EB病毒感染致病機(jī)制與實(shí)驗(yàn)室檢測方法課件

1、Pathogenic mechanism of EB virus and laboratory detectionEB病毒感染致病機(jī)制與實(shí)驗(yàn)室檢測方法解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心（原304醫(yī)院）病理科康佳蕊目錄010203EB病毒概述EB病毒感染致病機(jī)制EB病毒檢測方法01EB病毒概述EB virus overview01. EB病毒的發(fā)現(xiàn)EB病毒概述Denis Parsons Burkitt患伯基特淋巴瘤的非洲男童1958年發(fā)表的論文EB病毒。1964年，利用電子顯微鏡在伯基特淋巴瘤的活檢組織細(xì)胞中，觀察到一種類似皰疹病毒顆粒的新病毒，并將其命名為“非洲兒童下頜角肉瘤”中，首次系統(tǒng)性的描述了伯基

2、特淋巴瘤。人類皰疹病毒型別名稱亞科潛伏細(xì)胞/組織1單純皰疹病毒1型（HSV-1）神經(jīng)元細(xì)胞2單純皰疹病毒2型（HSV-2）神經(jīng)元細(xì)胞345水痘帶狀皰疹病毒（VSV）Epstein-Barr病毒（EBV）巨細(xì)胞病毒（CMV）神經(jīng)元細(xì)胞B淋巴細(xì)胞單核巨噬細(xì)胞/淋巴細(xì)胞6人類皰疹病毒6型（HHV-6）淋巴組織7人類皰疹病毒7型（HHV-7）淋巴組織8人類皰疹病毒8型（HHV-8）02. EB病毒屬性EB病毒概述03. EB病毒的結(jié)構(gòu)EB病毒概述a形態(tài)結(jié)構(gòu) 成熟的病毒顆粒呈球形，直徑150-180nm 蛋白囊膜 核衣殼，二十面體對稱，62個管狀粒子組成 核樣物，直徑5nmb基因組結(jié)構(gòu) 線性雙鏈DNA分

3、子，大小175kb EBV（175kb）是HBV（3kb）的58.3倍c編碼蛋白 衣殼抗原（VCA）、早期抗原（EA）、核心抗原（EBNA） 潛伏膜蛋白（LMP-1、LMP-2） 小RNA（EBER）04. 流行病學(xué)研究EB病毒概述ab地域分布 世界性，分布廣泛 散發(fā)性，四季皆可傳染源 病毒攜帶者 患者cd傳播途徑 飛沫傳播，“接吻病” 血液傳播或性傳播易感人群 不論種族、性別，20歲以下女性略多 感染率高，大多呈潛伏狀態(tài)02EB病毒感染致病機(jī)制Pathogenic mechanism of EB virus infection01. 上皮細(xì)胞感染方式EB病毒感染致病機(jī)制BMRF-21整合素g

4、H/gLav5/6/8EBV上皮細(xì)胞融合+abgB（CendR）+NRP1cB細(xì)胞與上皮細(xì)胞接觸BMRF-2+ 1整合素02. B細(xì)胞感染方式EB病毒感染致病機(jī)制EBVB淋巴細(xì)胞內(nèi)吞入核gp350/220+CD21gp42+HLA-II類分子潛伏性感染多見于EBV相關(guān)的惡性腫瘤DNA呈線性滾動復(fù)制DNA環(huán)形附加體不發(fā)生復(fù)制VCA、EA充分表達(dá)EBNAs、LMPs、EBERs表達(dá)升高病毒完成裝配宿主細(xì)胞死亡隨宿主細(xì)胞復(fù)制宿主細(xì)胞永生化增值性感染多見于EBV相關(guān)感染性疾病03. 免疫逃逸機(jī)制EB病毒感染致病機(jī)制0605020301干擾抗原加工和提呈干擾細(xì)胞因子作用04抑制宿主細(xì)胞凋亡抑制Th1免疫

5、應(yīng)答調(diào)節(jié)CTL免疫應(yīng)答潛伏期EBV基因表達(dá)下調(diào)EB病毒感染致病機(jī)制04. EB病毒參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制LMP-1的抗凋亡作用LMP-1Bcl-2,Mcl-1,A20p53依賴的細(xì)胞凋亡LMP-1(CTAR)JNKAP-1增殖分化，侵襲轉(zhuǎn)移TRAFs/TRADDNF-Bp38/MAPKATF2凋亡EB病毒感染致病機(jī)制LMP-2A參與的抑癌基因CpG島甲基化LMP-2ASTAT3DNMT-1,3A,3BPTEN,p16,p73CpG島甲基化PTEN,p16,p73表達(dá)04. EB病毒參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制EBNA-1的抗凋亡作用EBER的誘導(dǎo)作用EBER(RIG-I)+TLR-3Surv

