預(yù)測的SARS冠狀病毒刺突蛋白S2亞基B細(xì)胞表位肽在大腸桿菌中的表

1、猜測的SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基B細(xì)胞表位肽在大腸桿菌中的表馮宇,萬敏,王宣軍,張培因,于永利,王麗穎【關(guān)鍵詞】SARS冠狀病毒刺突卵白;,B細(xì)胞表位猜測;,朋友10分子;,S2亞基ExpressinfpreditedBellepitpepeptideinS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEininE.liandidentifiatinfitsiiantigeniityKeyrdsSARSspikeprtein;Bellepitpepreditin;haperne10;S2subunit摘要目的:研究猜測的SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基B細(xì)胞表位肽在大腸桿菌中

2、的表達(dá)及其模擬S2卵白的抗原性。要領(lǐng):用DNAStar軟件對S2亞基序列舉行闡發(fā),猜測B細(xì)胞表位地點(diǎn)肽段。通過4輪PR反響人工搭建猜測表位DNA序列并克隆到含有朋友10基因的pET28a(+)載體中,組成重組載體pET28hap10S2epi。重組卵白hap10S2epi在E.liBL21(DE3)中表達(dá)并以SDSPAGE和esternblt舉行斷定。用純化的hap10S2epi免疫家兔制備抗血清,并通過ELISA斷定hap10S2epi的抗原性。結(jié)果:樂成構(gòu)建并在大腸桿菌中表達(dá)了hap10S2pei交融卵白。hap10S2epi免疫的抗血清能識別真核細(xì)胞表達(dá)的SARS冠狀病毒全長S2刺突卵白

3、。結(jié)論:猜測的SARS冠狀病毒S2刺突卵白B細(xì)胞表位肽可以或許誘導(dǎo)家兔產(chǎn)生針對S2卵白的抗體,為研制抗SARS病毒基因工程疫苗奠基了基矗關(guān)鍵詞SARS冠狀病毒刺突卵白;B細(xì)胞表位猜測;朋友10分子;S2亞基SARS冠狀病毒刺突卵白spikeprtein是組成病毒衣殼突起的重要布局卵白,在病毒侵襲宿主細(xì)胞歷程中發(fā)揮緊張生物學(xué)成效:與宿主細(xì)胞外貌受體結(jié)合,并介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜交融使病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞1,2。S卵白由S1、S2兩個亞基組成,此中S2亞基序列相對守舊并到場病毒與宿主細(xì)胞膜交融歷程,被以為是產(chǎn)生中和性抗體的緊張抗原區(qū)3,4。因此,S2卵白與SARS病毒的高度易感性嚴(yán)密相干。為進(jìn)一步探究S

4、2卵白成效,本研究中利用分子生物學(xué)軟件對S2卵白的B細(xì)胞表位舉行了多參數(shù)猜測,并按照猜測結(jié)果用人工合成的要領(lǐng)構(gòu)建了朋友10S2表位肽交融基因,在E.liBL21(DE3)中表達(dá)的表位肽交融卵白與真核表達(dá)的全長S2卵白有部門配合的抗原性,這為進(jìn)一步研究S2卵白成效及研制抗SARS病毒疫苗打下了基矗1質(zhì)料和要領(lǐng)1.1質(zhì)料ERI、NI及HindIII購于寶泰克生物公司。DNA聚合酶、T4DNA毗連酶購自美國Prega公司。抗組氨酸單克隆抗體Ab、HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗鼠IgG、HRP標(biāo)識表記標(biāo)幟的羊抗兔IgG、卡那霉素、氨芐青霉素及IPTG均購自Siga公司。硝酸纖維素膜N購自美國Shleiher

5、Shuell公司。pET表達(dá)體系購自美國Nvagen公司。載體pD18T購于大連寶生物生物工程公司。DNA接納試劑盒購自鼎國公司。E.liJ109、BL21由本室保存。用于擴(kuò)增S2基因的引物由上海生工生物工程公司合成。1.2要領(lǐng)2結(jié)果2.1B細(xì)胞表位的猜測及DNA段的構(gòu)建用DNAStar對SARS病毒基因序列編號為AY707461S2卵白中大概B細(xì)胞表位舉行猜測,綜合闡發(fā)種種參數(shù),選擇抗原指數(shù)大于0,親水性指數(shù)大于0,氨基酸位于卵白分子外貌大概性大于1而且相近柔性布局的氨基酸區(qū)段作為猜測的B細(xì)胞表位。末了選擇位于S2卵白N端第5-122個氨基酸區(qū)段作為包羅猜測B細(xì)胞表位的區(qū)段舉行克隆構(gòu)建圖1。

