2022年亞硫酸氫鈉測(cè)序法

1、亞硫酸氫鈉測(cè)序法 (bisulfite genomic sequencing) 直接測(cè)序法是建立在 MSP基礎(chǔ)上進(jìn)一步深入研究 CpG島各個(gè)位點(diǎn)甲基化情況的方法 . 重亞硫酸鹽使 DNA 中未發(fā)生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶 , 而甲基化的胞嘧啶保持不變 , 行PCR擴(kuò)增 ( 引物設(shè)計(jì)時(shí)盡量避免有 CpG,以免受甲基化因素的影響 ) 所需片段 , 則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶 . 最后 , 對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序 , 并且與未經(jīng)處理的序列比較 , 判斷是否 CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化 . 此方法一種可靠性及精確度很高的方法 , 能明確目的片段中每一個(gè) CpG 位點(diǎn)的甲基化狀態(tài) . 在尋找有意義的關(guān)

2、鍵性 CpG位點(diǎn)上 , 有其他方法無法比擬的優(yōu)點(diǎn) . 測(cè)序法以 CpG島兩側(cè)不含 CpG 點(diǎn)的一段序列為引物配對(duì)區(qū) , 所以能夠同時(shí)擴(kuò)增出甲基化和非甲基化靶序列 .它的不足是耗費(fèi)時(shí)間和耗資過多 , 至少要測(cè)序 10 個(gè)以上的克隆才能獲得可靠數(shù)據(jù) , 需要大量的克隆及質(zhì)粒提取測(cè)序 , 過程較為繁瑣、昂貴 . 第一部分 基因組 DNA的提取 . 這一步?jīng)]有懸念 , 完全可以購(gòu)買供細(xì)胞或組織使用的 DNA提取試劑盒 , 如果實(shí)驗(yàn)室條件成熟 ,自己配試劑提取完全可以 .DNA 比較穩(wěn)定 , 只要在操作中不要使用暴力 , 提出的基因組 DNA應(yīng)該是完整的 . 此步重點(diǎn)在于DNA的純度 , 即減少或避免R

3、NA、蛋白的污染很重要. 因此在提取過程中需使用蛋白酶 K 及 RNA酶以去除兩者 . 使用兩者的細(xì)節(jié)：1：蛋白酶 K 可以使用滅菌雙蒸水配制成20mg/ml；RNA酶后進(jìn)行再處理, 配制成2：RNA酶必須要配制成不含DNA酶的 RNA酶, 即在購(gòu)買市售10mg/ml. 否則可能的后果是不僅沒有 驗(yàn)證提取 DNA的純度的方法有二：1：紫外分光光度計(jì)計(jì)算 OD比值；2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳 . RNA,連 DNA也被消化了 . 兩者均于 -20 度保存 . 我傾向于第二種方法, 這種方法完全可以明確所提基因組. DNA的純度 , 并根據(jù) Marker 的上樣量估計(jì)其濃度 , 以用于下一

4、步的修飾. 第二部分亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA 如不特別指出 , 所用雙蒸水（ DDW）均經(jīng)高壓蒸汽滅菌1：將約 2ugDNA于 1.5mlEP 管中使用 DDW稀釋至 50ul ；2：加 5.5ul新鮮配制的3M NaOH；3： 42 水浴 30min；水浴期間配制：4：10mM對(duì)苯二酚（氫醌）, 加 30ul 至上述水浴后混合液中； （溶液變成淡黃色）5： 3.6M 亞硫酸氫鈉（ Sigma,S9000）, 配制方法： 1.88g 亞硫酸氫鈉使用 DDW稀釋 , 并以 3M NaOH滴定溶液至 PH 5.0, 最終體積為 5ml. 這么大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶 , 但加入 NaOH后會(huì)慢慢

