DB2301∕T 93-2021 高效大豆根瘤菌菌株篩選技術(shù)規(guī)程

1、 ICS 65.020.20DB2301CCS B 05黑龍江省哈爾濱市地方標(biāo)準(zhǔn)DB2301/T 932021高效大豆根瘤菌菌株篩選技術(shù)規(guī)程2021- 11-19發(fā)布2021-12-19實(shí)施 前 言本文件依據(jù)GB/T1.1-2020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。I 高效大豆根瘤菌菌株篩選技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了高效大豆根瘤菌菌株篩選技術(shù)規(guī)程的術(shù)語(yǔ)和定義、大豆根瘤菌獲得、大豆盆栽根瘤菌復(fù)篩、高效大豆根瘤菌田間驗(yàn)證和檔案管理。本文件適用于哈爾濱市田間高效大豆根瘤菌菌株篩選。2規(guī)范性引用文件列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的

2、引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB 3095GB 15618GB 20287NY 410環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用微生物菌劑根瘤菌肥料農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)（試行）NY/T 1536NY/T 1735SN/T 2632微生物肥料田間試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程及肥效評(píng)價(jià)指南根瘤菌生產(chǎn)菌株質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范微生物菌種常規(guī)保藏技術(shù)規(guī)程3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1高效大豆根瘤菌存活能力強(qiáng)、具有高效固氮能力、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)瘤能力，接種后使大豆顯著增產(chǎn)的大豆根瘤菌菌株。4大豆根瘤菌獲得4.1大豆品種選擇選擇當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)大豆品種。4

3、.2大豆根瘤采集在大豆盛花期時(shí)，選取葉色濃綠、生長(zhǎng)旺盛的大豆植株，將大豆根系挖出帶回實(shí)驗(yàn)室，用清水沖干凈后，選取 4至 6個(gè)新鮮的顆粒飽滿(mǎn)、深紅色的大根瘤（帶部分根）從根部分離。4.3大豆根瘤菌菌株分離與純化1 將采集的根瘤用0.1%升汞溶液表面滅菌3min，無(wú)菌水沖洗8次10次。在無(wú)菌條件下，用鑷子將根瘤壓碎，擠出汁液涂布在根瘤菌瓊脂培養(yǎng)基上，2628暗培養(yǎng)，快生菌培養(yǎng)3d4d，慢生菌培養(yǎng)5d 7d，將長(zhǎng)出的單菌落采用劃線(xiàn)培養(yǎng)法分離。根瘤菌瓊脂培養(yǎng)基配方應(yīng)符合NY 410中的規(guī)定。4.4大豆根瘤菌菌株確定肉眼觀(guān)察菌落一致、無(wú)雜菌后再純化1次2次，即獲得純菌株。根據(jù)獲得菌株的菌體和菌落特征，可

4、初步確定為大豆根瘤菌，菌體和菌落特征應(yīng)符合NY 410中的規(guī)定。將純菌株在無(wú)菌條件下接種于根瘤菌液體培養(yǎng)基中，在180 rmin-1和28 的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并將供試菌株的菌液在600 nm的OD值均調(diào)至0.8時(shí)作為接種菌液。大豆接種驗(yàn)證：選擇當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)大豆品種。大豆種子表面消毒后催芽，種芽長(zhǎng) 1mm2mm時(shí)用純菌株接種液浸泡1min2min，然后移植到試管根瘤菌瓊脂斜面上。設(shè)不接種的陰性對(duì)照和接種已知菌的陽(yáng)性對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，在2025下培養(yǎng)，光強(qiáng)7000lx8000lx，每天光照時(shí)間12h13h。10d20d后觀(guān)察大豆結(jié)瘤情況。如不接種的陰性對(duì)照結(jié)瘤，試驗(yàn)需要重做。空白對(duì)照

5、不結(jié)瘤，可以判定試驗(yàn)沒(méi)有污染，在10稀釋度中70%植株結(jié)有效瘤，用刀片將根瘤切開(kāi)，若根瘤內(nèi)部為粉紅色、紅色或-5褐色為有效根瘤，白色或綠色為無(wú)效根瘤，即確定接種菌為大豆根瘤菌菌株。4.5大豆根瘤菌菌株保存大豆根瘤菌菌株保存，應(yīng)該符合SN/T 2632中的規(guī)定。5大豆盆栽根瘤菌復(fù)篩5.1試驗(yàn)準(zhǔn)備蛭石采用間歇性高壓濕熱滅菌2次，每次1211h，然后置于陰涼通風(fēng)處2d 3d。盆缽用5%次氯酸鈉或0.1%高錳酸鉀溶液消毒，并用無(wú)菌水沖洗，將滅菌蛭石裝入盆缽中，澆適量無(wú)菌水備用。選擇當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)大豆品種。將4.2中確定的大豆根瘤菌菌株，制備成菌體數(shù)量1.010 cfu/mL的接種液，-9接種液制備應(yīng)執(zhí)行NY

