多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

1、多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建來源：生物谷  2010-1-8   訪問量：6568評論(0)分享0【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?、熟悉構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)生樹的基本過程，獲得使用不同建樹方法、建樹材料和建樹參數(shù)對建樹結(jié)果影響的正確認(rèn)識；2、掌握使用Clustalx進(jìn)行序列多重比對的操作方法；3、掌握使用Phylip軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在現(xiàn)代分子進(jìn)化研究中，根據(jù)現(xiàn)有生物基因或物種多樣性來重建生物的進(jìn)化史是一個(gè)非常重要的問題。一個(gè)可靠的系統(tǒng)發(fā)生的推斷，將揭示出有關(guān)生物進(jìn)化過程的順序，有助于我們了解生物進(jìn)化的歷史和進(jìn)化機(jī)制。對于一個(gè)完整的進(jìn)化樹分析需要以下幾

2、個(gè)步驟： 要對所分析的多序列目標(biāo)進(jìn)行比對（alignment）。 要構(gòu)建一個(gè)進(jìn)化樹（phyligenetic tree）。構(gòu)建進(jìn)化樹的算法主要分為兩類：獨(dú)立元素法（discrete character methods）和距離依靠法（distance methods）。所謂獨(dú)立元素法是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钍怯尚蛄猩系拿總€(gè)堿基/氨基酸的狀態(tài)決定的（例如：一個(gè)序列上可能包含很多的酶切位點(diǎn)，而每個(gè)酶切位點(diǎn)的存在與否是由幾個(gè)堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個(gè)序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點(diǎn)狀態(tài)，當(dāng)多個(gè)序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析時(shí)，進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钜簿陀蛇@些堿基的狀態(tài)決定了）。而距離依靠法是指進(jìn)化樹的拓?fù)湫螤钣蓛蓛尚蛄?/p>

3、的進(jìn)化距離決定的。進(jìn)化樹枝條的長度代表著進(jìn)化距離。獨(dú)立元素法包括最大簡約性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距離依靠法包括除權(quán)配對法（UPGMAM）和鄰位相連法（Neighbor-joining）。 對進(jìn)化樹進(jìn)行評估，主要采用Bootstraping法。進(jìn)化樹的構(gòu)建是一個(gè)統(tǒng)計(jì)學(xué)問題，我們所構(gòu)建出來的進(jìn)化樹只是對真實(shí)的進(jìn)化關(guān)系的評估或者模擬。如果我們采用了一個(gè)適當(dāng)?shù)姆椒?，那么所?gòu)建的進(jìn)化樹就會(huì)接近真實(shí)的"進(jìn)化樹"。模擬的進(jìn)化樹需要一種數(shù)學(xué)方法來對其進(jìn)行評估。不同的算法有不同的適用目標(biāo)

4、。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列：i 所要比較的序列的堿基差別小，ii 對于序列上的每一個(gè)堿基有近似相等的變異率，iii 沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，iv 所檢驗(yàn)的序列的堿基數(shù)目較多（大于幾千個(gè)堿基）；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計(jì)算極其耗時(shí)。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時(shí)間才能計(jì)算完畢。UPGMAM（Unweighted pair group method with arithmetic mean）假設(shè)在進(jìn)化過程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的變異率，也就是存在著一個(gè)分子鐘。這種算法得到的進(jìn)化樹相對來說不是很準(zhǔn)確，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。鄰位相

5、連法是一個(gè)經(jīng)常被使用的算法，它構(gòu)建的進(jìn)化樹相對準(zhǔn)確，而且計(jì)算快捷。其缺點(diǎn)是序列上的所有位點(diǎn)都被同等對待，而且，所分析的序列的進(jìn)化距離不能太大。另外，需要特別指出的是對于一些特定多序列對象來說可能沒有任何一個(gè)現(xiàn)存算法非常適合它。CLUSTALX和PHYLIP軟件能夠?qū)崿F(xiàn)上述的建樹步驟。CLUSTALX是Windows界面下的多重序列比對軟件。PHYLIP是多個(gè)軟件的壓縮包，功能極其強(qiáng)大，主要包括五個(gè)方面的功能軟件：i，DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。ii，序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對距離數(shù)據(jù)分析的軟件。 iii，對基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。iv，把序列的每個(gè)堿基/氨基酸獨(dú)立看待（堿基/氨

6、基酸只有0和1的狀態(tài)）時(shí)，對序列進(jìn)行分析的軟件。v，按照DOLLO簡約性算法對序列進(jìn)行分析的軟件。vi，繪制和修改進(jìn)化樹的軟件?！緦?shí)驗(yàn)內(nèi)容】1、使用CLUSTALX軟件對已知八條DNA序列（如下）進(jìn)行多重序列比對；M._mulatta   AAGCTTTTCT GGCGCAACCA TCCTCATGAT TGCTCACGGA CTCACCTCTTM._fascicu   AAGCTTCTCC GGCGCAACCA CCCTTATAAT CGCCCACGGG CTCACCTCTTM._sylvanu   AAGCTTCTCC GGTGC

