生物技術(shù)綜合大實驗-GFP純化

1、生物技術(shù)綜合大實驗實驗報告GFP的分離與純化 姓 名： 專業(yè)班級 院 系： 指導教師： 完成日期 GFP的分離與純化摘要： GFP，在生物領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。本實驗回顧了GFP提取純化過程，包括細菌破碎、GFP沉淀、疏水過濾層析、透析、離子交換層析和凝膠過濾層析等步驟，來獲得較純的GFP，并運用SDS-PAGE來檢測純化效果。關(guān)鍵詞：GFP 應(yīng)用進展 層析 SDS-PAGE綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)是一類存在于這些腔腸動物體內(nèi)的生物發(fā)光蛋白。1962年Shimomura等首先從多管水母(Aequorin victoria)中分離出一種分子量為20kDa

2、的稱為Aequorin的蛋白。由于水母整體熒光及提取的蛋白質(zhì)顆粒熒光都呈綠色，因此，人們將這種蛋白命名為綠色熒光蛋白。1992年P(guān)rasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一級結(jié)構(gòu)；1994年Chalfie等首次在大腸桿菌細胞和線蟲中表達了GFP，開創(chuàng)了GFP應(yīng)用研究的先河，之后很快發(fā)現(xiàn)GFP能在多種異源細胞中表達，GFP在細胞學、分子生物學和醫(yī)學、病毒學等領(lǐng)域中迅速掀起了一股熱潮；1997年10月1822日在美國NewJersey專門召開了一次關(guān)于GFP的國際會議。1994年錢永健改造了GFP，使得GFP的熒光變強、變色。由此和Shimomura、Martin Chalfie

3、共享了2008年諾貝爾化學。從此，熒光蛋白帶來了生物技術(shù)的新革命。GFP本身是一種酸性，球狀，可溶性天然熒光蛋白，分子量約27×103，一級結(jié)構(gòu)為一個由238個氨基酸殘基組成的單鏈多肽。在395 nm具有最高光吸收峰，肩峰為473 nm；發(fā)射光譜max=508509nm。GFP性質(zhì)極其穩(wěn)定，易耐受高溫處理，甲醛固定和石蠟包埋不影響其熒光性質(zhì)。其變性需在90或pH<4.0或pH>12.0的條件下用6mol/L鹽酸胍處理，一旦恢復(fù)中性環(huán)境，或去除變性劑，雖然變性的蛋白質(zhì)并不能完全復(fù)性，但是復(fù)性蛋白質(zhì)同天然蛋白質(zhì)對溫度、pH變化的耐受性、抗胰蛋白酶消解的能力是相同的。更重要的是

4、，它們在很大的pH范圍內(nèi)(pH712.2)的吸收、發(fā)射光譜也是相同的。根據(jù)Sheen等的研究，GFP在受體內(nèi)表達時，其穩(wěn)定性并不亞于CAT蛋白，因而可以得到持續(xù)時間較長的熒光。GFP的性質(zhì)和發(fā)射光譜的穩(wěn)定性是同其生色團結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性密不可分的。GFP表達后折疊，在氧存在的條件下，使66位氨基酸殘基的a、鍵間脫氫。由6567位的氨基酸殘基(Ser-Tyr-Gly)環(huán)化為穩(wěn)定的對羥基苯咪唑啉酮(4-P-hydroxybene-5-imidazolinone)，形成生色團(基于組成生色團的元件不同，可將已知的GFP及其變種分為7種，每一種都有一組不同的熒光激發(fā)和發(fā)射波長)。GFP無需再加任何底物和輔助

5、因子，在紫外或藍光激發(fā)下就能發(fā)熒光，在450490 nm藍光激發(fā)下，GFP熒光至少能保持10 min以上，不像其他熒光素，熒光容易淬滅。GFP在生物領(lǐng)域的最新應(yīng)用進展包括多種技術(shù)。（1）顯像技術(shù)是利用熒光蛋白有多種顏色，且穩(wěn)定、無毒，所以熒光蛋白可使得動物體內(nèi)復(fù)雜的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)可視化；（2）一般的熒光染料標記的微生物，由于其生長快、分裂多，染料可在短時間內(nèi)被稀釋，所以不能實時準確地觀察微生物侵入活體動物以及細胞的過程。近年發(fā)現(xiàn)，熒光蛋白可用于示蹤流行性病毒對活體細胞的感染，流行性病毒可被實時監(jiān)控，借助于這一新技術(shù)，我們可以更深入地研究其感染方式；（3）由于熒光蛋白發(fā)光團的形成不具物種專一性，可發(fā)出