6、圖1S2卵白親水性地區(qū)、抗原指數(shù)、氨基酸外貌大概性及二級布局柔性地區(qū)闡發(fā)略Fig1TheultiparaeterpreditinfS2subunitfSARSrnavirusspikeprtEin2.2hapS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建與斷定按照表位猜測結(jié)果方案4對PR引物,從中心向兩頭顛末4輪PR反響合成400bp擺布的SARS冠狀病毒S2卵白區(qū)大概的B細(xì)胞表位編碼基因定名為S2epi圖2,并經(jīng)DNA序列闡發(fā)無誤。將S2epi基因克隆到pET28分子朋友10hap10質(zhì)粒的序列的hap10基因卑劣,構(gòu)建成pET28hap10S2epi交融基因重組質(zhì)粒,經(jīng)ERI與HindIII酶切電泳后可見一巨細(xì)為40

7、0bp擺布的片斷圖3。圖2PR法搭建S2epi基因片斷的電泳圖略Fig2nstrutinfS2epigenebyPR:DNAarker;1:PRprdut.圖3pEThap10S2epi重組質(zhì)粒酶切斷定略Fig3nstrutinfpET28ahap10S2epirebinantvetr:DNAarker;1:pET28ahap10S2epirebinantvetrdigestedbyERIandHindIII;2:pET28aplasiddigestedbyERIandHindIII.2.3重組hap10S2epi卵白的表達(dá)與純化將轉(zhuǎn)化pET28hap10S2epi重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(

8、DE3)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)3h后超聲裂解,經(jīng)SDSPAGE斷定,重組卵白為可溶性表達(dá)圖4中1和2泳道。裂菌所得上清經(jīng)鎳親和層析及G25除鹽純化后得到表不雅相對分子質(zhì)量(r)約為30000的卵白圖4,與理論盤算推測的重組卵白r符合。圖4hap10S2epi卵白的表達(dá)純化略Fig4Expressinandpurifiatinfhap10S2epifusinprtein1:BL21(DE3)induedfr3h;2:BL21(DE3)uninduedLane;3:hap10S2epidesaltedbySephadexG25;4:hap10S2epipreparatinprirtdesalting;5:

9、BreakthrughfratinfrNiSepharseFFlun;6:FratinselutedfrNiSepharseFFlun;:Lleulareightarker.2.4重組hap10S2epi卵白的esternblt斷定用抗Histag的Ab對SDSPAGE電泳闡發(fā)的重組hap10S2epi卵白舉行esternblt斷定,結(jié)果表現(xiàn):pET28hap10S2epi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的表達(dá)菌出現(xiàn)了陽性條帶,而pET28空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌無反響條帶圖5。圖5hap10S2epi基因交融表達(dá)產(chǎn)物的esternblt斷定略Fig5Identifiatinfhap10S2epibyesternblt1:B

10、L21(DE3)harbringpET28aplasid;2:BL21(DE3)harbringpET28hap10S2epiplasid.2.5hap10S2epi重組卵白的免疫原性斷定用全長S2卵白作為檢測抗原,接納ELISA法檢測hap10S2epi卵白免疫的家兔血清中抗SARS冠狀病毒S2卵白抗體的程度,結(jié)果表現(xiàn):家兔血清1100、1200、1400稀釋組A492值大于陰性比較組A492值2倍圖6,說明家兔血清中含有能識別SARS病毒S2卵白的抗體。圖6hap10S2epi的卵白免疫原性斷定略Fig6Identifiatintheiungeniityfhap10S2epi3討論病毒中和

11、性B細(xì)胞抗原表位簡直定對SARS的診斷、疫苗分子方案及免疫干預(yù)治療至關(guān)緊張。SARS是由冠狀病毒引起的一種急性感抱病,在SARS治療歷程中,利用病愈病人血清獲得了必然的療效,必定了中和性抗體在SARS治療及防范中的作用,但利用病愈病人血清結(jié)果并不不變,而且存在埋伏的寧靜性題目。本研究按照B細(xì)胞表位特性,先猜測抗原表位,通過人工合成的要領(lǐng)構(gòu)建出SARS冠狀病毒刺突卵白S2亞基DNA,在大腸桿菌中表達(dá)后利用金屬鏊合層析純化得到朋友10S2表位交融卵白hap10S2epi,制止了從SARS患者構(gòu)造或體液提取DNA的不寧靜性,是一種經(jīng)濟(jì)、省時、省力的要領(lǐng)。應(yīng)用種種相干軟件對卵白質(zhì)的布局和特性舉行猜測,

