多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹的構建

1、多重序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹的構建來源：生物谷  2010-1-8   訪問量：6568評論(0)分享0【實驗目的】1、熟悉構建分子系統(tǒng)發(fā)生樹的基本過程，獲得使用不同建樹方法、建樹材料和建樹參數(shù)對建樹結果影響的正確認識；2、掌握使用Clustalx進行序列多重比對的操作方法；3、掌握使用Phylip軟件構建系統(tǒng)發(fā)生樹的操作方法。【實驗原理】在現(xiàn)代分子進化研究中，根據(jù)現(xiàn)有生物基因或物種多樣性來重建生物的進化史是一個非常重要的問題。一個可靠的系統(tǒng)發(fā)生的推斷，將揭示出有關生物進化過程的順序，有助于我們了解生物進化的歷史和進化機制。對于一個完整的進化樹分析需要以下幾

2、個步驟： 要對所分析的多序列目標進行比對（alignment）。 要構建一個進化樹（phyligenetic tree）。構建進化樹的算法主要分為兩類：獨立元素法（discrete character methods）和距離依靠法（distance methods）。所謂獨立元素法是指進化樹的拓撲形狀是由序列上的每個堿基/氨基酸的狀態(tài)決定的（例如：一個序列上可能包含很多的酶切位點，而每個酶切位點的存在與否是由幾個堿基的狀態(tài)決定的，也就是說一個序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點狀態(tài)，當多個序列進行進化樹分析時，進化樹的拓撲形狀也就由這些堿基的狀態(tài)決定了）。而距離依靠法是指進化樹的拓撲形狀由兩兩序列

3、的進化距離決定的。進化樹枝條的長度代表著進化距離。獨立元素法包括最大簡約性法（Maximum Parsimony methods）和最大可能性法（Maximum Likelihood methods）；距離依靠法包括除權配對法（UPGMAM）和鄰位相連法（Neighbor-joining）。 對進化樹進行評估，主要采用Bootstraping法。進化樹的構建是一個統(tǒng)計學問題，我們所構建出來的進化樹只是對真實的進化關系的評估或者模擬。如果我們采用了一個適當?shù)姆椒ǎ敲此鶚嫿ǖ倪M化樹就會接近真實的"進化樹"。模擬的進化樹需要一種數(shù)學方法來對其進行評估。不同的算法有不同的適用目標

4、。一般來說，最大簡約性法適用于符合以下條件的多序列：i 所要比較的序列的堿基差別小，ii 對于序列上的每一個堿基有近似相等的變異率，iii 沒有過多的顛換/轉(zhuǎn)換的傾向，iv 所檢驗的序列的堿基數(shù)目較多（大于幾千個堿基）；用最大可能性法分析序列則不需以上的諸多條件，但是此種方法計算極其耗時。如果分析的序列較多，有可能要花上幾天的時間才能計算完畢。UPGMAM（Unweighted pair group method with arithmetic mean）假設在進化過程中所有核苷酸/氨基酸都有相同的變異率，也就是存在著一個分子鐘。這種算法得到的進化樹相對來說不是很準確，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。鄰位相

5、連法是一個經(jīng)常被使用的算法，它構建的進化樹相對準確，而且計算快捷。其缺點是序列上的所有位點都被同等對待，而且，所分析的序列的進化距離不能太大。另外，需要特別指出的是對于一些特定多序列對象來說可能沒有任何一個現(xiàn)存算法非常適合它。CLUSTALX和PHYLIP軟件能夠?qū)崿F(xiàn)上述的建樹步驟。CLUSTALX是Windows界面下的多重序列比對軟件。PHYLIP是多個軟件的壓縮包，功能極其強大，主要包括五個方面的功能軟件：i，DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)的分析軟件。ii，序列數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變成距離數(shù)據(jù)后，對距離數(shù)據(jù)分析的軟件。 iii，對基因頻率和連續(xù)的元素分析的軟件。iv，把序列的每個堿基/氨基酸獨立看待（堿基/氨

6、基酸只有0和1的狀態(tài)）時，對序列進行分析的軟件。v，按照DOLLO簡約性算法對序列進行分析的軟件。vi，繪制和修改進化樹的軟件?！緦嶒瀮?nèi)容】1、使用CLUSTALX軟件對已知八條DNA序列（如下）進行多重序列比對；M._mulatta   AAGCTTTTCT GGCGCAACCA TCCTCATGAT TGCTCACGGA CTCACCTCTTM._fascicu   AAGCTTCTCC GGCGCAACCA CCCTTATAAT CGCCCACGGG CTCACCTCTTM._sylvanu   AAGCTTCTCC GGTGC