6、熒光穩(wěn)定，且不需依賴任何輔因子或其他基質(zhì)而發(fā)光，所以轉(zhuǎn)入宿主細胞后的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，對多數(shù)宿主的生理無影響，也是理想的報告基因；（4）熒光蛋白由于其獨特的光信號轉(zhuǎn)導機制，適于用作活細胞內(nèi)的光學感受器?，F(xiàn)在許多研究者將具有信號轉(zhuǎn)導功能的分子識別位點結(jié)合到熒光蛋白分子上來設(shè)計成生物感受器；（5）利用GFP可顯色的特點，我們還可對需要的物質(zhì)進行篩選和純化。由于新型病毒的鑒別特征有限，使得傳統(tǒng)的抗體生產(chǎn)方法不能被有效運用，生產(chǎn)抗體便遇到了極大的困難，而GFP的發(fā)現(xiàn)及其在分子生物學中的應(yīng)用解決了這一難題。1.材料1.1實驗材料含GFP融合質(zhì)粒，Top10菌株1.2實驗試劑溶液：50mM 葡萄糖，10

7、mM EDTA ，25mM Tris-HCl，pH=8.0；溶液：0.2M NaOH，1% SDS；溶液：3M醋酸鉀，2M 醋酸；無水乙醇，75%乙醇，TE Buffer，0.1M預(yù)冷 CaCl2，LB培養(yǎng)基，氨芐青霉素，阿拉伯糖，液氮，飽和(NH4)2SO4溶液，溶菌酶，苯基瓊脂糖凝膠CL-4B，DEAE-纖維素；Lysis Buffer（50mM Tris-HCl，1Mm EDTA，pH8.0）；Start Buffer(A液20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）) ； Elution buffer(B液20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0)；PEG10000，

8、Loading Buffer，溴酚藍，丙烯酰胺，Tris，SDS，過硫酸銨，TEMED，Gly，SDS，甘油，-巰基乙醇，溴酚藍，甲醇，考馬斯亮藍，乙酸等。1.3實驗儀器高速冷凍離心機,移液槍，超聲波破碎儀，梯度混合器，恒流泵,層析柱,色譜儀,自動記錄儀,SDS-PAGE電泳裝置。2.方法2.1 質(zhì)粒的提取具體方法如下：1.取1.5ml菌液，12000rpm離心1min，棄上清液；2.加100l溶液，充分懸?。?.加200l溶液，溫和混勻，室溫5min；4.加150l溶液，混勻，冰浴5min；12000rpm離心8min，將上清加入一新的1.5ml EP管中；5.加800l無水乙醇至上清液中，

9、混勻，-20放置10min，12000rpm離心8min，棄上清；6.70%乙醇洗DNA一次，離心棄上清；在超凈臺中吹干DNA（一般吹5-10min即可）；7.加40l TE Buffer溶解DNA，4備用。2.2 感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化具體方法如下：1. 取1.5ml Top10菌液，在4，4000rpm離心10min，棄上清；2. 加200l預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作）；3. 冰浴15min后再4，4000rpm，離心10min，棄上清；4. 加200l預(yù)冷的0.1M CaCl2懸浮沉淀（無菌操作），4備用；5. 將1l質(zhì)粒和感受態(tài)細胞混合，冰浴15-30min；5.42熱激

10、90s；7.立即放在冰上，冰浴3-5min；8.加入800l LB液體培養(yǎng)基，37，150rpm培養(yǎng)45-60min（主要用來使Top10恢復(fù)正常生長）；9.取200l菌液涂布在LB（加入Amp 100ng/ml，阿拉伯糖4mg/ml）培養(yǎng)基上。37培養(yǎng)過夜。2.3擴大培養(yǎng)具體方法如下：1、取涂有含GFP質(zhì)粒Top10的平板，選擇單克?。ㄟx擇在紫外燈照射下有綠色熒光的單菌落）；2、挑取綠色熒光的單菌落，接種至試管中（含4ml的LB液體培養(yǎng)基，加有100ng/ml的Amp和4mg/ml的阿拉伯糖）37，200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，約3-4h；3、將上述搖好的菌，按1:100轉(zhuǎn)接至250ml

