抗病毒藥物病毒學研究報告報告申報資料要求的指導原則

1、-. z.抗病毒藥物病毒學研究申報資料要求的指導原則一、概述病毒感染是危及人類健康和生命的疾病之一，目前已有很多抗病毒藥物上市應用，但仍不能完全滿足臨床治療的需求。近年來國外相關制藥企業(yè)不斷投入大量資金研發(fā)抗病毒藥物，抗病毒藥物的注冊申請也逐漸受到各方面的關注。根據(jù)試驗數(shù)據(jù)撰寫的非臨床和臨床病毒學研究報告是審評抗病毒藥物的臨床試驗申請和上市申請的重要資料。本指導原則旨在幫助研發(fā)抗病毒藥物或生物制品（例如：治療性蛋白和單克隆抗體）的申請人初步了解哪些非臨床和臨床病毒學研究數(shù)據(jù)對于抗病毒藥物或生物制品申報臨床試驗或申請上市是最關鍵的。本指導原則主要關注非臨床和臨床病毒學研究報告，同時對需要收集和提

2、交的耐藥性研究數(shù)據(jù)提出了建議。討論的主要問題包括：明確作用機制確定所研究藥物特定的抗病毒活性評價所研究藥物與其他可能合用的抗病毒藥之間發(fā)生相互作用的可能性提供病毒對所研究藥物產(chǎn)生耐藥性的研究數(shù)據(jù)提供所研究藥物與已上市的其他相同作用靶點抗病毒藥物的交叉耐藥性的研究數(shù)據(jù)二、背景近年來，國外在抗HIV-1藥物的研究方面積累了大量的經(jīng)驗，也取得了很多進展。因此，本指導原則以抗HIV-1藥物為例，介紹抗病毒藥物病毒學研究的一般原則。盡管不同病毒的檢測方法和模型系統(tǒng)有較大的差異，但本指導原則的許多抗HIV藥物研發(fā)的原則適用于治療其他病毒感染（如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、單純皰疹病毒、帶狀皰疹病毒、流感病

3、毒、鼻病毒、巨細胞病毒及人乳頭瘤病毒等國常見病毒）的抗病毒藥物的研發(fā)。病毒學領域研究發(fā)展日新月異，所以，當積累了新的資料或出現(xiàn)相關需求時，我們將對本指導原則進行修訂。三、非臨床病毒學研究非臨床病毒學研究有助于在進行人體試驗前評價藥物的有效性和安全性。建議申請人進行藥物的作用機制、藥物在模型系統(tǒng)中的特定抗病毒活性的研究，并提供對藥物產(chǎn)生耐藥的病毒學數(shù)據(jù)。此外，臨床上常將一種藥物與其他已上市的治療相同適應癥的藥物聯(lián)合使用，因此，最好通過體外試驗研究兩種或兩種以上藥物聯(lián)合用藥的抗病毒活性，以便發(fā)現(xiàn)所研究藥物與其他抗病毒藥物之間可能存在的相互作用（如拮抗、協(xié)同、增強、疊加等），尤其應關注負面的相互作用

4、。由于已上市的抗病毒藥物很多，交叉耐藥（病毒對一種藥物耐藥后，對同類的其他藥物也產(chǎn)生了耐藥性）可能會成為臨床應用中的一個主要問題。因此，在抗病毒藥物的研發(fā)過程中，下列信息顯得非常重要：測定所研究藥物對相同作用靶點的其他已上市藥物的耐藥病毒株的抗病毒活性。測定已上市藥物對由相同作用靶點的所研究藥物誘導的耐藥病毒株的抗病毒活性。申請人在開始I期臨床試驗前應先進行非臨床研究（如作用機制研究、體外抗病毒活性研究、耐藥性研究，以及血清蛋白結合率對抗病毒活性影響的研究等）。如果病毒有合適的體外感染模型系統(tǒng)，在開始旨在考察所研究藥物與其他抗病毒藥物合用療效的臨床試驗前，申請人應完成所研究藥物與其他已上市的針