12、特殊是表位猜測,在醫(yī)學(xué)、生物范疇里都得到了證明5。在對SARS病毒S2卵白氨基酸序列闡發(fā)的歷程中,我們創(chuàng)造病毒S2卵白N端5122個氨基酸序列片斷表現(xiàn)多種要領(lǐng)猜測的同等性,該地區(qū)具有較好的親水性和可及性,在二級布局上那么含有不規(guī)矩卷曲和轉(zhuǎn)角布局,這些特點(diǎn)與卵白質(zhì)抗原決定簇的布局特點(diǎn)符合6。在隨后的ELISA實(shí)行中,由交融卵白制備的抗血清與酵母表達(dá)的S2完備卵白相結(jié)合,證明了我們所猜測的B細(xì)胞表位的正確性。更進(jìn)一步的實(shí)行可以利用SARS活病毒舉行病毒中和實(shí)行,確定此地區(qū)中是否含有中和性的B細(xì)胞表位。分子朋友10hap10為一r10000的卵白,屬于熱休克卵白家屬中的成員,是HSP60的共朋友分子

13、,一同到場卵白的折疊。分子朋友被界說為能結(jié)合和不變另一卵白質(zhì)不不變構(gòu)象異構(gòu)體的一組卵白質(zhì),并通過結(jié)合和開釋,在體內(nèi)可利于其他卵白質(zhì)的準(zhǔn)確組裝、折疊、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)及錯誤折疊卵白質(zhì)的落解7。真核細(xì)胞卵白在原核細(xì)胞中表達(dá)時每每形成不成溶的包容體。以包容體情勢存在的卵白由于沒有有準(zhǔn)確的三級布局,以是不具有相應(yīng)的生物學(xué)活性。從包容體中提取活性卵白要顛末繁瑣的包容體制備、溶解、純化、重折疊等歷程,這不單增長了卵白質(zhì)純化歷程的難度而且每每活性卵白得率很低8。在本研究中,S2表位卵白與分子朋友10形成的交融卵白在大腸桿菌中以可溶的情勢表達(dá),利用交融卵白端所帶有的六聚組氨酸純化標(biāo)簽可以一步親和層析純化得到較高純度的

14、S2卵白舉行后續(xù)的卵白質(zhì)成效研究,制止了龐大的包容體純化歷程。而且由于hap10S2epi卵白N端的分子朋友10的存在,進(jìn)步了卵白的表達(dá)程度,使得交融卵白表達(dá)程度占菌體總卵白的40%擺布。綜上所述,我們通過對SARS病毒S2卵白氨基酸序列的闡發(fā),猜測了S2卵白中B細(xì)胞表位地點(diǎn)肽段,然后接納人工合成基因的方法用PR法構(gòu)建出該肽段的DNA片斷,再將該肽段與朋友10分子在大腸桿菌中舉行交融表達(dá),并用純化后的交融卵白免疫動物制備多克隆抗體,末了應(yīng)用ELISA法確定產(chǎn)生的抗體可與酵母表達(dá)的完備S2卵白結(jié)合,證明了所猜測B表位的準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究SARS病毒S2卵白的成效及研制抗SARS病毒基

15、因工程疫苗打下了基矗參考文獻(xiàn):1TanYJ,LiSG,HngJ.haraterizatinfviralprteinsendedbytheSARSrnavirusgeneJ.AntiviralResearh,2022,65(2):69-78.2梅林,李京,閆婕,等.SARS冠狀病毒編碼卵白質(zhì)及其基因闡發(fā)的研究希望J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2022,20(1):126-128.3LiP,GldanN.PhylgenisandbiinfratisfSARSVJ.TRENDSirbi,2022,12(3):106-111.4秦宇,李梅,劉中華,等.抗sarsV重組纖突卵白單克隆抗體的制備和斷定J.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2022,21(5):611-612.5楊清武,朱佩芳,王正國,等.人TLR4的B細(xì)胞上風(fēng)表位方案、合成及其免疫原性檢測J.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2002,22(4):362.6KauayaPT,radSF,DiGergerA,etal.Glysylatindepedentpeptideantigeni