哺乳動物的基因工程

1、工程一班 劉思平201220141262哺乳動物的基因工程Part 1高等高等哺乳哺乳動物動物基因基因工程工程的基的基本概本概念念哺乳動物的基因工程高等高等哺乳哺乳動物動物的受的受體系體系統(tǒng)統(tǒng)Part 2高等高等哺乳哺乳動物動物的基的基因轉因轉移移Part 4高等高等哺乳哺乳動物動物的載的載體系體系統(tǒng)統(tǒng)Part 3Part 5利用利用哺乳哺乳動物動物工程工程細胞細胞生產(chǎn)生產(chǎn)重組重組蛋白蛋白哺乳動物基因工程的基本概念動物基因工程指利用DNA重組技術對動物所進行的工程操作。遺傳學角度分為遺傳和非遺傳即遺傳性動物基因工程和轉基因技術。遺傳性基因工程作用動物工程細胞。為蛋白多肽物質大規(guī)模生產(chǎn)藥物篩選研

2、究模型轉基因技術作用動物個體。遺傳性狀改良，人體基因治療。02高等哺乳動物受體細胞的條件03高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記01高等哺乳動物細胞的生長特性04常用的高等哺乳動物受體細胞高等哺乳動物細胞的受體系統(tǒng)錨地依賴性錨地依賴性：細胞必須附在固體上或細胞必須附在固體上或 固定的表面才能生長分裂、固定的表面才能生長分裂、血清依賴性：血清依賴性：細胞必須具有生長因子細胞必須具有生長因子才能生長才能生長接觸抑制性：接觸抑制性：細胞與細胞接觸后，生細胞與細胞接觸后，生長便受到抑長便受到抑形態(tài)依賴性：形態(tài)依賴性：細胞稱扁平狀，并有長細胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結纖維網(wǎng)狀結正常的哺乳類動物細胞具有下列四大

3、生物學特征正常的哺乳類動物細胞具有下列四大生物學特征：上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活上述特征使得正常的哺乳動物細胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活5050代代且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細胞生長。有時，正常細胞會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀會改變某些特征而越過生理臨界點，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。態(tài)稱為細胞系形成，此時的細胞成為細胞系。02高等哺乳動物受體細胞的條件03高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記01高等哺乳動物04常用的高等哺乳動物

4、受體細胞高等哺乳動物細胞的受體系統(tǒng)以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞應具備下列條以高效表達外源基因為目標的高等哺乳動物受體細胞應具備下列條件件細胞系特征細胞系特征 喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大喪失細胞接觸抑制性和錨地依賴性特征，便于大規(guī)模培養(yǎng)規(guī)模培養(yǎng)遺傳穩(wěn)定性遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存合適的標記合適的標記 便于轉化株的篩選和維持便于轉化株的篩選和維持生長快且齊生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制分裂周期短，生長均一，便于控制安全性能好安全性能好 不合成分泌致病物質，不致癌不合成分泌致病物質，不

5、致癌大多數(shù)正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具大多數(shù)正常的高等哺乳動物細胞并不能同時具備上述條件，癌細胞能滿足上述前四項要求，備上述條件，癌細胞能滿足上述前四項要求，但在安全性能上有欠缺。但在安全性能上有欠缺。02高等哺乳動物受體細胞的條件03高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記01高等哺細04常用的高等哺乳動物受體細胞高等哺乳動物細胞的受體系統(tǒng)1. 營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細胞 2. 哺乳動物受體細胞的抗性基因選擇標記1.胸腺嘧啶核苷激酶基因（TK）TK合成TMP，氨基嘌呤篩選2.黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因（XGPT-）XGPRT合成GMP，用酶酚酸篩選3.氨基葡萄糖苷3-磷酸轉移酶基因（AP

6、H-）APH滅火G418，用G418篩選4.二氫葉酸還原酶基因（DHFR）DHFR變體抗氨甲喋呤,用氨甲喋呤篩選從頭合成：從簡單的前提物質開始進行合成補救合成：利用游離的堿基、核苷進行合成嘌呤和嘧啶有各自獨立的合成途徑，皆可被特定藥物阻斷。02高等哺乳動物受體細胞的條件03高等哺乳動物受體細胞的遺傳標記01高等哺乳動物細胞的生長特性04常用的高等哺乳動物受體細胞高等哺乳動物細胞的受體系統(tǒng)高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（高等哺乳動物受體細胞主要還是中國倉鼠卵巢細胞（CHO），原因是），原因是遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定與人的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確與人