5、對此病毒藥物合用的體外活性研究，如針對相同靶點有多種已上市的藥物和研究藥物，應從每一類藥物中至少選一種有代表性的藥物進行研究。在對感染*一種病毒的患者進行臨床試驗前，應先通過體外試驗誘導對所研究藥物耐藥的病毒株，并鑒定耐藥病毒株的表型和基因型及交叉耐藥性。（一）作用機制研究在I期臨床試驗前應進行作用機制研究。充分掌握藥物的作用機制對于臨床試驗的設計非常重要，可使研究者了解病毒基因組中發(fā)生導致耐藥性突變的可能區(qū)域，這些區(qū)域不僅限于所研究藥物作用的靶位（病毒編碼的靶點），也可能包括酶的底物或靶蛋白復合物中存在的另外的病毒或宿主編碼蛋白。耐藥性突變的鑒定結果也可以為機制研究和臨床研究提供依據(jù)。病毒生

6、命周期中的許多階段都可以成為潛在的抗病毒藥物的作用靶點。藥物可以通過作用于病毒特異性的編碼功能而發(fā)揮直接的抗病毒作用（如酶抑制劑），或者通過其他途徑而發(fā)揮間接的抗病毒作用（如干擾素誘導的宿主細胞應答）。建議進行如下作用機制研究：證明藥物具有特異性地抑制病毒復制或抑制病毒特定功能的能力。確定藥物作用的靶點（如病毒復制酶、蛋白酶等）或作用于病毒復制的哪個階段（如病毒進入、入核等）。申請人可提供支持其藥物作用機制的生物化學、結構學、細胞學、遺傳學等方面的數(shù)據(jù)。證明藥物作用機制的數(shù)據(jù)包括但不僅限于受體結合、抑制酶活性、確定抑制劑與受體復合物結合的*-光晶體結構、編碼靶蛋白基因的耐藥性突變位點的鑒定等。

7、應比較所研究藥物對病毒靶點及細胞或宿主蛋白作用的選擇性，當宿主細胞中存在或可能存在與病毒酶類似的酶時，此點尤其重要。例如，如果藥物的作用靶點是病毒聚合酶，建議申請人證明該藥物對病毒聚合酶的抑制活性，同時比較其對宿主細胞的DNA聚合酶（如DNA聚合酶、及）的抑制活性。研發(fā)免疫調(diào)節(jié)劑還應注意更多問題。此類藥物會對機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用，因而可能會對病毒的復制起不到抑制作用，或者對機體產(chǎn)生其他不良影響。對于通過刺激全身免疫反應而發(fā)揮作用的免疫調(diào)節(jié)劑，建議申請人證實其抗病毒活性，并鑒定出參與作用的免疫分子或免疫細胞。（二）抗病毒活性1.體外抗病毒活性許多感染人體的病毒可以在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物宿主體完成

8、完整的生命周期。在這樣的情況下，建議申請人在開始I期臨床試驗前先通過體外試驗證明所研究藥物和/或其代產(chǎn)物的特異的、可定量的抗病毒活性。這些數(shù)據(jù)應能清楚地證明在體、在可接受的風險/收益比的情況下達到的藥物濃度具有抗病毒作用，從而為人體試驗提供支持，這一點非常重要。此外，使用相關的細胞和病毒臨床分離株進行的體外抗病毒活性和細胞毒性評價見第三部分（三）細胞毒性和治療指數(shù)可以指導早期臨床試驗選擇合適的劑量圍。鼓勵申請人使用人靶細胞的原代培養(yǎng)細胞進行抗病毒活性研究。由于病毒的基因容易發(fā)生變異，所以應使用多種臨床分離株考察所研究藥物的抗病毒活性，臨床分離株應能代表臨床試驗中的病毒群。建議進行的抗病毒活性研

9、究包括：評價所研究藥物對一系列病毒實驗室適應株和臨床分離株（包括不同的亞群（clades）、亞型(subtypes)或基因型(genotypes)）的特異性抗病毒活性。評價所研究藥物對相同作用靶位或復合物藥物耐藥的病毒株、對其他已上市具有相同適應癥的藥物耐藥的代表性耐藥病毒株的抗病毒活性。應使用定量的檢測方法，在不同濃度藥物的條件下測定病毒的復制，并與不添加藥物的測定結果進行比較，確定藥物的劑量依賴的特異性抗病毒活性。藥物的有效濃度是指使病毒復制的水平降低50%的濃度（細胞培養(yǎng)試驗中用EC50表示，生物化學或亞細胞試驗中用IC50表示）。評價藥物的抗病毒活性和細胞毒性的方法包括但不局限于病毒滅