6、ivin觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)相鄰細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)變化EBNA-1+Sp1凋亡侵襲轉(zhuǎn)移03EB病毒檢測方法EB virus detection method00. 檢測方法概述EB病毒檢測方法03050201電鏡檢測免疫組化基因測序 06脫落細(xì)胞檢測04原位雜交血液檢測01. 血液檢測（1/3）EB病毒檢測方法bac目的基因或蛋白 核酸載量 VCA、EA、EBNA相關(guān)抗體標(biāo)本來源血漿、血清檢測方法嗜異凝集抗體檢測外周血異型淋巴細(xì)胞比例RT-PCR檢測EBV核酸載量EBV特異性抗體與VCA-IgG親和力聯(lián)合檢測VCA-IgGVCA-IgMEA-IgGEBNA-IgGVCA-IgG親和力感染時期未感染EB

7、V/低早期/高恢復(fù)期高既往感染/高復(fù)發(fā)感染01. 血液檢測（2/3）機(jī)體感染EBV后抗體水平變化EB病毒檢測方法VCA-IgG親合力檢測聯(lián)合多抗體檢測對EBV感染時期的解釋優(yōu)點(diǎn)不足01. 血液檢測（3/3）血液檢測EB病毒檢測方法 微創(chuàng) 臨床指標(biāo) 動態(tài)監(jiān)測 定量分析 非定位性 無組織細(xì)胞特異性 難以成為病理診斷直接證據(jù)02. 脫落細(xì)胞檢測EB病毒檢測方法bac標(biāo)本來源 唾液、口腔含漱液 咽喉拭子、鼻咽拭子檢測方法目的基因LMP-1基因RT-PCREB病毒檢測方法優(yōu)點(diǎn)不足02. 脫落細(xì)胞檢測脫落細(xì)胞檢測 取材方便 無創(chuàng) 早期篩查 流行病學(xué)調(diào)查 穩(wěn)定性、特異性低 參考價值有限03. 免疫組化（1/

8、3）EB病毒檢測方法abc標(biāo)本來源石蠟包埋組織目的蛋白LMP-1，LMP-2檢測原理 抗原抗體特異性結(jié)合 化學(xué)顯色原理03. 免疫組化（2/3）EB病毒檢測方法NK/T-LMP1NSCHL-LMP1LPM1不同疾病免疫組化檢測結(jié)果de檢測流程 傳統(tǒng)手工染色 免疫組化儀全自動染色結(jié)果觀察胞膜及胞漿陽性03. 免疫組化（3/3）EB病毒檢測方法優(yōu)點(diǎn)不足 簡便易行 成本較低 細(xì)胞定位免疫組化 陽性率低 穩(wěn)定性、特異性低 易出現(xiàn)假陰性 病理診斷參考價值不高類型EBNA1EBNA2-6LMP-1LMP-2EBER細(xì)胞/疾病潛伏BL細(xì)胞株伯基特淋巴瘤胃癌潛伏BL細(xì)胞株鼻咽癌霍奇金淋巴瘤NK/T細(xì)胞淋巴瘤潛

9、伏LCL傳染性單核細(xì)胞增多癥免疫缺陷相關(guān)B淋巴瘤X染色體相關(guān)淋巴增生疾病潛伏/健康攜帶者血中B細(xì)胞04. 原位雜交（EBER）（1/4）EB病毒檢測方法abc標(biāo)本來源石蠟包埋組織目的基因EBER檢測原理堿基互補(bǔ)，單鏈DNA探針原位雜交，檢測EB病毒RNA片段EBV相關(guān)疾病潛伏感染類型及基因表達(dá)EB病毒檢測方法EBER全自動檢測優(yōu)勢 高效省時 自動化、標(biāo)準(zhǔn)化 節(jié)省人力 試劑覆蓋均勻 孵育環(huán)境可控 降低脫片率 減少廢液量04. 原位雜交（EBER）（2/4）手工操作注意事項 RNA酶污染 試劑的配制 烤片溫度及時間適宜 前處理：脫蠟及干燥 酶消化時間及溫度 加蓋玻片避免氣泡 孵育過程避免試劑蒸發(fā)

