HLAA0201BSP融合基因的構(gòu)建與原核表達(dá)

1、HLA-A*0201-BSP交融基因的構(gòu)建與原核表達(dá)孫萬軍，杜建芳，徐東剛，鄒民吉，王金鳳，蔡欣，王穎，王嘉璽，艾輝勝【摘要】克隆表達(dá)可生物素化的HLA-A*0201的重鏈胞外區(qū)是制備HLA-A*0201-肽四聚體的先決條件。本研究構(gòu)建重組HLA-A*0201-BSP交融基因的表達(dá)載體，以制備HLA-A2四聚體。按照已報(bào)道的序列方案特異引物，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反響RT-PR要領(lǐng)從已斷定為HLA-A*0201基因型的康健人白細(xì)胞中克隆HLA-A*0201重鏈胞外區(qū)的基因，拼接上依靠生物素-卵白毗連酶bitin-prtEinligase，BirA的可生物素化序列BirAsubstratepepti

2、de，BSP，構(gòu)建HLA-A*0201-BSP的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌DH5中舉行表達(dá)。效果表白：樂成擴(kuò)增出HLA-A*0201-BSP交融基因并測(cè)序證明，構(gòu)建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大腸桿菌DH5中高效表達(dá)HLA-A*0201-BSP交融卵白，表達(dá)量占菌體總卵白的28%，以包容體的情勢(shì)表達(dá)，經(jīng)洗滌、變性后，以SepharylS-300HRS-300柱層析純化，純度可達(dá)90%以上。結(jié)論：得到了高效表達(dá)HLA-A*0201-BSP的大腸桿菌工程菌株，創(chuàng)立了輕便有用的包容體純化要領(lǐng)，為制備HLA-A*0201-肽四聚體奠基了基?！娟P(guān)鍵詞】HLA-A*0201；HLA-A*

3、0201-BSP交融基因；HLA-A2四聚體；可生物素化序列l(wèi)ningandExpressinfHLA-A*0201-BSPKeyrdsHLA-A*0201;HLA-A*0201-BSPfusingene;HLA-A2tetraers;BirAsubstratepeptide重要構(gòu)造相容性復(fù)合體H-類分子漫衍在全部有核細(xì)胞的外貌，其作用是將細(xì)胞內(nèi)顛末加工的抗原肽呈遞到細(xì)胞外貌，并充當(dāng)T細(xì)胞受體TR識(shí)別抗原肽的限定性分子。在抗原呈遞細(xì)胞外貌的H-類分子與抗原肽構(gòu)成的復(fù)合物被TR識(shí)別后，抗原特異性D8+T細(xì)胞在共刺激分子的幫助作用下被激活，產(chǎn)生細(xì)胞增殖并排泄細(xì)胞因子，進(jìn)而在機(jī)體抗腫瘤、抗熏染及抗移

4、植物等免疫反響中發(fā)揮緊張作用。1996年，Altan等1首創(chuàng)的H-肽四聚體技能正是基于對(duì)這一體內(nèi)識(shí)別歷程的體外模擬，得到了對(duì)抗原特異性D8+T細(xì)胞的準(zhǔn)確定量，成為定量檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的金尺度。本研究應(yīng)用基因工程技能，在樂成克隆了HLA-A*0201重鏈胞外區(qū)基因后，將依靠生物素-卵白毗連酶bitin-prteinligase，BirA的可生物素化序列BirAsubstratepeptide，BSP毗連到其胞外區(qū)末了，構(gòu)建成交融表達(dá)載體，在大腸桿菌DH5中得到了高效表達(dá)，并對(duì)得到的交融卵白舉行了純化，為進(jìn)一步制備抗原特異性的HLA-A*0201四聚體奠基了基矗質(zhì)料和要領(lǐng)質(zhì)料大腸桿菌E.liD

5、H5和質(zhì)粒pBV220均為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院底子醫(yī)學(xué)研究所基因工程研究室保存。TRIZL試劑、RT-PR試劑、限定性內(nèi)切酶ER和BaH、T4DNA毗連酶、DNA凝膠接納試劑盒、質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購自Prega公司。淋巴細(xì)胞分散液購自GibBRL公司。SepharylS-300HRS-300膠為Pharaia公司產(chǎn)物。尿素、二硫蘇糖醇等為入口或國(guó)產(chǎn)闡發(fā)純?cè)噭?。要領(lǐng)HLA-A*0201基因型康健人白細(xì)胞總RNA抽提及DNA合成取HLA配型查抄斷定為HLA-A*0201基因型的康健成年志愿者肝素抗凝靜脈血2l，按通例要領(lǐng)以淋巴細(xì)胞分散液分散外周血單個(gè)核細(xì)胞，以TRIZL試劑提取總RNA，直接舉行逆轉(zhuǎn)

