第五節(jié)藻類和原生動(dòng)物

1、第五節(jié) 藻類和原生動(dòng)物 最初，藻類和原生動(dòng)物分別被看作是低等植物和低等動(dòng)物。主要依據(jù)它們的營(yíng)養(yǎng)方式進(jìn)行鑒別，藻類具有葉綠體，營(yíng)養(yǎng)方式為光能自養(yǎng)（photoautotrophic）；原生動(dòng)物則依靠吞噬營(yíng)養(yǎng)（phagotrophic）或滲透營(yíng)養(yǎng)（osmotrophic）。然而，藻類和原生動(dòng)物之間的區(qū)別從來就沒有完全弄清楚。過于20多年中，對(duì)于單細(xì)胞真核生物（algae、protozoa、lower fungi）的進(jìn)化和系統(tǒng)學(xué)研究異常活躍。在這一時(shí)期，許多分類學(xué)的界限被打破，建立了新的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。1 盡管藻類和原生動(dòng)物沒有真正的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系，但一些研究者還是將它們稱為原生生物（proti

2、sts）或protoctists。而另一些研究者提出的分類系統(tǒng)中，雖然對(duì)某些定義和界限作了很大的修改，仍保留了原生動(dòng)物界（Protozoa），而藻類則分屬于幾個(gè)不同的界：植物界（Plantae）、Chromista和原生動(dòng)物界（Protozoa）。2盡管如此，“藻類”和“原生動(dòng)物”在功能和生態(tài)學(xué)意義上仍然是非常有用的，分別定義為光能自養(yǎng)原生生物（photoautotrophic protists）和異養(yǎng)原生生物（heterotrophic protists）。此外, 還要介紹另一群原核生物藍(lán)細(xì)菌（cyanobacteria）培養(yǎng)問題。藻類和原生動(dòng)物都是水生生物。盡管在陸生環(huán)境中（如土壤），也普

3、遍存在藻類和原生動(dòng)物，地衣則是藻類和真菌的共生體，但是必須有充足的水分，它們才能活動(dòng)。3藻類和原生動(dòng)物在水生環(huán)境中的生態(tài)學(xué)重要性正日益被人們所認(rèn)識(shí)。如在許多水生環(huán)境中，藻類是主要的初級(jí)生產(chǎn)者（primary producer），在海洋水體中，占總生物量和初級(jí)生產(chǎn)力的80%。藻類還是水體質(zhì)量的重要指示生物（bioinducer），用于評(píng)估和監(jiān)測(cè)水體系統(tǒng)的健康狀況。4另一方面，需要特別關(guān)注的是，當(dāng)藻類密度達(dá)到一定值時(shí)，足以形成表面浮膜或引起飲用水變味。水華（藻華）（algal bloom），尤其是微囊藻屬（Microcystis）、顫藻屬（Oscillatora）以及其他屬的一些產(chǎn)毒素的藍(lán)細(xì)菌形成

4、的水華，嚴(yán)重影響到水體的質(zhì)量，尤其是飲用水供應(yīng)部門所要面對(duì)的一個(gè)嚴(yán)重問題。5原生動(dòng)物在海洋食物鏈中是初級(jí)生產(chǎn)者的主要消費(fèi)者；同時(shí)又是浮游生物（plankters）的重要食物資源。在沙土、沉積物、有機(jī)物污染的水體以及好氧廢水處理工藝中，原生動(dòng)物是微型藻和細(xì)菌的最主要的消費(fèi)者。它們也是有機(jī)物污染和廢水質(zhì)量的指示生物。此外，海洋原生動(dòng)物形成的赤潮（red tides），伴隨著產(chǎn)生環(huán)境毒理生物學(xué)問題。6要對(duì)上述問題進(jìn)行深入的研究，必須對(duì)有關(guān)的藻類和原生動(dòng)物進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定，而鑒定工作常常取決于在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)這些生物的能力。獲得藻類和原生動(dòng)物的純培養(yǎng)是對(duì)其進(jìn)行基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究和開發(fā)利用的基礎(chǔ)。7一、 分