10、活試驗、空斑減數(shù)試驗、細胞病變效應抑制試驗、病毒抗原或核酸檢測、感染性病毒顆粒檢測、含報告基因的病毒或細胞檢測等?？赡苡绊戇@些試驗的因素包括病毒感染復數(shù)（Multiplicity of Infection，MOI）和給藥時間（如病毒感染前給藥或感染后不同時間給藥）。建議申請人使用傳代次數(shù)較少的宿主細胞進行研究。藥物的有效濃度與作用機制研究的數(shù)據(jù)應一致，如果藥物抑制病毒復制所需的濃度低于根據(jù)假定的作用機制計算出的生化數(shù)據(jù)，則提示可能還存在其他的作用位點或機制。當抗病毒活性數(shù)據(jù)與生化數(shù)據(jù)不一致時，可以通過耐藥性分析證明藥物在體的作用機制。對于核苷或核苷酸類似物，建議在細胞的穩(wěn)定期及分裂期測定藥物活

11、性分子的三磷酸鹽的半衰期（t1/2）。*些影響人類健康的病毒（如乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等）目前尚無合適的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物模型。對于此類病毒，可以通過對親緣關系很近的病毒關鍵功能和活性的抑制揭示藥物的潛在抗病毒活性。如果目標病毒目前尚無合適的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)或動物模型，而且藥物的作用部位被認為位于細胞、細胞的藥物濃度與生化研究中的結果一致時，確定抗病毒藥物的活性部分能否進入細胞尤為重要。目前用于研究乙型肝炎病毒（HBV）的細胞系和基于細胞的檢測方法還非常有限。研究丙型肝炎病毒（HCV）進入、復制和感染的基于細胞的試驗取得了一定進展，但還存在很多不足。目前用于檢測HBV復制的方法包括但不限于：通

12、過生物化學試驗測定HBV DNA聚合酶的活性。使用桿狀病毒介導的轉入或轉染HBV基因組到人肝細胞株進行細胞培養(yǎng)試驗，然后用HBV DNA探針經(jīng)Southern Blot定量分析檢測HBV cccDNA及RI-DNA等的形成。用含有HBV基因組（復制可調(diào)控或不可調(diào)控）的穩(wěn)定轉染細胞株進行細胞培養(yǎng)試驗。采用定量PCR法測量細胞外的HBV DNA。對于HCV,目前有用于研究病毒進入（或受體）的假病毒系統(tǒng)（HCVpp）、研究病毒復制的復制子系統(tǒng)（Replicon）以及研究完整病毒復制周期的病毒感染系統(tǒng)（HCVcc），這些系統(tǒng)均可用于評價藥物對HCV的抗病毒活性。遺憾的是HCVcc系統(tǒng)目前僅在2a亞型中

13、取得成功。目前用于評價藥物抗HCV活性的方法包括但不局限于：體外檢測藥物對病毒靶標蛋白（HCV RNA聚合酶、HCV絲氨酸蛋白酶）的抑制活性。采用不同亞型復制子系統(tǒng)評價藥物對不同亞型HCV復制的抑制作用。通過報告基因檢測病毒抗原的表達水平，或通過RT-PCR檢測HCV復制子細胞中HCV RNA的水平。在HCVcc系統(tǒng)中，通過檢測病毒中報告基因編碼產(chǎn)物（如熒光素酶或綠色熒光蛋白等）的活性反映藥物對病毒的抑制作用。也可以通過RT-PCR檢測HCV復制子細胞中HCV RNA的拷貝數(shù)，或定量檢測病毒抗原水平。2.血清蛋白存在條件下的體外抗病毒活性血清蛋白能與許多藥物結合或螯合，從而影響藥物的抗病毒活性

14、。建議申請人詳細考察藥物是否能與血清蛋白顯著結合。測定藥物血清蛋白結合率的常用方法包括平衡透析法、超濾法以及基于熒光技術的高通量人血清白蛋白和-酸性糖蛋白結合試驗。如果藥物的蛋白結合率較高，則建議申請人在加入系列人血清稀釋液（如5%、10%、20%、40%）條件下測定藥物的體外抗病毒活性。通過這些數(shù)據(jù)可以推算出藥物在100%人血清中的EC50，同時應報告血清校正后的EC50值。此外，建議申請人在含有生理濃度的-酸性糖蛋白和人血清白蛋白的條件下測定藥物的EC50值。3.抑制指數(shù)血漿藥物濃度和細胞藥物濃度對于評價抗病毒治療的量效關系和發(fā)生耐藥的可能性非常重要，計算抑制指數(shù)（Inhibitory Q