10、充分洗滌均需設(shè)有陽性及陰性對照04. 原位雜交（EBER）（3/4）AILT-EBEREBEREBER-LMP1雙染EB病毒檢測方法cHL-EBEREBER-CD20雙染EB病毒檢測方法 細(xì)胞形態(tài)保持較好 細(xì)胞定位準(zhǔn)確：細(xì)胞核，少數(shù)細(xì)胞漿亦著色 穩(wěn)定性好、特異性高 對病理診斷重要的參考價值 組織和細(xì)胞中EBV檢測的金標(biāo)準(zhǔn) 對操作者的熟練和規(guī)范程度要求高 不適合EBV感染的篩查04. 原位雜交（EBER）（4/4）優(yōu)點(diǎn)原位雜交不足05. 電鏡檢測（1/6）EB病毒檢測方法ac標(biāo)本來源新鮮組織、石蠟包埋組織檢測原理重金屬鹽對組織結(jié)構(gòu)的染色程度不同而產(chǎn)生不同的散射強(qiáng)度，在電鏡下表現(xiàn)為不同bd檢測目的

11、鏡下直觀病毒樣顆粒結(jié)果觀察 圓形 直徑100nm300nm 外層有雙層結(jié)構(gòu)的包膜的明暗反差電鏡檢測在EBV病毒發(fā)現(xiàn)過程中具有重要作用05. 電鏡檢測（2/6）EB病毒檢測方法電鏡樣本制作流程光鏡樣本制作流程1mm3取材2cm1.5cm厚度3mm戊二醛鋨酸固定福爾馬林酒精丙酮脫水酒精環(huán)氧丙烷樹脂浸透包埋二甲苯石蠟50-80nm切片3-4m醋酸鈾檸檬酸鉛染色蘇木素伊紅EB病毒檢測方法電鏡檢查在發(fā)現(xiàn)EBV病毒中具有重要作用EBER05. 電鏡檢測（3/6）NK/T細(xì)胞淋巴瘤EB病毒檢測方法EBER05. 電鏡檢測（4/6）鼻咽鱗癌EB病毒檢測方法EBER05. 電鏡檢測（5/6）EBV陽性DLBCL

12、EB病毒檢測方法優(yōu)點(diǎn)不足05. 電鏡檢測（6/6）電鏡檢測 亞細(xì)胞定位準(zhǔn)確 相對定量 穩(wěn)定性、特異性極高 形態(tài)學(xué)證據(jù) 成本較高 耗時長 偏重于科研應(yīng)用06. 基因測序（1/8）EB病毒檢測方法四種富集方式06. 基因測序（2/8）EB病毒檢測方法EB病毒檢測方法06. 基因測序（3/8）Sanger測序基因組技術(shù)特點(diǎn) B95-8（第一個被完整測序的EBV株系） GD1（廣東1型） AG876（第一個完整的2型EBV基因組） 宿主基因組的干擾 拼接組裝困難 低通量EB病毒檢測方法06. 基因測序（4/8）直接NGS測序基因組技術(shù)特點(diǎn) GD2（首個使用NGS獲得其基因組序列的EBV亞型） C666

13、-1（鼻咽癌EBV細(xì)胞系） 其余26種基因型 高通量，速度快，靈敏度高，程序自動化 讀長較短 無法排除宿主基因組DNA的干擾富集方法基因組技術(shù)特點(diǎn)誘導(dǎo)復(fù)制技術(shù)AkataMutu誘導(dǎo)病毒裂解復(fù)制IgM/IgG篩選特定細(xì)胞系PCR富集技術(shù)HKNPC1LCL1，3，9，10設(shè)計多組引物偏向性特異性不高F因子克隆技術(shù)M81大腸埃希菌F因子Sanger確定重復(fù)區(qū)域雜交捕獲技術(shù)HKNPC2-9EBVaGC1-971EBVHN1-18LC1-4RNA探針單鏈DNA探針雙鏈DNA探針EB病毒檢測方法06. 基因測序（5/8）EBV富集+NGS測序06. 基因測序（6/8）EB病毒檢測方法生物信息學(xué)分析 與已有的基因組序列作參考比對 BWT算法 技術(shù)特點(diǎn)：a) 找尋序列的相似性和同源性b) 受編輯距離限制c) 錯配發(fā)生頻率高d) 同源基因的干擾（BHRF-BCL2，BCLF-IL10），序列匹配從頭組裝06. 基因測序（7/8）EB病毒檢測方法生物信息學(xué)分析 不借助外部數(shù)據(jù)，對新基因組的測序 發(fā)現(xiàn)EBV變異體、地域分布規(guī)律意義重大 技術(shù)