6、錄反響。反響體積為20l。起首在6lDEP水中參加2g總RNA，10l/LligdT1l，在70變性5分鐘后置冰裕再參加5反響緩沖液4l，2.5l/LdNTP混淆物2l，RNasin40U，及AV逆轉(zhuǎn)錄酶10U，42反響1小時(shí)后，于85溫育5分鐘停頓反響，合成的DNA即可用于PR擴(kuò)增或存-20。RNA完備性以1%瓊脂糖凝膠電泳及擴(kuò)增管家基因GAPDH舉行驗(yàn)證。HLA-A*0201重鏈胞外區(qū)基因的PR擴(kuò)增按照IGT/HLA數(shù)據(jù)庫中的HLA-A*020221的DNA序列方案引物。上游引物P1為：5-GGAATTATGGGTTATATGAGGTATTT-3，含起始暗碼子，ER識(shí)別位點(diǎn)。卑劣引物P2為

7、：5-TGAGGGGTTGGGAAA-3。引物由上海博亞生物技能合成。該對(duì)引物擴(kuò)增出的片斷為HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)基因1-811堿基序列。PR反響在20l體積中舉行，以0.5lDNA第一鏈為模板，反響條件為在94變性5分鐘，然后94變性30秒，52退火30秒，72延伸40秒，共舉行32次循環(huán)后，于72延伸7分鐘。得到的PR產(chǎn)物稱為A2。交融BSP序列的HLA-A*0201重鏈胞外區(qū)基因的重疊延伸PR擴(kuò)增為在HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)成熟卵白序列1-276氨基酸羧基端毗連可生物素化序列BirAsubstratepeptide，BSPLHHILDAQKVNHR，方案的引物P3如

8、下：5-GGGATTTAAGATGATTAAATTTTTGTGATAGAATATGATGAGAGAGGGTATTAGGGTGAGGGGTTGGGAAA-3，此中包羅HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)基因812-828堿基、編碼Gly-Ser討論和BSP的DAN序列，以及停頓暗碼子、BaH識(shí)別位點(diǎn)。重疊延伸PR反響在20l體積中舉行，以0.5l上述得到的PR產(chǎn)物A2為模板，僅參加1l引物P3，在94變性5分鐘，然后94變性30秒，56退火30秒，72延伸40秒，共舉行8次循環(huán)；之后，在上述反響體系中參加引物P1，在94變性3分鐘，然后94變性30秒，52退火30秒，72延伸40秒，共舉行25次循

9、環(huán)；再于72延伸7分鐘。得到的PR產(chǎn)物即為HLA-A*0201-BSP交融基因片斷。HLA-A*0201-BSP交融表達(dá)載體的構(gòu)建及測(cè)序斷定質(zhì)粒提娶酶切、毗連、轉(zhuǎn)化和斷定等，均按Sabrk實(shí)行手冊(cè)2舉行。將擴(kuò)增的HLA-A*0201-BSP交融基因片斷接納后，以ER和BaH雙酶切，與經(jīng)相應(yīng)酶切后的質(zhì)粒pBV220毗連，轉(zhuǎn)化E.liDH5感覺態(tài)細(xì)胞，涂板，挑克隆及小量擴(kuò)增后，以堿裂解法提取質(zhì)粒，雙酶切法挑選接入HLA-A*0201-BSP交融基因的轉(zhuǎn)化子，提交上海博亞生物技能舉行測(cè)序。SDS濃縮膠濃度為5%，分散膠濃度為15%，以考馬斯亮藍(lán)R250染色表現(xiàn)卵白條帶。效果HLA-A*0201-BS

10、P交融基因的PR擴(kuò)增按照IGT/HLA數(shù)據(jù)庫中的HLA-A*020221的DNA序列方案引物P1、P2，以HLA-A*0201基因型的康健人白細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄第一鏈DNA為模板舉行PR反響，擴(kuò)增出一條與估計(jì)巨細(xì)822bp符合的DNA片斷圖1。該DNA片斷為HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)基因1-811堿基序列。又以上述得到的PR產(chǎn)物A2為模板，以引物P1、P3經(jīng)重疊延伸PR擴(kuò)增出1條與估計(jì)巨細(xì)901bp符合的DNA片斷圖2。該DNA片斷可編碼HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)1-276氨基酸和BSP，并編碼兩者間的Gly-Ser討論。HLA-A*0201-BSP交融表達(dá)載體的構(gòu)建及斷定經(jīng)P

