DB15T 2593-2022冰草組織培養(yǎng)技術規(guī)程

1、ICS65.020.20CCSB 2115 內 蒙 古 自 治 區(qū) 地 方 標 準DB15/T 25932022冰草組織培養(yǎng)技術規(guī)程Technical code of practice for tissue culture of agropyron cristatum2022-06-24 發(fā)布2022-07-24 實施內蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局發(fā) 布 DB15/T 25932022前言本文件按照GB/T 1.12020標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則的規(guī)定起草。 本文件由內蒙古自治區(qū)林業(yè)和草原局提出并歸口。 本文件起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所、內蒙古農(nóng)業(yè)大學。本文件主

2、要起草人：徐春波、王勇、趙海霞。 I DB15/T 25932022冰草組織培養(yǎng)技術規(guī)程范圍本文件規(guī)定了冰草組織培養(yǎng)的術語與定義、培養(yǎng)基、外植體、愈傷組織誘導培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)、分化培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、煉苗與移栽等基本內容及技術要求。 本文件適用于冰草組織培養(yǎng)育苗。 規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件， 僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。 GB/T 603 化學試劑 試驗方法中所用制劑及制品的制備NY/T 2306-2013 花卉種苗組培快繁技術規(guī)程 DB 15/T 1940

3、-2020 西部沙櫻組織培養(yǎng)技術規(guī)程 術語和定義NY/T 2306界定的術語和定義適用于本文件。 冰 草 agropyron cristatum (L.) gaertn屬于禾本科（Gramineae）冰草屬（Agropyron）多年生草本植物。 幼 穗 young ear生長2至5年、長度1 cm3 cm的冰草孕穗。種 子 seed有生活力、飽滿的包含內外稃的冰草種子。成熟胚 mature embryo 完熟期冰草種子的胚。 4 環(huán)境與器具滅菌1 DB15/T 25932022參照DB15/T 1940執(zhí)行。 5 培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基、1/2MS、改良MS培養(yǎng)基見附錄A。 母液的配制和

4、保存配制將常用試劑配制成50100倍的母液，按照GB/T 603規(guī)定方法配制。所用激素均配制濃度為0.5 mg/mL，配制方法詳見附錄B。 保存母液配制好分別貼上標簽，注明溶液名稱、配制倍數(shù)、配制日期、配制者。母液貯存在4 的冰箱中。貯藏時間在3個月之內，有霉菌和沉淀產(chǎn)生，則不得使用。 培養(yǎng)基的配制5.3.1 配 制蔗糖，攪拌溶解后再分別加入母液，攪拌均勻，加蒸餾水定容至1 L。 pH 值調節(jié)用1 mol/L的NaOH將配制好的培養(yǎng)基調到pH值5.86.0，用酸度計或精密pH試紙測定。 分裝和滅菌配制好的培養(yǎng)基趁熱分裝。分裝量以占培養(yǎng)容器的1/41/3為宜。切勿將培養(yǎng)基沾到瓶口和外壁上， 以免

5、招致雜菌污染。分裝后立即加蓋，不同的處理做好標記。分裝后進行滅菌，121 狀態(tài)下保持20 min。 6 外植體 外植體選擇幼穗或成熟胚。 外植體制備幼穗在超凈臺上用75%酒精脫脂棉球擦洗葉鞘表面消毒，剝出幼穗，切成0.3 cm0.5 cm的小段。 成熟胚2 配置1 L培養(yǎng)基時，先加蒸餾水600 ml700 ml，再加入7.5 g瓊脂，加熱攪拌瓊脂融化后加入25 gDB15/T 25932022種子用水浸泡2 h4 h后，剝去內外稃，置于濕濾紙上吸脹4 h。在超凈工作臺上75%酒精消毒30 s， 無菌水沖洗至少3次后用0.2%升汞消毒5 min，再用無菌水沖洗數(shù)次至少3次。置于鋪有濕無菌濾紙的培

6、養(yǎng)皿中，用解剖針從盾片處挑出胚。 7 愈傷組織誘導培養(yǎng)幼穗培養(yǎng)基幼穗愈傷組織誘導培養(yǎng)基為改良MS+2.0 mg/L 2，4-D。 接種將幼穗段接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每2.5 cm23 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件24 26 暗培養(yǎng)。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)20 d30 d。 成熟胚培養(yǎng)基成熟胚愈傷組織誘導培養(yǎng)基為MS0.2 mol/L甘露醇+ 2.0 mg/L 2，4-D。 接種將成熟胚接種在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每1.5 cm22 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件見本文件7.1.3。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)14 d20 d。 8 增殖培養(yǎng)幼穗