7、AACTA TCCTTATAGT TGCCCATGGA CTCACCTCTTHomo_sapie   AAGCTTCACC GGCGCAGTCA TTCTCATAAT CGCCCACGGG CTTACATCCTGorilla      AAGCTTCACC GGCGCAGTTG TTCTTATAAT TGCCCACGGA CTTACATCATPongo        AAGCTTCACC GGCGCAACCA CCCTCATGAT TGCCCATGGA C

8、TCACATCCTSaimiri_sc   AAGCTTCACC GGCGCAATGA TCCTAATAAT CGCTCACGGG TTTACTTCGTLemur_catt   AAGCTTCATA GGAGCAACCA TTCTAATAAT CGCACATGGC CTTACATCAT2、使用PHYLIP 軟件包構建上述DNA分子系統(tǒng)發(fā)生樹。【實驗方法】一、用CLUSTALX軟件對已知DNA序列做多序列比對。操作步驟：1、以FASTA格式準備8個DNA序列test.seq（或txt）文件。2、雙擊進入CLUSTALX程序，點FILE進入LOAD SEQU

9、ENCE，打開test.seq（或txt）文件。3、點ALIGNMENT，在默認alignment parameters下，點擊Do complete Alignment 。在新出現(xiàn)的窗口中點擊ALIGN進行比對，這時輸出兩個文件（默認輸出文件格式為Clustal格式）：比對文件test.aln和向?qū)湮募est.dnd。4、點FILE進入Save sequence as,在format 框中選PHYLIP，文件在PHYLIP軟件目錄下以test.phy存在，點擊OK。5、將PHYLIP軟件目錄下的test.phy文件拷貝到EXE文件夾中。用計事本方式打開的test.phy文件的部分序列如下

10、：圖中的8和50分別表示8個序列和每個序列有50個堿基。二、用PHYLIP軟件推導進化樹。1、進入EXE文件夾，點擊SEQBOOT軟件輸入test.phy文件名，回車。圖中的D、J、R、I、O、1、2代表可選擇的選項，鍵入這些字母，程序的條件就會發(fā)生改變。D選項無須改變。J選項有三種條件可以選擇，分別是Bootstrap、Jackknife和Permute。文章上面提到用Bootstraping法對進化樹進行評估，所謂Bootstraping法就是從整個序列的堿基（氨基酸）中任意選取一半，剩下的一半序列隨機補齊組成一個新的序列。這樣，一個序列就可以變成了許多序列。一個多序列組也就可以變成許多個

11、多序列組。根據(jù)某種算法（最大簡約性法、最大可能性法、除權配對法或鄰位相連法）每個多序列組都可以生成一個進化樹。將生成的許多進化樹進行比較，按照多數(shù)規(guī)則（majority-rule）我們就會得到一個最"逼真"的進化樹。Jackknife則是另外一種隨機選取序列的方法。它與Bootstrap法的區(qū)別是不將剩下的一半序列補齊，只生成一個縮短了一半的新序列。Permute是另外一種取樣方法，其目的與Bootstrap和Jackknife法不同，這里不再介紹。R選項讓使用者輸入republicate的數(shù)目。所謂republicate就是用Bootstrap法生成的一個多序列組。根據(jù)多

12、序列中所含的序列的數(shù)目的不同可以選取不同的republicate，此處選200，輸入Y確認參數(shù)并在Random number seed (must be odd) ?的下面輸入一個奇數(shù)（比如3）。當我們設置好條件后按回車，程序開始運行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生一個文件outfile，Outfile用記事本打開如下：這個文件包括了200個republicate。2、 文件outfile改為infile。點擊DNADIST程序。選項M是輸入剛才設置的republicate的數(shù)目，輸入D選擇data sets，輸入200。設置好條件后，輸入Y確認參數(shù)。程序開始運行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生ou

13、tfile，部分內(nèi)容如下：將outfile文件名改為infile，為避免與原先infile文件重復，將 原先文件名改為infile1。3、EXE文件夾中選擇通過距離矩陣推測進化樹的算法，點擊NEIGHBOR程序。輸入M更改參數(shù)，輸入D選擇data sets。輸入200。輸入奇數(shù)種子3。輸Y確認參數(shù)。程序開始運行，并在EXE文件夾中產(chǎn)生outfile和outtree兩個結果輸出。outtree文件是一個樹文件，可以用treeview等軟件打開。outfile是一個分析結果的輸出報告，包括了樹和其他一些分析報告，可以用記事本直接打開。部分內(nèi)容如下：4、將outtree文件名改為intree，點擊DRAWTREE程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認參數(shù)。程序開始運行，并出現(xiàn)Tree Preview圖。5、點擊DRAWGRAM程序，輸入font1文件名，作為參數(shù)。輸Y確認參數(shù)。程序開始運行，并出現(xiàn)Tree Preview圖。6、將EXE文件夾中的outfile文件名改為outfile1，以避免被新生成的outfile 文件覆蓋。點擊CONSENSE程序。輸入Y確認設置。E