11、R擴(kuò)增出的長(zhǎng)度為901bp的DNA片斷經(jīng)ER和BaH雙酶切后，與同樣酶切的pBV220毗連，轉(zhuǎn)化DH5，挑選接入目的基因的陽性克隆圖3，經(jīng)測(cè)序證明插入序列為含起始暗碼ATG，且準(zhǔn)確編碼HLA-A*020221重鏈胞外區(qū)1-276氨基酸和BSP的基因，與IGT/HLA數(shù)據(jù)庫中宣布的HLA-A*020221序列、Altan等1報(bào)道的BSP序列完全同等。構(gòu)建的表達(dá)載體稱pBV220-HLA-A*0201-BSP。HLA-A*0201-BSP在E.li中的表達(dá)和純化討論H-類分子是由具有高度多肽性的重鏈和守舊的輕鏈,即2-微球卵白構(gòu)成的異源二聚體。在抗原呈遞細(xì)胞AP內(nèi)合成的抗原短肽，即結(jié)合于由H-類分

12、子重鏈的1和2布局域構(gòu)成的肽結(jié)合槽內(nèi)，而2-微球卵白2與重鏈的3布局域的非共價(jià)結(jié)合使H-類分子-肽復(fù)合物越發(fā)不變，終極定位于細(xì)胞外貌，并通過與抗原特異性的D8+T細(xì)胞外貌的TR彼此作用使之激活，進(jìn)而殺傷靶細(xì)胞。假設(shè)在體外制備H-肽復(fù)合物，模擬AP/特異性靶細(xì)胞外貌H呈遞的多肽復(fù)合物，通過與體內(nèi)T細(xì)胞的TR特異性結(jié)合，就可到達(dá)直接檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞的目的。但可溶性的H-肽復(fù)合物單體與TR結(jié)合的親和力很低、解離速率快。H-肽四聚體技能那么落服了這一困難，其精良之處在于利用基因工程技能得到H-類分子重鏈時(shí)，在其羧基端交融1段由15個(gè)氨基酸構(gòu)成的BirA酶依靠的可生物素化序列BSP，從而可以利用Bi

13、rA酶在BSP序列內(nèi)的賴氨酸殘基上接一個(gè)生物素分子3。在此交融卵白與2、抗原肽折疊成可溶性H-肽單體分子后，即可對(duì)其生物素化。利用1分子鏈親和素可結(jié)合4分子生物素的性子，進(jìn)一步與熒光標(biāo)識(shí)表記標(biāo)幟的鏈親和素結(jié)合，便可得到均一的四聚體。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，即可用于抗原特異性T細(xì)胞的定性和定量闡發(fā)4,5。為制備HLA-A*0201-肽四聚體，起首需克隆表達(dá)可生物素化的HLA-A*0201的重鏈胞外區(qū)。之以是選擇HLA-A*0201，是由于漢族群體中此基因頻率在類分子中最高，凌駕30%的個(gè)別表達(dá)此分子6。如今對(duì)H-肽單體的生物素化重要接納BirA酶對(duì)可識(shí)別序列BSP的生物素化和化學(xué)試劑生物素化兩種形式7。

14、本研究亦接納了在HLA-A*0201的重鏈胞外區(qū)羧基端交融BSP序列的計(jì)謀來實(shí)現(xiàn)生物素化目的。在進(jìn)一步的實(shí)行中，我們又探究了對(duì)HLA-A*0201的重鏈胞外區(qū)實(shí)行化學(xué)試劑生物素化的形式，也獲樂成另文頒發(fā)。選擇符合的載體-宿主體系是外源基因在原核體系內(nèi)高效表達(dá)的關(guān)鍵之一。本研究選用了含有PRPL啟動(dòng)子的表達(dá)載體pBV220構(gòu)建交融表達(dá)載體pBV220-HLA-A*0201-BSP，重要是思量該載體為溫控型表達(dá)載體，相對(duì)付需利用異丙基硫代-D半乳糖苷IPTG舉行誘導(dǎo)的表達(dá)載體如pET系列載體等而言，其誘導(dǎo)要領(lǐng)輕便、本錢低廉，且目的卵白表達(dá)不變。這對(duì)付制備大量純化的目的卵白以構(gòu)建HLA-A*0201-肽四聚體無疑是具有相稱上風(fēng)的。在轉(zhuǎn)化至pBV220最適宿主菌E.liDH5誘導(dǎo)后創(chuàng)造，目的卵白重要存在于包容體中，表達(dá)量約占菌體總卵白的28%。形成包容體使目的卵白免受胞內(nèi)酶的落解作用，易于以高純度和高濃度方法分散。在得到HLA-A*0201-BSP包容體后，經(jīng)洗滌、尿素溶解，以S-300柱層析純化，即可得到較高純度90%的重組卵白，要領(lǐng)輕便，完全滿意制備四聚體的必要。因此，無需為了純化便利而在HLA-A*0201-BSP的端交融His6標(biāo)簽8，且末了引入外源氨基酸，從而大概半數(shù)疊形成HLA-肽復(fù)合物單體造成影響，使終極得到的四聚體特異性產(chǎn)生改變。通過原核表達(dá)得到的HLA