5、溶解 , 需要有耐心 .PH 一定要準(zhǔn)確為 5.0. 加 520ul 至上述水浴后溶液中 . 6：EP管外裹以鋁箔紙 , 避光 , 輕柔顛倒混勻溶液 . 7：加 200 ul 石蠟油 , 防止水分蒸發(fā) , 限制氧化 . 8：50避光水浴 16h. 一般此步在 4pm開始做 , 熟練的話不到 5pm即可完成 , 水浴 16h 正好至次日 8am以后收 , 時(shí)間上很合適 . 這一步細(xì)節(jié)：1：基因組 DNA的量不需十分精確 , 寧多勿少 , 因?yàn)樵谝院蠹兓厥詹襟E中會(huì)有丟失 , 且此方法修飾最多可至 4ug. 2：所有試劑均須新鮮配制 , 所以配液的技術(shù)要過關(guān) , 既要快 , 又要精確 . 3：亞硫

6、酸氫鈉溶液呈強(qiáng)酸性 , 一定用堿將 PH調(diào)制 5.0, 否則 PH不合適會(huì)影響后續(xù)純化吸收 . 4：水浴最好達(dá) 16 小時(shí) , 雖可以短至 8 小時(shí) , 但后者修飾會(huì)有不完全 . 第三部分 修飾后 DNA純化回收EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的 . 1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下 , 先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出 , 然后吸取混合液至一潔凈 1.5mlEP 管中 . 2：以下使用 Promega Wizard Cleanup DNA 純化回收系統(tǒng)（Promega,A7280 ）1）70水浴預(yù)熱 DDW；配制 80%異丙醇；2）加 1ml Promegas Wizard DNA Cle

7、an -up resin, 輕柔顛倒混勻 , 使 DNA充分與樹脂結(jié)合；3）由于該試劑盒中僅配備針筒沒有針?biāo)?, 如果有真空負(fù)壓吸引器 , 使用起來很方便；如果沒有, 需要自備 3ml-5ml 注射器 . 將注射器針筒與試劑盒提供的回收小柱緊密連接后 , 將上述混合物用移液器移至針筒內(nèi) , 用 2ml 以上的 EP管放置小柱下接收廢液 . 加針?biāo)?, 輕輕加壓 , 將液體擠出 , 此時(shí)可見小柱內(nèi)有白色的樹脂沉積 . 4）將注射器與小柱分離后拔出針?biāo)?, 再將針筒與小柱連接 , 向針筒內(nèi)加入 2ml 80的異丙醇 ,插入針?biāo)?, 輕輕加壓 , 將異丙醇擠出 . 此為洗滌步驟 . 5）將注射器與小

8、柱分離 , 將小柱置于潔凈 1.5ml 潔凈 EP管上 , 離心 12000rpm,2min, 以甩去殘余異丙醇成分 , 使樹脂干燥 . 此時(shí) , 修飾后 DNA處于與樹脂結(jié)合狀態(tài) . 6）將小柱取下置于另一潔凈1.5mlEP 管上 , 移液器加 50ul 預(yù)熱好的 DDW,室溫放置 5min. 7）離心 12000rpm,20s, 此為洗脫步驟 , 此時(shí) EP管內(nèi)液體即為洗脫的修飾后 DNA溶液 , 終體積為 50ul. 3：加 5.5ul 新鮮配制的3M NaOH,室溫放置 15min. 4：加 33ul 10M 乙酸銨 , 以中和 NaOH,使溶液 PH于 7.0 左右 . 5：加 4u

9、l 10mg/ml 糖原 , 此作為沉淀指示劑 , 因?yàn)槠渑c乙醇混合后可產(chǎn)生沉淀 , 便于以后離心后辨別回收物的位置 , 以防在吸取殘余乙醇時(shí)將回收物吸走 . 其實(shí) , 加入這些糖原究竟能起多大作用 , 不好說 . 不過有國(guó)產(chǎn)糖原賣 吧. , 包裝不大 , 也很便宜 , 買來一用 , 算嚴(yán)格遵守文獻(xiàn)的步驟6：加 270ul 冰無水乙醇 , 置于 -20 度, 過夜沉淀 . 有人為沉淀最短可至 2 小時(shí) , 但我認(rèn)為時(shí)間長(zhǎng)些可能會(huì)更好 . 并且做到此步驟時(shí) , 一般會(huì)到中午 , 如果樣本多的話要到下午 , 不妨放置過夜, 日程可以輕松些 , 順便做些其他試驗(yàn) . 如果想當(dāng)天做完 , 沒有問題 ,