15、uotient，IQ）時也需要用到這些數(shù)據(jù)。抑制指數(shù)（IQ）等于Cmin除以血清校正后的EC50值。測定EC50值的更多信息可參閱第三部分（二）第1節(jié)-體外抗病毒活性。IQ值是一個綜合藥物的體濃度和抗病毒活性的有用工具，也是描述藥物的暴露程度與病毒對藥物敏感性之間相互關系的一個指標。如果一種藥物的IQ較高，則表明患者體的藥物能達到有效抑制病毒的濃度，可使耐藥發(fā)生的概率降到最低。由于同一種劑量可能并不適用于所有的患者，所以IQ值也可以用于指導III期和IV期臨床試驗劑量的選擇。4.體抗病毒活性在體外抗病毒活性研究的基礎上，可進一步通過動物感染模型來評價藥物的抗病毒活性。動物模型的分析指標包括病毒

16、感染后（需要有證據(jù)證明）動物發(fā)病率和死亡率、組織學檢查、各時間點的病毒載量、在發(fā)生病毒反彈的動物體耐藥株的分離和鑒定、病毒抗原和抗體的定量檢測、藥代動力學數(shù)據(jù)以及癥狀（如神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、體重減少等）。（三）細胞毒性及治療指數(shù)申請人應在臨床試驗前開展藥物細胞毒性和治療指數(shù)的研究。需要證明藥物在體可達到的濃度下具有抗病毒活性，同時該濃度的藥物不會對細胞產(chǎn)生毒性作用。應排除測定的藥物抗病毒活性是由于宿主細胞死亡所造成的可能。這一點非常重要。在細胞毒性試驗中，應設置抗病毒藥物的濃度梯度，測定導致50%的宿主細胞死亡的濃度參見第三部分（二）第1節(jié)-體外抗病毒活性，即所研究藥物的半數(shù)細胞毒性濃度，通常用CC

17、50或CCIC50來表示。治療指數(shù)或選擇性指數(shù)（即CC50/EC50）則是藥物的細胞毒性效應與抑制病毒復制效應的比值。理想的藥物應具有最大的抗病毒活性，同時具有最小的細胞毒性（即具有較大的治療指數(shù)）。建議申請人對處于穩(wěn)定期和分裂期的各種類型的、相關的人細胞和組織細胞進行CC50值的測定，確定藥物對不同細胞周期、不同細胞類型或不同組織的潛在毒性。由于*些抗病毒藥物對骨髓有抑制作用，建議申請人采用細胞集落形成法評價*些藥物（如核苷類似物）對人骨髓祖細胞生長的潛在影響。此外，*些藥物也對負責正常細胞核DNA和線粒體DNA合成及修復的細胞DNA聚合酶具有潛在的抑制作用。申請人應測定抗病毒藥物對細胞聚合

18、酶的IC50，同時應證明藥物對病毒靶點作用的特異性（與對細胞聚合酶的作用相比）。人體的DNA聚合酶負責線粒體DNA合成，人DNA聚合酶被抑制與線粒體功能缺損之間具有相關性，并會導致人體不良反應的發(fā)生。因此，考察*些藥物（如核苷類似物）對人聚合酶活性的影響以及對線粒體的毒性作用（如乳酸的生成量，線粒體DNA含量、線粒體形態(tài)學，葡萄糖利用率）就顯得非常重要。（四）體外聯(lián)合用藥的活性分析感染病毒的患者體可能存在不同的病毒變異株，其中*些類型的病毒株可能對一種或多種抗病毒藥物具有耐藥性。因此，對于*些病毒而言，同時給予多種抗病毒藥物（如抗HIV-1的聯(lián)合藥物療法）可能會比使用單一的藥物產(chǎn)生并維持更好的