7、AACTA TCCTTATAGT TGCCCATGGA CTCACCTCTTHomo_sapie   AAGCTTCACC GGCGCAGTCA TTCTCATAAT CGCCCACGGG CTTACATCCTGorilla      AAGCTTCACC GGCGCAGTTG TTCTTATAAT TGCCCACGGA CTTACATCATPongo        AAGCTTCACC GGCGCAACCA CCCTCATGAT TGCCCATGGA C

8、TCACATCCTSaimiri_sc   AAGCTTCACC GGCGCAATGA TCCTAATAAT CGCTCACGGG TTTACTTCGTLemur_catt   AAGCTTCATA GGAGCAACCA TTCTAATAAT CGCACATGGC CTTACATCAT2、使用PHYLIP 軟件包構(gòu)建上述DNA分子系統(tǒng)發(fā)生樹。【實(shí)驗(yàn)方法】一、用CLUSTALX軟件對已知DNA序列做多序列比對。操作步驟：1、以FASTA格式準(zhǔn)備8個(gè)DNA序列test.seq（或txt）文件。2、雙擊進(jìn)入CLUSTALX程序，點(diǎn)FILE進(jìn)入LOAD SEQU

9、ENCE，打開test.seq（或txt）文件。3、點(diǎn)ALIGNMENT，在默認(rèn)alignment parameters下，點(diǎn)擊Do complete Alignment 。在新出現(xiàn)的窗口中點(diǎn)擊ALIGN進(jìn)行比對，這時(shí)輸出兩個(gè)文件（默認(rèn)輸出文件格式為Clustal格式）：比對文件test.aln和向?qū)湮募est.dnd。4、點(diǎn)FILE進(jìn)入Save sequence as,在format 框中選PHYLIP，文件在PHYLIP軟件目錄下以test.phy存在，點(diǎn)擊OK。5、將PHYLIP軟件目錄下的test.phy文件拷貝到EXE文件夾中。用計(jì)事本方式打開的test.phy文件的部分序列如下

10、：圖中的8和50分別表示8個(gè)序列和每個(gè)序列有50個(gè)堿基。二、用PHYLIP軟件推導(dǎo)進(jìn)化樹。1、進(jìn)入EXE文件夾，點(diǎn)擊SEQBOOT軟件輸入test.phy文件名，回車。圖中的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項(xiàng)，鍵入這些字母，程序的條件就會(huì)發(fā)生改變。D選項(xiàng)無須改變。J選項(xiàng)有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法對進(jìn)化樹進(jìn)行評估，所謂Bootstraping法就是從整個(gè)序列的堿基（氨基酸）中任意選取一半，剩下的一半序列隨機(jī)補(bǔ)齊組成一個(gè)新的序列。這樣，一個(gè)序列就可以變成了許多序列。一個(gè)多序列組也就可以變成許多個(gè)

11、多序列組。根據(jù)某種算法（最大簡約性法、最大可能性法、除權(quán)配對法或鄰位相連法）每個(gè)多序列組都可以生成一個(gè)進(jìn)化樹。將生成的許多進(jìn)化樹進(jìn)行比較，按照多數(shù)規(guī)則（majority-rule）我們就會(huì)得到一個(gè)最"逼真"的進(jìn)化樹。Jackknife則是另外一種隨機(jī)選取序列的方法。它與Bootstrap法的區(qū)別是不將剩下的一半序列補(bǔ)齊，只生成一個(gè)縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R選項(xiàng)讓使用者輸入republicate的數(shù)目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個(gè)多序列組。根據(jù)多

12、序列中所含的序列的數(shù)目的不同可以選取不同的republicate，此處選200，輸入Y確認(rèn)參數(shù)并在Random number seed (must be odd) ?的下面輸入一個(gè)奇數(shù)（比如3）。當(dāng)我們設(shè)置好條件后按回車，程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生一個(gè)文件outfile，Outfile用記事本打開如下：這個(gè)文件包括了200個(gè)republicate。2、 文件outfile改為infile。點(diǎn)擊DNADIST程序。選項(xiàng)M是輸入剛才設(shè)置的republicate的數(shù)目，輸入D選擇data sets，輸入200。設(shè)置好條件后，輸入Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生ou

13、tfile，部分內(nèi)容如下：將outfile文件名改為infile，為避免與原先infile文件重復(fù)，將 原先文件名改為infile1。3、EXE文件夾中選擇通過距離矩陣推測進(jìn)化樹的算法，點(diǎn)擊NEIGHBOR程序。輸入M更改參數(shù)，輸入D選擇data sets。輸入200。輸入奇數(shù)種子3。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生outfile和outtree兩個(gè)結(jié)果輸出。outtree文件是一個(gè)樹文件，可以用treeview等軟件打開。outfile是一個(gè)分析結(jié)果的輸出報(bào)告，包括了樹和其他一些分析報(bào)告，可以用記事本直接打開。部分內(nèi)容如下：4、將outtree文件名改為intree，點(diǎn)擊DRAWTREE程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)Tree Preview圖。5、點(diǎn)擊DRAWGRAM程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認(rèn)參數(shù)。程序開始運(yùn)行，并出現(xiàn)Tree Preview圖。6、將EXE文件夾中的outfile文件名改為outfile1，以避免被新生成的outfile 文件覆蓋。點(diǎn)擊CONSENSE程序。輸入Y確認(rèn)設(shè)置。E