5、離方法（Isolation Methods） 富集（enrichment）：將一個(gè)野外樣品（field sample）接種到一個(gè)等體積或更大體積的合適培養(yǎng)基中，然后在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這樣通過在不同培養(yǎng)基中，進(jìn)行一系列不同的平行接種，就可將不同的生物選擇出來。81）固氮藍(lán)細(xì)菌（nitrogen-fixing cyanobacteria）的富集：將樣品接種于合適的缺乏氮源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基（mineral medium）中，如BG11中不加NaNO3（see Table2），就可以選擇出固氮藍(lán)細(xì)菌（nitrogen-fixing cyanobacteria）； 2）食細(xì)菌原生動(dòng)物（bacteri

6、vorous protozoa）的富集：添加蒸煮的大麥、小麥、大米等谷粒，促進(jìn)細(xì)菌的生長(zhǎng)，為原生動(dòng)物提供食物。 3）富集并不能保證獲得單一原生生物的培養(yǎng)物，但可以增加目標(biāo)生物的細(xì)胞數(shù)量，有助于對(duì)其進(jìn)一步的分離。9 稀釋（dilution）：從某種原生生物占優(yōu)勢(shì)的樣品中分離該生物， 稀釋法是最有效的。用合適的培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行系列稀釋，然后在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。在最大稀釋度的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)的生物很可能就是單一原生生物。 但稀釋法并不能保證獲得的培養(yǎng)物是純系的（clonal），更不可能獲得一個(gè)純菌株（axenic strain）。10 物理方法（physical mathods）：1） 顯微操作法：

7、在解剖顯微鏡下，選擇原生生物的個(gè)體單元，用薄壁毛細(xì)移液管轉(zhuǎn)移到一個(gè)無菌的培養(yǎng)基中，在適宜環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng)。這種方法適合于多種原生生物，特別是那些體積大、移動(dòng)慢的原生生物的分離。然而這種方法需要技巧和耐心，而且不適于體積微小的原生生物的分離。11 通常，進(jìn)行一次操作，并不一定能獲得一個(gè)單一的純培養(yǎng)物，可以對(duì)已分離的細(xì)胞進(jìn)行洗滌和二次轉(zhuǎn)移，多次反復(fù)，就能成功地獲得純培養(yǎng)（axenic culture）。12對(duì)于一些體積小、能移動(dòng)的原生生物，可以利用顯微操作器（micromanipulator）和瓊脂孔穴通道分離技術(shù)相結(jié)合進(jìn)行分離。 2）其他物理方法：選擇性過濾（selective filtrat

8、ion）、硅酮油平板法（silicone oil plating）、密度梯度離心（density gradient centrifugation）和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)（flow cytometry）。13 瓊脂平板法（agar plating）：主要用于藻類、阿米巴（變形蟲）和某些鞭毛藻的分離。14二、 保藏方法（Maintenance Mehtods）1. 藻類(algae)培養(yǎng)基和保藏方式的選擇取決于藻類分離物(isolates)的營(yíng)養(yǎng)需求和當(dāng)?shù)氐目衫玫脑腺Y源。1）培養(yǎng)基（Media） BG11（blue-green algalcyanobacterial medium）（Table2）：

9、為分離和培養(yǎng)藍(lán)細(xì)菌而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，也適合于多種真核微型藻（eukaryotic microalgae）的培養(yǎng)。15 JM（Jaworkis medium）（Table3）: 適合于多種淡水和陸生真核藻類的培養(yǎng)。如果在該培養(yǎng)基中添加57g/L NaSiO3.9H2O，也可用于硅藻(diatoms)的保藏。若在該培養(yǎng)基中添加一定量的有機(jī)物（醋酸鈉和復(fù)雜氮源），就可用于培養(yǎng)混合營(yíng)養(yǎng)型和光能異養(yǎng)型藻類。16 GUI（Guilliards f/2 medium）: 用于培養(yǎng)多種海水微型藻.2) 定期傳代(periodic subculturing) 在保藏過程中,需要進(jìn)行定期的傳代培養(yǎng). 一般按0.5-