19、抗病毒作用。但是不同藥物之間的相互作用比較復雜，聯(lián)合用藥后可能導致藥物的抗病毒活性出現(xiàn)相互拮抗、相加或者協(xié)同等作用。因此，申請人應在體外試驗中評價藥物與其他已上市的、治療相同疾病藥物之間聯(lián)合用藥的抗病毒活性。具體來說，應評價所研究藥物與所有已上市的針對相同靶點的藥物之間聯(lián)合用藥的抗病毒活性，對于已上市的治療相同適應癥的不同靶點的藥物，應選擇兩種或兩種以上進行此類研究。建議申請人在開始評價聯(lián)合用藥療效的臨床試驗前，先完成體外聯(lián)合用藥的活性研究。有時患者會混合感染兩種或兩種以上的病毒（如：HIV與HBV或HCV共感染），因此，體外聯(lián)合用藥活性試驗還應考察治療同時感染不同種類病毒的藥物與所研究藥物合

20、用的體外抗病毒活性。（五）耐藥性1.體外耐藥病毒株的選擇本指導原則主要關注病毒基因突變導致的病毒對特定的抗病毒藥物的表型敏感性降低的耐藥性。這里所說的耐藥性并不是絕對耐藥，而是一個相對的概念。建議在開始以感染特定病毒的患者為對象的臨床試驗前，先通過體外試驗選擇對藥物耐藥的病毒株，鑒定耐藥株的表型和基因型，并進行交叉耐藥性分析。盡管通過體外試驗獲得的耐藥性數(shù)據(jù)可能并不能準確預測臨床耐藥性，但仍建議申請人通過體外耐藥株選擇試驗評價目標病毒對藥物產(chǎn)生耐藥性的屏障，從而有助于臨床試驗的設計。通過在細胞培養(yǎng)中選擇對藥物耐藥的病毒株，可以了解耐藥性產(chǎn)生遺傳閾值的高低。遺傳閾值低的藥物可以選擇僅含1或2個突

21、變位點的耐藥株。而遺傳閾值較高的藥物則可能在病毒株中發(fā)生多處突變才產(chǎn)生耐藥性。藥物和目標病毒的許多因素可對耐藥性產(chǎn)生影響，如藥物濃度。突變株的出現(xiàn)速率取決于病毒復制速率、產(chǎn)生的病毒基因組的數(shù)量、復制機制的保真度以及宿主因素。對這些因素的了解有助于設計檢測耐藥株的體外試驗。例如，如果需要發(fā)生多個突變方可對藥物產(chǎn)生耐藥性，則許多細胞培養(yǎng)系統(tǒng)提供的病毒滴度可能不足以用于選擇耐藥病毒。遇到這種情況時，可以在逐漸增加藥物濃度的條件下使病毒在細胞培養(yǎng)中連續(xù)傳代，這樣可能會選擇出耐藥株。在評價耐藥性的體外試驗中，藥物的濃度圍應覆蓋其在人體的預期濃度。選擇對藥物耐藥的突變毒株的試驗應在下列條件下重復進行：使用

22、不同的野生株、使用不同的耐藥株、高選擇壓力及低選擇壓力等，并確定不同的試驗中產(chǎn)生的耐藥性突變的類型是否相同，以評價藥物濃度與耐藥性遺傳屏障之間的關系。當采用細胞培養(yǎng)系統(tǒng)復制目標病毒時，可以采用下列兩種基本方法選擇對藥物敏感性降低的病毒株：病毒以較高的MOI接種宿主細胞，在多種固定的藥物濃度下分別連續(xù)傳代，誘導耐藥株的產(chǎn)生。病毒以較低的MOI接種宿主細胞，病毒傳代期間逐漸增加藥物濃度，起始藥物濃度接近藥物對親代病毒的EC50。采用合適的方法對病毒的復制進行監(jiān)測，通過對選擇期間分離株的基因型和表型的鑒定，檢測耐藥毒株的產(chǎn)生。HCV對藥物的耐藥性可以通過HCV復制子系統(tǒng)進行考察。使用HCV復制子細胞

23、篩選HCV耐藥性的方法包括下列幾種：在含新霉素的培養(yǎng)基中，多種固定的藥物濃度下，以較低的密度培養(yǎng)HCV復制子細胞。含有耐藥性復制子的細胞將會形成集落，應對其進行基因型和表型鑒定。在不含新霉素的培養(yǎng)基中，多種固定的藥物濃度下，進行HCV復制子細胞傳代。收集并保存每一代HCV復制子細胞，用于表型和基因型鑒定。2.基因型分析針對體外試驗中篩選出的耐藥株進行基因型分析，確定可能導致病毒對藥物敏感性降低的基因突變。針對病毒基因組中的相關部分進行DNA序列分析，鑒定耐藥相關突變，這有利于預測臨床療效，并且可以為闡述藥物的作用機制提供證據(jù)。應測定編碼目標蛋白的完整基因序列，對于導致病毒對所研究藥物耐藥的突變