11、LB液中（Amp 100ng/ml，阿拉伯糖2mg/ml），37，200rpm培養(yǎng)過夜。2.4 細菌破碎具體方法如下：1.3000g離心10min培養(yǎng)好的菌，紫外燈觀察，棄上清，沉淀用液氮凍融；2.用30ml lysis buffer（50mM Tris-HCl pH8.0，1mM EDTA）懸浮沉淀；3.向懸浮液中加15mg溶菌酶，混勻，室溫溶解10min；4.400w功率下，超聲處理10min；5.9000g，15min離心破碎液，紫外燈觀察，留上清備用；（1號樣品）；6.選取合適的濃度破碎(NH4)2SO4沉淀GFP：一般(NH4)2SO4濃度為30%時，雜蛋白的沉淀量是最大，濃度達到7

12、0%時GFP沉淀量達到最大（附：(NH4)2SO4濃度與含量表）；體積為10ml：(NH4)2SO4飽和度10%20%30%40%50%60%70%80%90%(NH4)2SO4（g）0.561.141.762.433.133.94.725.616.627、向上清中加5.28g(NH4)2SO4，充分溶解，室溫放置20min，9000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至另一試管中，再加入6.88g(NH4)2SO4，充分混勻，室溫放置至少20min，9000rpm離心15min，棄上清，留沉淀備用。2.5 疏水作用層析（苯基瓊脂糖凝膠）具體方法如下：1.將沉淀的GFP，用10ml 2M (NH4)

13、2SO4/lysis Buffer，pH8.0溶解，9000rpm，離心10min，留上清；（2號樣品）2.用3倍體積平衡Buffer（2M (NH4)2SO4，pH8.0）平衡柱子；3.將“1”中的上清上柱，用3倍柱體積的Wash Buffer（1.3M(NH4)2SO4，pH8.0）洗柱子；4.用恒流泵泵TE Buffer（Elution Buffer：10mM Tris, 1mM EDTA，pH8.0）洗柱，紫外燈檢查，GFP快流出時，準備收集；5.將收集液透析過夜。（3號樣品）。2.6離子交換層析（DEAE-纖維素）具體方法如下步驟：1.將透析后所得的透析液9000rpm離心10min

14、，棄去沉淀；(4號樣品)2.用3倍體積的Start Buffer（A液）平衡柱子；3.將“1”中所得的上清液上柱，再用3倍柱體積的Start buffer洗柱子；4.梯度洗脫GFP；梯度液：Start Buffer A液（20mM Tris-HCl，pH7.0（透析液）；Elution Buffer B液（20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH7.0）；紫外燈觀察，GFP快流出來時，準備收集；5.將收集液透析過夜（透析液為A液）。2.7凝膠過濾層析（交聯(lián)葡聚糖）具體方法如下：1.將透析液置入含pEG10000的培養(yǎng)皿中，濃縮至體積約2ml；（5號樣品）2.用20mM Tris-HCl

15、，pH7.0，3倍柱體積平衡柱子；3.將“1”中所得的GFP上柱，用20mM Tris-HCl，pH7.0洗柱子，紫外燈檢測，GFP快流出時，收集，備用。（6號樣品）。2.8 SDSPAGE具體方法如下：將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20保存?zhèn)溆谩?.按照電泳裝置的使用說明，裝好潔凈干燥的玻璃板。2.分離膠的制備按下列成分配制分離膠：試劑體積ddH2O8.2 mL30%丙烯酰胺混合液6.68mL1.5M Tris(pH8.8)5.0mL10%SDS0.1 mL10

16、%過硫酸銨0.1 mLTEMED0.04 mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，并為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數(shù)次，用濾紙吸干凝膠頂端的水。3.濃縮膠的制備按下列成分配制2mL 5%的積層膠：試劑體積ddH2O7.35mL30%丙烯酰胺混合液1.3mL1.5M Tris (pH6.8)1.25mL10%SDS0.1mL10%過硫酸銨0.1mLTEMED0.1mL各成分加入后迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿后小心插入加樣梳，盡可能避