7、的親緣關系接近，外源蛋白修飾準確基因轉移和載體表達系統(tǒng)完善基因轉移和載體表達系統(tǒng)完善耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng)被美國被美國FDA確認為安全的基因工程受體細胞（確認為安全的基因工程受體細胞（GRAS）腺病毒科為無包膜線狀腺病毒科為無包膜線狀雙鏈雙鏈DNA病毒，病毒，分哺乳分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒有人腺病毒有6個亞屬，其個亞屬，其中常用來構建載體的主中常用來構建載體的主要是要是C亞屬的亞屬的2型（型（Ad2）和和5型（型（Ad5）病毒）病毒。腺。腺病毒感染人細胞時呈裂病毒感染人細胞時呈裂解型，不致癌；但

8、對嚙解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，絕大多齒目動物來說，絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致數(shù)的腺病毒成員均能致癌。癌。猿猴病毒DNA（SV40）人牛痘病毒DNA人乳多瘤人乳多瘤病毒（病毒（BKV）屬于屬于乳多瘤乳多瘤病毒科乳病毒科乳頭瘤病毒屬，頭瘤病毒屬， 其基因組為雙鏈其基因組為雙鏈DNA，感染宿主細胞，感染宿主細胞后基因不發(fā)生整合，后基因不發(fā)生整合， 獨立于染色體而自獨立于染色體而自主復制，每個宿主細主復制，每個宿主細胞最高可達胞最高可達500個個 拷貝?？截悺Ｈ伺６徊《臼且粋€大型人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長病毒，基因組長185 kb，能在宿主細胞，能在宿主細胞質中自主復制。以前外質

9、中自主復制。以前外源基因插在病毒基因組源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構建出的非必需區(qū)內(nèi)，構建出的重組病毒具有感染力，的重組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉染，外源基而且一經(jīng)轉染，外源基因即可在最鄰近的病毒因即可在最鄰近的病毒啟動子的控制下高效表啟動子的控制下高效表達。然而由于牛痘病毒達。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外基因組較大，體外DNA重組很困難，因此通常重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進采用體內(nèi)重組的方式進行。行。 SV40屬于乳多瘤病毒科多屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，瘤病毒屬，呈小型二十面體，由由VP1、VP2、VP3三種衣三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為殼蛋白包裝而

10、成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀的雙鏈環(huán)狀DNASV40可以與所有哺乳動可以與所有哺乳動物宿主細胞中的組蛋白物宿主細胞中的組蛋白H2、H3、H4結合，從而使其結合，從而使其DNA形成類似核小體的微型形成類似核小體的微型染色體結構。染色體結構。 SV40感染猴感染猴細胞時呈裂解型，不致癌；細胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，便發(fā)但感染嚙齒類動物后，便發(fā)生非同源整合而致癌。生非同源整合而致癌。人腺病毒DNA人乳多瘤病毒DNA（BKV） 高等哺乳動物的載體系統(tǒng)02猿猴病毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)腺病毒基因組腺病毒基因組DN

11、A全長全長36 kb，其包裝上限為原基因組，其包裝上限為原基因組的的105%， DNA兩端各有一個反向重復序列（兩端各有一個反向重復序列（ITR）；）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的為早期基因，與病毒基因組的復制及晚期基因的表達調控有關，表達調控有關，其中其中E3編碼晚期基因的調控因子；編碼晚期基因的調控因子；L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；為編碼病毒包裝蛋白的晚期基因；IVa2和和VA均為病毒均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。聚合酶的亞基編碼基因。02猿猴病毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)優(yōu)點：1.