24、類型和導致病毒對其他同類藥物耐藥的突變類型進行比較。對于較大的病毒（如皰疹病毒、痘病毒），應對其基因組中與所研究藥物作用靶點相關的部分進行測序，并分析其中所含的與耐藥性產(chǎn)生相關的突變。建議在幾種遺傳背景（如毒株、亞型、基因型）中鑒定耐藥性產(chǎn)生的通路；通過選擇程序獲得的毒株如果同時出現(xiàn)了多種突變，則應該鑒定各種突變出現(xiàn)的先后順序。進行基因型分析時，鼓勵申請人注明測序引物的序列，并說明這些引物可擴增出目標基因的堿基數(shù)。還應說明用于檢測少數(shù)病毒亞群的基因型檢測方法的靈敏度。闡明該突變在基因型分析中的比例和種類是十分重要的。3.表型分析表型分析用于確定變異株對藥物的敏感性是否降低。通過基因型分析鑒定出

25、與耐藥性產(chǎn)生可能相關的突變后，如有可能，則應在重組病毒系統(tǒng)（即：使用定點突變技術，PCR擴增突變片段并導入實驗室標準株或使用其他適合的系統(tǒng)）中評價每一種突變導致表型耐藥的能力。通過體外試驗測定重組病毒對藥物的敏感性，并確定EC50值。計算突變株與對照株（生物學特性明確的野生型實驗室株）的EC50值之比（EC50值增加的倍數(shù)）。任何標準的病毒學試驗方法都可用于計算病毒的表型耐藥的變化（如病毒相關蛋白檢測、PCR檢測病毒DNA或RNA、細胞病變檢測、MTT法檢測細胞毒性、報告基因表達檢測等）。通過測定突變株的EC50值，并與在相同條件下同時測得的對照株的EC50值進行比較，計算突變株敏感性的變化（

26、耐藥性倍數(shù)的變化）。由于試驗中測得的EC50值比EC90或EC95值更精確，應優(yōu)先使用EC50值。表型檢測方法的選擇取決于其靈敏度，即檢測耐藥株較對照株的敏感性變化（耐藥性的倍數(shù)）的能力。計算耐藥性的倍數(shù)（耐藥株的EC50值/參比株的EC50值）時，要求表型檢測方法之間具有可比性。4.交叉耐藥性使用針對相同靶點的抗病毒藥物治療時，對*一種藥物敏感性降低的變異，同時也可能會對相同靶點的其他藥物的敏感性降低或喪失，這種現(xiàn)象稱為交叉耐藥。交叉耐藥并不一定是可以類推的，因此評價所有可能性非常重要。例如，如果病毒*對A藥和B藥耐藥，而病毒Y也對A藥耐藥，但病毒Y可能仍對B藥敏感。建議通過表型分析評價所研

27、究藥物對同類的已上市藥物的耐藥毒株的有效性，同時評價同類已上市藥物對所研究藥物的耐藥毒株的有效性。此外，如果藥物的作用靶點相同，但結構類型不同例如，核苷類逆轉錄酶抑制劑（NRTIs）和非核苷類逆轉錄酶抑制劑（NNRTIs），其作用的靶點都是HIV的逆轉錄酶，則建議對不同類型的藥物進行交叉耐藥性分析。建議檢測多種耐藥株和臨床分離病毒株對所研究藥物的表型敏感性（圍應能代表已知可導致病毒對同類型藥物的敏感性降低的不同突變和突變的組合）。如果表型檢測是在病毒感染細胞系中進行的，則應該使用臨床分離病毒株對EC50值進行校驗。四、針對耐藥性產(chǎn)生的監(jiān)測應幫助醫(yī)生及患者了解抗病毒藥物的耐藥性信息，以協(xié)助其做出