17、免產(chǎn)生氣泡；4.待積層膠凝固后，小心拔下梳子；5.將凝膠固定于電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，在加樣孔中分別加入20L各樣品；6.樣品在積層膠中電泳時，使用80V電壓，待溴酚藍帶進入分離膠后，將電壓升至120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關(guān)閉電源；7.卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液（50%甲醇、0.05%考馬斯亮藍、10%乙酸、40%ddH2O）中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之后取出染色的凝膠并回收染液，以備再用，將凝膠浸泡于考馬斯亮藍脫色液（與染色液同，只是無考馬斯亮藍）中，在水平搖床上脫色48h，

18、其間更換脫色液34次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結(jié)果并拍照（本次實驗中只染色45min，脫色1h左右）。（注：由于濃縮膠制備過程中凝固太快，所以最后未使用濃縮膠而只用分離膠進行的SDS-PAGE）。3.結(jié)果3.1 挑取單菌落在暗示中，用紫外燈照射下，發(fā)現(xiàn)單菌落發(fā)出綠色熒光。3.2 細菌破碎中第一步離心后圖片細胞破碎后，蛋白質(zhì)流出細胞外，在紫外照射下，整個細胞破碎液發(fā)出綠色熒光。3.3疏水層析結(jié)果（借鑒第一組的圖）雜蛋白峰GFP峰疏水層析時，利用GFP和其他蛋白疏水性不同，分開從柱子里流出來。蛋白記錄儀可通過出現(xiàn)波峰的形勢記錄蛋白的含量。GFP是較純的蛋白，量大顯示出峰值高；而雜蛋白量

19、少出現(xiàn)不規(guī)則的峰。3.4離子交換層析GFP峰離子交換層析利用是以離子交換劑為固定相，依據(jù)流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結(jié)合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。3.5凝膠過濾層析凝膠過濾層析法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進行分離。一般是大分子先流出來，小分子后流出來。3.6 SDS-PAGE結(jié)果圖其中樣品1為細菌破碎樣，樣品2為疏水層析前離心樣，樣品3為疏水層析樣，樣品4為離子交換層析前離心

20、樣，樣品5為離子交換層析后的透析濃縮樣，樣品6為凝膠過濾層析樣。標出來的為GFP條帶，大小在2535kDa。4.分析討論4.1實驗評價及該進措施從最后的電泳圖可以看出，前3個樣品出現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，整個條帶都明亮，說明雜蛋白質(zhì)較多，隨著運用多種純化技術(shù)，GFP純度越來越高，故在樣品4、5、6的條帶中，蛋白的分子量主要在2535kDa。圖中提取的蛋白質(zhì)純度較高，所以本次試驗較為成功。關(guān)于后續(xù)的進一步純化，可采用結(jié)晶和重結(jié)晶方法來進一步提高蛋白質(zhì)的純度，并消除少量的雜蛋白和鹽離子。試驗中存在一些缺陷，如電泳圖看出，整體跑膠效果不好，原因是未使用濃縮膠，而且染色時間過短。4.2 SDS-PAGE的樣

21、品緩沖液中有哪些成分？它們有什么作用？為什么要將樣品和緩沖液混合后煮沸？SDS-PAGE的樣品緩沖液的主要成分有Tris-HCl，SDS，甘油，溴酚藍和-巰基乙醇，其中Tris-HCl的主要作用是調(diào)節(jié)pH；SDS的作用主要是使蛋白質(zhì)變性，斷裂蛋白質(zhì)分子間和分子內(nèi)的氫鍵，使蛋白質(zhì)分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)；甘油是增加密度，使蛋白質(zhì)能很好的沉淀在下面；溴酚藍作為指示前沿，防止電泳時間過長；-巰基乙醇作為保護劑，防止空氣中的氧對蛋白質(zhì)的氧化作用，同時還能斷裂蛋白質(zhì)分子中半胱氨酸殘基中的二硫鍵。4.3常用的交聯(lián)葡聚糖有G-25、G-50、G-75其中的25、50、75指的是什么？這種凝膠的排阻極限分別為多少？交聯(lián)葡聚糖G-25、G-50、G-75中的25、50、75指的是1g交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時所吸收水克數(shù)的10倍，如G-25中的25指1g這種交聯(lián)葡聚糖干膠膨脹時要吸水2.5g。排阻極限是指不能進入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最