分解尿素細(xì)菌分離和計(jì)數(shù)

1、關(guān)于分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)第一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌利用尿素的原因土壤中的細(xì)菌分解尿素是因?yàn)樗鼈兡芎铣呻迕窩O(NH2)2脲酶+ CO2NH3+H2O第二張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月3、常見(jiàn)的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線(xiàn)菌也能分解尿素。4、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌一.研究思路.篩選菌株.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目.設(shè)置對(duì)

2、照第三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月 1、實(shí)例：?jiǎn)⑹荆簩ふ夷康木N時(shí)要根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。原因：因?yàn)闊崛獪囟?0800C，淘汰了絕大多數(shù)微生物只有Taq細(xì)菌被篩選出來(lái)。DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種在體外將少量DNA大量復(fù)制的技術(shù)，此項(xiàng)技術(shù)要求使用耐高溫（930C）的TaqDNA聚合酶。.篩選菌株第四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等；配置合適的培養(yǎng)基方法：抑制大多數(shù)微生物生長(zhǎng)造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，結(jié)果：培養(yǎng)一定時(shí)間后，該菌數(shù)量上升，再通過(guò)稀釋涂布平板法等方法對(duì)它進(jìn)行純化培養(yǎng)分離。

3、2、實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。第五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類(lèi)？從功能上屬于哪類(lèi)培養(yǎng)基？固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素選擇培養(yǎng)基第六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不

4、能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。4、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。第七張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1、顯微鏡直接計(jì)數(shù)：利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對(duì)高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀(guān)察；有時(shí)候需要染色缺點(diǎn)第八張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月2.間接計(jì)數(shù)法（1）常用方法： 當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表 面

5、生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋 液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的 菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有 多少活菌。（2）原理：稀釋涂布平板法。第九張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月二.實(shí)驗(yàn)的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。第十張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月應(yīng)在火焰旁稱(chēng)取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌

6、落數(shù)在30300之間、適于計(jì)數(shù)的平板三樣品的稀釋第十一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？原因：土壤中各類(lèi)微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2 185萬(wàn)，放線(xiàn)菌數(shù)約為477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.1萬(wàn)。結(jié)論：為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。第十二張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.取樣涂布實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記。注明培養(yǎng)基類(lèi)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說(shuō)明稀釋操作

7、比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第十三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月.微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌：3037培養(yǎng)12d放線(xiàn)菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。第十四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。第

8、十五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月注意事項(xiàng)為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。為了減少誤差可將同一稀釋度涂布三個(gè)或三個(gè)以上的平皿中，經(jīng)涂布，培養(yǎng)計(jì)算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個(gè)稀釋度中的第二個(gè)稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個(gè)左右為最好。第十六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月微生物的培養(yǎng)與觀(guān)察第十七張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月三.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.

9、提示：選擇每個(gè)平板上長(zhǎng)有30300個(gè)菌落的稀釋倍計(jì)算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實(shí)驗(yàn)不精確。第十八張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。.設(shè)置對(duì)照：設(shè)置對(duì)照的方法：空白對(duì)照：不給對(duì)照組任何處理因素。條件對(duì)照：給對(duì)照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素，但不是所要研究的 處理因素。自身對(duì)照：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對(duì)象上進(jìn)行。相互對(duì)照：不單設(shè)對(duì)照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照。第十九張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月A同學(xué)統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為150個(gè),而其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果為5

10、0個(gè).A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有哪些呢?一是由于土樣不同；二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。第二十張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月小結(jié)：通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。方案一：由其他同學(xué)用與A同學(xué)相同土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 方案二：將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結(jié)果預(yù)測(cè)：如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。第二十一張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月大腸桿菌呈黑色 ,有金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)上典型特征 第二十二

11、張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月四、鑒別培養(yǎng)基:在培養(yǎng)基里加酚紅指示劑,若培養(yǎng)基變紅,可以認(rèn)為里面有分解尿素的細(xì)菌CO(NH2)2脲酶+ CO2NH3+H2O第二十三張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月本課題知識(shí)小結(jié):第二十四張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月例2在微生物群體生長(zhǎng)規(guī)律的測(cè)定中，種內(nèi)斗爭(zhēng)最顯著最激烈的時(shí)期是A調(diào)整期 B對(duì)數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期解析：種內(nèi)斗爭(zhēng)是一種生態(tài)因素。種內(nèi)斗爭(zhēng)反應(yīng)了種內(nèi)生物對(duì)生存空間和生活資源的爭(zhēng)奪。在生活空間充裕，營(yíng)養(yǎng)充足的時(shí)候，種內(nèi)斗爭(zhēng)的程度是比較低的。隨著微生物個(gè)體數(shù)目的增加，每個(gè)個(gè)體的生存空間越來(lái)越少，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也越來(lái)越少，每個(gè)

12、個(gè)體對(duì)生存空間和資源的爭(zhēng)奪也越來(lái)越激烈，種內(nèi)斗爭(zhēng)就越來(lái)越激烈。由此可知，在穩(wěn)定期的種內(nèi)斗爭(zhēng)最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經(jīng)開(kāi)始減少，pH已經(jīng)極度不適于微生物的生存，次級(jí)代謝產(chǎn)物積累到很高的程度，這時(shí)的微生物的生存斗爭(zhēng)主要是與無(wú)機(jī)環(huán)境的斗爭(zhēng)。答案：C第二十五張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.至少接種一種細(xì)菌 C.接種一個(gè)細(xì)菌 D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細(xì)菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所

13、需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實(shí)踐訓(xùn)練A CD第二十六張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月4.下列說(shuō)法不正確的是（ ） A.科學(xué)家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類(lèi)最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質(zhì) B.較多的碳源物質(zhì) C.青霉素類(lèi)藥物 D.高濃度食鹽BC第二十七張，PPT共二十九頁(yè)，創(chuàng)作于2022年6月例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細(xì)菌感染的藥物，其高效性和巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值使抗生素工業(yè)經(jīng)久不衰。其中青霉素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用具有劃時(shí)代的意義。青霉素發(fā)酵產(chǎn)生青霉素。青霉菌的新陳代謝類(lèi)型是 ，青霉素