28、最佳的治療決策。除此之外，臨床試驗方案設計和藥物研發(fā)計劃通常與藥物的耐藥性和交叉耐藥性情況密切相關。因此，強烈建議申請人根據(jù)藥物預期在臨床上應用的實際情況，在藥物研發(fā)的各期臨床試驗中進行全面的耐藥性監(jiān)測。對于*些病毒，病毒載量的變化可作為判定抗病毒藥物臨床療效的終點指標。在這種情況下，可以用測定病毒載量的方法進行耐藥性監(jiān)測?；蛐秃捅硇蜋z測是考察耐藥病毒株是否出現(xiàn)的基礎，還有可能表明病毒的耐藥性與臨床病毒學失敗之間的關系。此外，表型和基因型檢測結果還可用于指導治療方法的選擇，或預測藥物在*一患者個體的療效。對治療失敗或發(fā)生了病毒反彈的患者中分離到的病毒株進行基因型檢測可以發(fā)現(xiàn)導致病毒對所研究藥

29、物敏感性降低的基因突變。此外，進行基線基因型和表型分析，可以根據(jù)基線病毒株的突變和多態(tài)性及表型敏感性判斷治療結果。如果病毒載量未被作為主要終點指標，則建立檢測病毒載量的方法以及監(jiān)測病毒耐藥性的出現(xiàn)對于分析病毒學指標與臨床結果之間的關系將非常重要，而且有助于完善擬進行的臨床試驗的設計。建議申請人在開始以病毒感染的患者為對象的臨床試驗前，首先制訂耐藥性監(jiān)測計劃，并作為臨床試驗方案的一部分。耐藥性監(jiān)測計劃應至少包含下列容：描述檢測病毒載量的試驗方法病毒載量檢測方法及操作特點擬采用的基因型和表型耐藥性檢測方法、步驟和操作特點樣本采集和保存的方法樣本的處理和運輸方法（冷凍或常溫)擬進行的其他耐藥性分析采

30、集用于檢測病毒載量、基因型和表型以及其他耐藥性分析樣本的時間點（如基線、第24周、第48周、治療失敗或中止試驗后）建議申請人在藥物研發(fā)的早期階段即制訂基因型和表型耐藥的基線研究以及有關耐藥性子課題的計劃。申請人應及時完成有關基線耐藥和治療后分離病毒株的基因型和表型分析，以便明確所研究藥物的耐藥性特征以及與其他藥物的交叉耐藥情況。對于HBV和HCV等病毒，監(jiān)測基線和治療后病毒的基因型耐藥對評估耐藥突變的發(fā)生至關重要。通過比較分析治療失敗患者的樣本和基線樣本基因型，可以發(fā)現(xiàn)與耐藥性相關的突變。試驗方案中應明確說明病毒學失敗和中止研究的定義。對于以經(jīng)治患者為對象的臨床試驗，強烈建議申請人收集全部患者

31、研究初始的基線分離病毒株的表型和基因型數(shù)據(jù)，同時收集所有病毒學失敗和退出研究（病毒復制未得到抑制）等終點時的表型和基因型數(shù)據(jù)。并注意應在患者仍在服用所研究藥物時完成樣本采集。在以初治患者為對象的臨床試驗中，應設法獲得來自于所有病毒學失敗和中止研究（病毒復制尚未得到抑制）的患者的基線分離病毒株和終點分離病毒株的表型和基因型數(shù)據(jù)。在以未接受過治療的患者為對象的研究中，應收集并保存所有患者的基線時的生物樣本，以備在病毒學失敗時進行表型和基因型分析。根據(jù)臨床試驗方案或研究人群的具體情況，有時可能需要進行額外的基因型和表型評價或亞組分析，因此在臨床試驗的各個階段（基線及治療階段）采集并保存樣本是非常必要的。申請人有時會提出當體外數(shù)據(jù)提示病毒在單一突變后導致高度表型耐藥時，在基線和病毒學失敗時收集初治患者亞組的樣本。對這樣的研究方案事先應進行討論。申請人可以選擇自己進行病毒載量的檢測和表型及基因型耐藥性分析，也可以將生物樣本委托給其他有資質(zhì)的實驗室進行檢測。實驗室樣品的處理應按照合適的操作程序進行。如果*項試驗未按照生產(chǎn)廠家的技術規(guī)操作，則該試驗的結果可能不會被接受。鼓勵申請人使用經(jīng)過鑒定和驗證的試驗方法。如果使用的檢測方法屬于研究性的，則建議申請人提供該檢測方法的操作特性參數(shù)（如準確性、精密度、檢測限及定量限、特異