12、可插入大片段外源基因，重組腺病毒基因組較穩(wěn)定2.可高效的轉導不同類型的哺乳動物細胞。體外實驗轉導率100%3.即可感染分裂細胞，又可感染非分裂細胞4.在細胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量，外源基因表達水平較高5.進入細胞內(nèi)但不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達安全性高構建方法1.體外連接2.同源重組3.位置特異性重組02猿猴病毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)猿猴病毒又稱SV40，兩種早期mRNA分別編碼大T-抗原小t-抗原，三種晚期mRNA分別編碼VP1、VP2、VP3三中蛋白質。在復制起點周圍約400bp序列范圍內(nèi)有一段增強子序列，

13、早期轉錄可被其大大增強。02猿猴病毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)重組的重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力分子必須經(jīng)過包裝后才具有感染能力，因此，插入的外源，因此，插入的外源DNA片段不能太大。為了盡量提高片段不能太大。為了盡量提高SV40的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的的裝載量，必須刪除一些基因片段，因此重組的SV40分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成分子必須與野生型病毒共感染受體細胞，才能形成有感染力的重組病毒顆粒。有感染力的重組病毒顆粒?；虮磉_好 宿主范圍窄基因重排高裝載量小02猿猴病

14、毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)刪除刪除編碼病毒核心蛋白和外殼編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的基因，并與大腸桿菌質蛋白的基因，并與大腸桿菌質粒拼接，構成穿梭載體；粒拼接，構成穿梭載體；它不能整合，同時也不能形成它不能整合，同時也不能形成成熟的病毒顆粒裂解受體細胞成熟的病毒顆粒裂解受體細胞。安裝安裝細胞色素細胞色素P450 dioxin介導介導的的增強子增強子DRE， 控制小鼠乳腺癌啟動子控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達；，由其帶動外源基因的表達；SV40來源的啟動子來源的啟動子控制控制Neor 標標記基因，以記基因，

15、以G418篩選重組子。篩選重組子。以此載體在人細胞系中表達以此載體在人細胞系中表達b1-干擾素和單純皰疹病毒干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲蛋白獲得成功。得成功。BKV - E.coli 穿梭載體穿梭載體BKV oriBKV geneDREMMTPAp rE.coli oriSV40 PNeo r02猿猴病毒DNA03人乳多瘤病毒DNA01人腺病毒DNA04人牛痘病毒DNA高等哺乳動物細胞的載體系統(tǒng)目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預先構建好的目前廣泛使用的牛痘病毒表達系統(tǒng)是一種預先構建好的重組病毒。其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌重組病毒。其基因組上插入了一個可表達的大腸桿菌T7RNA聚合

16、酶編碼基因；聚合酶編碼基因；在外源基因導入受體細胞之前，先以上述的重組病毒感在外源基因導入受體細胞之前，先以上述的重組病毒感染細胞，使其大量表達染細胞，使其大量表達T7RNA聚合酶；、聚合酶；、然后再將含有外源基因和然后再將含有外源基因和T7啟動子的細菌型重組質粒導啟動子的細菌型重組質粒導入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染入哺乳動物受體細胞，此時外源基因整合在受體細胞染色體色體DNA上，并在上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達出重組蛋聚合酶的作用下表達出重組蛋白。白。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達的。01哺乳動物細胞的物理轉化

17、法02哺乳動物細胞的病毒轉染法高等哺乳動物細胞的基因轉移外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源外源基因表達盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔。基因表達產(chǎn)物的分離純化減輕了負擔。但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的但外源基因表達盒進入受體細胞后，往往以多拷貝的形式隨機整合在染色體形式隨機整合在染色體DNA上，導致受體細胞基因滅活上，導致受體細胞基因滅活、外源基因不表達。、外源基因不表達。以病毒以病毒DNADNA為載體可以將外源基因直接轉染或與野生型為載體可以將外源基因直接轉染或與野生型病毒顆粒共轉染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、病毒顆粒共

18、轉染特定的受體細胞。這種方法具有定向性好、實驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，實驗重復性佳、導入效率高等優(yōu)點，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉染一些具有重如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無法轉染一些具有重要經(jīng)濟價值的家禽和牲畜細胞等。要經(jīng)濟價值的家禽和牲畜細胞等。02電擊轉化電擊轉化法法03脂質體介導法脂質體介導法01磷酸鈣共沉淀磷酸鈣共沉淀法法04顯微注射法顯微注射法高等哺乳動物細胞的物理轉化法將待轉化的將待轉化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶溶液混勻，此時液混勻，此時 DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；將被包裹