10、10%的接種量, 將接種物無菌轉(zhuǎn)移(aseptic transfer)到無菌培養(yǎng)基(sterile medium).173) 保藏條件( Maintenance conditions)最適溫度（optimal temperature）：絕大多數(shù)藻類的菌株可 以在15-20下保藏；對(duì)于一些分離自極端環(huán)境（extreme environments）的菌株，應(yīng)盡可能地采用與其環(huán)境一致的溫度進(jìn)行保藏；此外，特別要注意保藏溫度不能超過藻類的最高溫度（temperature maximum）。18 光照（light）：最好采用控溫光照培養(yǎng)箱（illuminated incubators）；用冷白熒光管，按

11、照16h-8h的明-暗方式（light-dark regime）進(jìn)行照射；來自北向窗子的自然光也是非常合適的。對(duì)光照水平也有一定的要求，大多數(shù)藻類的光照水平為50mol光子/m2s左右；而藍(lán)細(xì)菌的光照水平為25mol光子/m2s。192. 原生動(dòng)物(Protozoa) 1）培養(yǎng)基（culture media） 分為四種主要類型：植物浸汁（plant infusions）、土壤浸出物培養(yǎng)基（soil extract-based media）、無機(jī)鹽溶液（inorganic salt solutions）、 專一性培養(yǎng)基（specific media） （Table5）。20 植物浸汁（plant

12、 infusions）：植物浸汁用于培養(yǎng)食細(xì)菌鞭毛蟲（flagellates）和纖毛蟲（ciliates）。常用的植物材料有：大米、小麥或大麥粒、干草（hay）、萵苣（lettuce）、谷物葉子。用蒸餾水或無機(jī)鹽溶液, 按0.1-0.25%(wt/vol)的含量配制。特別要注意，植物材料的量不能過多，否則會(huì)促進(jìn)細(xì)菌的過渡生長(zhǎng)，而抑制原生動(dòng)物。對(duì)于一些海生原生動(dòng)物，植物浸汁可用天然或人工海水配制。21土壤浸出物培養(yǎng)基（soil extract-based media）：取1份風(fēng)干、過篩、pH7.0的土壤，加入到2份蒸餾水中，15lb/in2滅菌1h，然后放置一周，制備成土壤浸出物儲(chǔ)備液。使用時(shí)，

13、根據(jù)需要用蒸餾水或無機(jī)鹽溶液稀釋到3-10%（vol/vol），并添加一定量的谷?；蛱妓徕}。22 無機(jī)鹽溶液（inorganic salt solutions）：無機(jī)鹽溶液是一個(gè)離子平衡培養(yǎng)基，其離子組成適合于多種原生動(dòng)物的生長(zhǎng)。 但是，由于其缺乏有機(jī)營(yíng)養(yǎng)，因此，必須添加一些可食生物或供可食生物生長(zhǎng)的有機(jī)碳源。無機(jī)鹽溶液分為天然和人工合成的兩種類型，天然的無機(jī)鹽溶液有淡水、海水、礦泉水等，通過過濾，即可使用；人工合成的無機(jī)鹽溶液有Prescotts 和Jamess solutions .23 專一性培養(yǎng)基（specific media）：為特定目的而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，其最終目的是獲得原生動(dòng)物的純培養(yǎng)。目前，已經(jīng)獲得了許多原生動(dòng)物的純培養(yǎng)，如鞭毛蟲Astasia、Euglena、Chilomonas，纖毛蟲Tetrahymana、Paramecium。所用的培養(yǎng)基為限定培養(yǎng)基或半限定培養(yǎng)基。它們都含有相對(duì)較高濃度的可溶性有機(jī)碳源，以便