6、/T 1735的規(guī)定。5.2盆栽實(shí)施和管理選擇當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)大豆品種。設(shè)置空白接種：將已表面滅菌的大豆種子播于滅菌后蛭石中。大豆接種驗(yàn)證（待測(cè)根瘤菌接種）：將已表面滅菌的大豆種子在待測(cè)根瘤菌接種液中浸泡1min 2min，移植到滅菌后的蛭石中。然后在2025下培養(yǎng)，光強(qiáng)7000lx 8000lx，每天光照時(shí)間12h13h。每盆定植1株2株大豆，不施肥或只施無(wú)氮營(yíng)養(yǎng)液。5.3大豆根瘤菌與大豆品種的共生匹配性和固氮能力檢測(cè)在大豆初花期，將植株連根取出后用清水洗凈，觀(guān)察根系結(jié)瘤情況和根瘤菌的有效性。不接種處理應(yīng)不結(jié)瘤，若結(jié)瘤須重新進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。植株樣品在105下殺青5min10min，再在80下烘至恒重，

7、測(cè)定每盆植株干重和含氮量，并計(jì)算植株總含氮量和待測(cè)接種菌株處理較不接種處理植株總氮量的增加量。植株含氮量測(cè)定及其增加量的計(jì)算應(yīng)執(zhí)行NY/T1735中的規(guī)定。接種待測(cè)菌株處理與不接種處理相比，收獲大豆植株總氮量增加20%，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平，確定該待測(cè)菌為高效大豆根瘤菌。6高效大豆根瘤菌田間驗(yàn)證2 6.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)處理：不接種根瘤菌、接種參比菌株、接種待測(cè)根瘤菌菌株。小區(qū)面積30m，每個(gè)處理32個(gè)重復(fù)，小區(qū)采用長(zhǎng)方形，種植在2個(gè)不同土壤肥力地區(qū)，隨機(jī)排列，試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)符合NY/T 1536的規(guī)定。6.2試驗(yàn)準(zhǔn)備6.2.1試驗(yàn)地準(zhǔn)備試驗(yàn)地選擇應(yīng)具有代表性，地勢(shì)平坦，土壤肥力均勻，前茬作物一致，澆

8、排水條件良好，土壤肥力應(yīng)為中低水平。試驗(yàn)田應(yīng)避開(kāi)道路、堆肥場(chǎng)所、水溝、水塘、高大建筑物及樹(shù)木遮陰等特殊地塊，應(yīng)符合NY/T1536的規(guī)定。土壤環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB15618規(guī)定，空氣環(huán)境質(zhì)量應(yīng)符合GB3095的規(guī)定。整地、設(shè)置保護(hù)行、試驗(yàn)地區(qū)劃（小區(qū)、重復(fù)間盡量保持一致）；小區(qū)單灌單排；測(cè)定土壤的有機(jī)質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀、pH等基本理化性質(zhì)。6.2.2根瘤菌菌株接種液準(zhǔn)備按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)準(zhǔn)備所需要的根瘤菌接種液，菌液質(zhì)量應(yīng)符合GB 20287中的規(guī)定。6.2.3大豆品種準(zhǔn)備選擇當(dāng)?shù)刂鲗?dǎo)大豆品種。田間試驗(yàn)實(shí)施和管理6.36.3.1施肥措施按照常規(guī)施磷肥和鉀肥。根據(jù)土壤的含氮量可適當(dāng)施用少量氮肥。6.3.2田間管理符合NY/T 1536的規(guī)定。6.4測(cè)產(chǎn)及評(píng)價(jià)大豆收獲期，每個(gè)小區(qū)單打、單收、單計(jì)產(chǎn)或取代表樣方測(cè)產(chǎn)。計(jì)算接種待測(cè)根瘤菌菌株處理與不接種處理產(chǎn)量相比，籽粒產(chǎn)量增加10%，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)達(dá)到顯著水平；接種待測(cè)根瘤菌菌株處理與接種參比菌株處理相比，籽粒產(chǎn)量