10、 但我認(rèn)為最好多沉淀些時(shí)候 , 至少 6 小時(shí)吧（這是經(jīng)驗(yàn) , 我做過最少 6 小時(shí) , 也是可以的 , 再短就不敢發(fā)表意見了）7：4 度,12000rpm 離心 ,30min, 倒去上清液 , 收集沉淀 . 不必吸凈 . 8：加 500ul 70%乙醇 , 不要將沉淀吹打起來 , 只要把乙醇加上即可 . 輕柔傾斜 EP管, 旋轉(zhuǎn)一圈 ,再次離心 ,4 度 12000rpm,5min. 離心后倒掉上清 , 再加同量乙醇 , 同樣再做一遍 . 此為洗滌步驟, 共 2 次. 9：倒掉上清 , 并常溫簡(jiǎn)短離心后 , 將附壁乙醇離至 EP管底 , 移液器小心將殘余液體吸凈 , 室溫干燥 5min, 或

11、沉淀由不透明變?yōu)榘胪该骰蛲该鲿r(shí) , 加入 20ul- 30ulDDW, 溶解沉淀 . 至此 , 已完成了修飾后 DNA的純化回收 , 所得為修飾后 DNA溶液 , 可用于此后的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn) . 10： -20 保存 DNA溶液 . 此步細(xì)節(jié)：1：在使用注射器時(shí) , 一定要用力均勻且輕 , 如使用暴力 , 會(huì)將小柱內(nèi)的薄膜擠破 , 失去作用 . 2：乙酸銨、糖原不需新鮮配制 , 糖原配好后放在-20 度保存 , 乙酸銨室溫即可 , 因?yàn)檫@樣濃度的乙酸銨非常難溶 , 一旦放在 4 度, 取出用時(shí)也會(huì)有很多溶質(zhì)析出 . 3：異丙醇、 70%乙醇都不需要新鮮配制 , 但如果用量大 , 現(xiàn)場(chǎng)配也很方便 .

12、 此步關(guān)鍵是在樹脂與 DNA的結(jié)合上 , 這就再次強(qiáng)調(diào)第二部分調(diào)亞硫酸鈉 PH值得重要性 . 因?yàn)闃渲c DNA結(jié)合需要有一個(gè)適當(dāng)?shù)?PH,如前一步?jīng)]做好 , 此步樹脂不能與 DNA很好結(jié)合 , 將會(huì)帶來災(zāi)難性后果 , 即 DNA隨著液體被擠出了 , 洗脫時(shí)實(shí)際已沒有任何 DNA了. 第四部分 修飾后 DNA用于 PCR 這一步也沒有懸念 . 我主要談一下這里面的幾個(gè)比較棘手的問題：1：引物問題：我感覺自己設(shè)計(jì)引物有相當(dāng)?shù)碾y度 , 我曾設(shè)計(jì)過幾對(duì)引物 , 并且試驗(yàn)了一下 ,但以失敗告終 . 如果時(shí)間充裕、作的又是比較新的基因文獻(xiàn)不多 , 自己設(shè)計(jì)引物沒有問題 . 如果不是這樣 , 還是參考文獻(xiàn)

13、更好些 . 首先查閱 SCI 分值高的文獻(xiàn) , 然后是著名實(shí)驗(yàn)室的文獻(xiàn) ,如果國(guó)內(nèi)有做的 , 更好了 , 可以直接聯(lián)系咨詢 . 查到序列后 , 一定要和 Genbank 中的序列進(jìn)行比對(duì) , 防止有印刷錯(cuò)誤造成的個(gè)別堿基的差別. 然后再到 google 上搜一下 , 看用的人多否 , 體系條件是否一樣. 用的人多、體系條件一樣 , 表明可重復(fù)性比較強(qiáng). 我也是按此行事, 算比較順利. 2：Taq 酶問題：有文獻(xiàn)用高保真的金牌 Taq （Platinum ）, 但我感覺只要體系正確、變性退火等條件合適 , 一般的熱啟動(dòng)酶是可以的. 我開始使用的是Takara的 LA Taq, 很好用 , 配有1