19、在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；將上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，上述制備的顆粒懸浮液滴入細胞培養(yǎng)皿中，37保溫保溫4-16小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶小時此時細胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結構，解膜結構，DNA便進入受體細胞；便進入受體細胞；將待轉化的將待轉化的DNA溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電溶解受體細胞懸浮液中，然后加入電擊轉化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細擊轉化儀的樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時，胞膜產(chǎn)生細小的縫隙，此時，DNA片段便可不經(jīng)過胞片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接飲作用直接進入受體細胞。進入受體細胞。將待轉化的將待轉化的

20、DNADNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相，后者在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNADNA的的脂質體結構脂質體結構。將這種脂質體懸浮液加入到細胞培將這種脂質體懸浮液加入到細胞培養(yǎng)液中，便會與受體細養(yǎng)液中，便會與受體細胞膜融合，胞膜融合，DNADNA隨即進入胞質和核內(nèi)隨即進入胞質和核內(nèi)。通過激素療法使雌通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然雄性小鼠交配，然后殺死雌鼠，從其后殺死雌鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精輸卵管內(nèi)取出受精卵；借助于顯微鏡卵；借助于顯微鏡將純化的將純化的DNA溶溶液迅速注入到受精液迅速注入

21、到受精卵中變大了的雄性卵中變大了的雄性原核內(nèi)。原核內(nèi)。 02 03 0104利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)重組蛋白哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人凝血因子VIII 01 哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理1. 通過強化基因擴增高效表達外源基因通過強化基因擴增高效表達外源基因基因擴增基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊方式。方式。1) DHFR-MTX高效表達系統(tǒng)高效表達系統(tǒng)氨甲喋呤氨甲喋呤(MTX)(MTX)是動

22、物細胞中的關鍵代謝酶二氫葉酸還原酶是動物細胞中的關鍵代謝酶二氫葉酸還原酶(DHFR)(DHFR)的特的特異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細胞死亡，但在異性抑制劑，細胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，DHFRDHFR基因均得以擴增?；蚓靡詳U增。2) GS-MSX高效表達系統(tǒng)高效表達系統(tǒng)先將帶有先將帶有GSGS編碼基因的載體轉入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，由于只有多拷貝編碼基因的載體轉入培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，由于只有多拷貝的的GSGS編碼基因才能抗編碼基因才能抗MSXMSX，所以在轉染過程中不必使用，所以在轉染過程

23、中不必使用GSGS缺陷型的受體細胞缺陷型的受體細胞；而且在正常的；而且在正常的MSXMSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉染細胞，GSGS基因能解除甲基因能解除甲硫氨酸亞砜（硫氨酸亞砜（MSXMSX）對動物細胞的）對動物細胞的毒害作用。毒害作用。 01 哺乳動物細胞高效表達外源蛋白的基本原理1. 通過強化基因擴增高效表達外源基因通過強化基因擴增高效表達外源基因基因擴增基因擴增是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊是外源基因在哺乳動物細胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達的一種特殊方式。方式。2. 通過強化基因轉錄高效表達外源基因通過強化基因轉錄高效表達

24、外源基因 在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟動子以及有效的翻譯元在載體上安裝病毒或細胞來源的強啟動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達的一種手段，如：件，也是使外源基因高效表達的一種手段，如：細胞巨化病細胞巨化病毒毒CMV的啟動子、動物珠蛋白基因的內(nèi)含子、的啟動子、動物珠蛋白基因的內(nèi)含子、SV40的終止的終止子和子和polyA化信號序列化信號序列 02 利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體大多數(shù)惡性淋巴瘤細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白大多數(shù)惡性淋巴瘤細胞表面上都有一種特異性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗用人源化的小鼠抗campath抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果抗體治療非霍金淋巴細胞瘤患者，效果良好。良好。重組抗體采用重組抗體采用DHFR-MTX系統(tǒng)表達。系統(tǒng)表達。 03 利用哺乳動物工程細胞生產(chǎn)人組織