7、培養(yǎng)基幼穗增殖培養(yǎng)基為改良MS+2.0 mg/L2，4-D+0.2 mg/L 6BA。 接種3 DB15/T 25932022在超凈工作臺上，將誘導出的愈傷組織轉到增殖培養(yǎng)基上，每4 cm25 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件見7.1.3。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)40 d50 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 成熟胚培養(yǎng)基成熟胚增殖培養(yǎng)基為MS0.2 mol/L甘露醇+2.0 mg/L 2，4-D+0.3 mg/L ABA。 接種在超凈工作臺上，將誘導出的愈傷組織轉到增殖培養(yǎng)基上，每3 cm24 cm2接種1個，均勻擺放，封好皿口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件見7.1.3。 8.

8、2.4 培養(yǎng)時間培養(yǎng)40 d60 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 9 分化培養(yǎng)幼穗培養(yǎng)基幼穗分化培養(yǎng)基為MS+3.0 mg/L KT+0.5 mg/L NAA。 接種在超凈工作臺上，挑選狀態(tài)較好的胚性愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基，每5 cm26 cm2接種1個，均勻擺放，封好瓶口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件24 26 ，全天光照培養(yǎng)，光照強度3000 Lux4000 Lux。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)40 d60 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 成熟胚9.2.1 培養(yǎng)基4 DB15/T 25932022成熟胚分化培養(yǎng)基為MS3.0 mg/L KT1.0 mg/L NAA。 接種在超凈工作臺上，挑選狀態(tài)較好的胚性愈傷

9、組織轉入分化培養(yǎng)基，每5 cm26 cm2接種1個，均勻擺放，封好瓶口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件24 26 ，每天光照時間16 h，光照強度3000 Lux4000 Lux。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)60 d90 d；每20 d換1次培養(yǎng)基。 10 生根培養(yǎng) 幼穗培養(yǎng)基幼穗生根培養(yǎng)基為改良1/2 MS+0.1 mg/L NAA。 接種在超凈工作臺上，將長至3 cm4 cm的小苗逐一轉入生根培養(yǎng)基，每器皿接種1苗，封好瓶口，標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件見9.1.3。 培養(yǎng)時間培養(yǎng)20 d30 d。 成熟胚培養(yǎng)基成熟胚生根培養(yǎng)基為1/2 MS0.5 mg/L NAA。 接種在超凈工作臺上，將長至3 cm4 c

10、m的小苗逐一轉入生根培養(yǎng)基中，每器皿接種1苗，封好瓶口， 標明名稱和日期。 培養(yǎng)條件見9.2.3。培養(yǎng)時間培養(yǎng)20 d30 d。 5 DB15/T 2593202211 煉苗與移栽煉苗選擇生長健壯的組培苗，打開封口膜，放在自然光、室溫下2 d3 d。 基質營養(yǎng)土與蛭石1:1混合。經(jīng)高壓滅菌后裝入花盆備用。 移栽取出組培苗，洗掉培養(yǎng)基，栽入花盆，澆水，放入溫室，套上帶孔的塑料袋保濕，一周后取掉，適當保溫，常規(guī)管理。待苗長至20 cm30 cm移栽至大田。 6 DB15/T 25932022AA 附 錄 A（規(guī)范性） 基本培養(yǎng)基成分基本培養(yǎng)基成分見表A.1 。 表A.1 基本培養(yǎng)基成分類型 組分

11、MS 培養(yǎng)基 改良 MS 培養(yǎng)基 大量元素 KNO3 1900.0 1900.0 NH4NO3 1650.0 956.0 MgSO47H2O 370.0 370.0 KH2PO4 170.0 1160.0 CaCl22H2O 440.0 96.0 微量元素 MnSO44H2O 22.30 22.30 ZnSO47H2O 8.600 8.600 H3BO3 6.200 6.200 KI 0.830 0.830 Na2MoO46H2O 0.250 0.250 CuSO4.5H2O4 0.025 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 0.025 鐵鹽 Na2-EDTA 37.30 37.30 FeSO4.7H2O 27.80 27.80 有機物 甘氨酸 2.000 2.000 鹽酸吡哆辛 0.500 0.500 鹽酸硫銨素 0.100 2.000 煙酸 0.500 1.000 肌醇 100.0 100.0 尼克酸 - - 7 DB15/T 25932022BB 附 錄 B（規(guī)范性） 激素的配制激素配置方法見表B.1 。 表B.1 激素配置方法類別 名稱 配制方法 滅菌方式 存儲方式 生長素 2，4-