并消除少量的雜蛋白和鹽離子。試驗中存在一些缺陷，如電泳圖看出，整體跑膠效果不好，原因是未使用濃縮膠，而且染色時間過短。4.2 SDS-PAGE的樣

21、品緩沖液中有哪些成分？它們有什么作用？為什么要將樣品和緩沖液混合后煮沸？SDS-PAGE的樣品緩沖液的主要成分有Tris-HCl，SDS，甘油，溴酚藍和-巰基乙醇，其中Tris-HCl的主要作用是調節(jié)pH；SDS的作用主要是使蛋白質變性，斷裂蛋白質分子間和分子內的氫鍵，使蛋白質分子去折疊，破壞蛋白質的二級和三級結構；甘油是增加密度，使蛋白質能很好的沉淀在下面；溴酚藍作為指示前沿，防止電泳時間過長；-巰基乙醇作為保護劑，防止空氣中的氧對蛋白質的氧化作用，同時還能斷裂蛋白質分子中半胱氨酸殘基中的二硫鍵。4.3常用的交聯(lián)葡聚糖有G-25、G-50、G-75其中的25、50、75指的是什么？這種凝膠的排阻極限分別為多少？交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50、G-75中的25、50、75指的是1g交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時所吸收水克數的10倍，如G-25中的25指1g這種交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時要吸水2.5g。排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋炔康淖钚》肿拥姆肿恿?。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最