14、0 x 含 mg+的 LA 緩沖液 . 有時(shí)候用沒了 , 暫時(shí)以 Takara 的普通 Taq 酶也可以 . 如何選擇 , 可以根據(jù)自己的情況 . 初作者還是用好一點(diǎn)的酶 . 3：PCR的條件：變性一般都選擇 95 度,3min. 其余我感覺還是根據(jù)文獻(xiàn) , 退火可以根據(jù)你的引物的退火溫度在小范圍內(nèi)嘗試 . 一般和文獻(xiàn)報(bào)道差別不大 . 只是擴(kuò)增片斷特異性的問題 . 建議根據(jù)文獻(xiàn) . 4：做 PCR的 EP管最好選擇進(jìn)口的 , 壁薄且厚度均勻 , 這可以保證溫度的迅速變化可以及時(shí)傳遞給管內(nèi)的反應(yīng)液 , 使體系真正在所設(shè)定的溫度下運(yùn)行 . 5：PCR 儀：如果在某一個(gè)儀器上作出來了 , 最好一直用

15、此儀器繼續(xù) . 不同的儀器“ 脾氣” 也不一樣 , 但 EP管必要和儀器內(nèi)的插孔緊密結(jié)合方好 , 留有空隙 , 我認(rèn)為會(huì)影響溫度的傳遞 . 這一部分有些啰嗦 , 只是個(gè)人一些不成熟經(jīng)驗(yàn) . 有疑問處 , 請(qǐng)大家指出 , 交流 . 今天先到這里 ,現(xiàn)寫一些內(nèi)容 , 比較費(fèi)勁 , 總是不能一揮而就 這一部分 . 第五部分 PCR產(chǎn)物的凝膠回收. 望見諒 . 歇息一會(huì)準(zhǔn)備寫最后藍(lán)白斑篩選克隆這一步比較簡(jiǎn)單, 可以購(gòu)買一個(gè)凝膠PCR產(chǎn)物回收試劑盒, 國(guó)產(chǎn)的就很好、價(jià)格也合理, 比如TIANGEN的產(chǎn)品（用過）. 把切下來的膠按說明書操作即可. 幾個(gè)細(xì)節(jié)：1：PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳 , 要使用新配

16、的電泳液 . 凝膠濃度 1%-2%均可 . 2：凝膠 DNA回收時(shí)在 300nm紫外燈下觀察條帶位置 , 切取目的片斷所在位置的凝膠 , 盡量小 ,保證特異性 . 3：紫外照射時(shí)間不能過長(zhǎng) , 否則對(duì) DNA有損傷 . 4：回收后的 DNA如不馬上用就儲(chǔ)存于-20 度, 在數(shù)月內(nèi)是很穩(wěn)定的 . 第六部分 PCR產(chǎn)物與 T 載體的連接和轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選1：連接 T載體（本實(shí)驗(yàn)使用的是 Promega 的試劑盒）15ul 體系T-easy 1ul Ligase 1ul 2xbuffer 7.5ul DNA 5.5ul 4 度, 過夜 . 2：連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1）-70 度冰箱內(nèi)取出感受態(tài)細(xì)菌 , 融化后置于冰上；2）連接產(chǎn)物 15ul 全部加入 , 至于冰上 30 分鐘；3）42 度 , 90 秒鐘；4）冰上 2 分鐘；5）800ul LB 培養(yǎng)基；6）280rpm,37 度 , 搖床 45 分鐘（將管放水平了搖, 保證菌液搖勻） ；7）8000rpm,1 分鐘；在超凈臺(tái)內(nèi)去上清 , 留 100-150ul ；8）涂板： 37 度孵箱過夜； （板為含有氨芐青霉素的固體 LB 培養(yǎng)基）先涂： X-gar 35ul IPTG 25ul 后涂：混懸液過夜后可見板上