免疫檢測的基礎(chǔ)知識介紹

1、免疫檢測的根底知識介紹ELISA是一種免疫測定。免疫測定(immunoassay,IA)是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反響檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)?？乖乖悄茉跈C(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？乖M(jìn)入機(jī)體后，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測定中，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì)。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的，稱為半抗原(hapten)。例如某些激素、藥物等?？乖姆错懶匀Q于抗原決定簇(antigenicdeterminant)，或稱為表位(epitope)。一個

2、抗原分子可帶有不同的決定簇。抗體抗體的構(gòu)造抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。Ig由兩個輕鏈(L)和兩個重鏈(H)的單體組成。Ig的輕鏈?zhǔn)且粯拥?，有k(kappa)和入(Lambda)兩種型別。五類Ig的重鏈構(gòu)造不同，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為丫(gamma鏈和小(mu)鏈。IgG的構(gòu)造見圖。一重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)

3、生特異性結(jié)合(見圖)，是抗體專一性結(jié)合抗原的構(gòu)造根底。木瓜酶裂解部位胃蛋白酶裂解部位一IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個區(qū)段，其中兩個一樣的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段(Fab)。每個Fab都保存結(jié)合抗原的才能，但只有一個抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價的,與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀。另一區(qū)段稱Fc段，無抗體活性，但具有IgG特有的抗原性。IgG可被胃蛋白酶分解為兩個片段，一個Fab雙體，稱F(ab)2,能和兩個一樣的抗原結(jié)合；另一片段類似Fc,隨后被分解成小分子多肽，無生物活性。IgM是由五個單體組成的五聚體，含10個重鏈和10個輕鏈，具有10個抗原結(jié)合價，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個抗原結(jié)合價。IgM分子量約

4、為900000,IgG分子量約為150000。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。IgM抗體一般為保護(hù)性抗體，具有免疫性。因此IgM抗體的測定，對某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價值?？贵w的產(chǎn)生機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）。每一系B細(xì)胞只產(chǎn)生針對某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個抗原決定簇的抗原注入機(jī)體，那么將由多系的B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的多種抗體，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測定中所用的抗血清一般用抗原免

5、疫兔、羊或馬制得。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞可在體外與繁殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞交融成雜交瘤細(xì)胞。將單個雜交瘤細(xì)胞別離，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)而分泌的抗體單克隆抗體（monoclonalantibody,McA睽Mab）。單克隆抗體僅針對一種抗原決定簇，具有很高的特異性。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備。將免疫的脾細(xì)胞（含產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞）與小鼠腫瘤細(xì)胞交融，別離雜交瘤細(xì)胞，接種于小鼠腹腔，產(chǎn)生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體?？乖贵w反響可逆性抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動態(tài)平衡，其反響式為：Ag+AbAg-Abo.抗體的親和力（afinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以平衡常數(shù)K表示：K=Ag

6、-Ab/AgAb。AgAb的解離程度與K值有關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適宜，兩者結(jié)合結(jié)實，不易解離。解離后的抗原或抗體均能保持原有的構(gòu)造和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體。在抗血清中，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體，稱為親和層析純抗體，應(yīng)用于免疫測定中可得到更好的效果。最適比例在恒定量的抗體中參加遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖1-4。曲線的頂峰部分是抗原抗體比例最適宜的范圍，稱為等價帶（zoneofequivalence）。在等價帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶。假設(shè)抗原或抗體極度過剩，那么無沉淀物

7、形成，在免疫測定中稱為帶現(xiàn)象（zonephenomenon）。抗體過量稱為前帶（prezone）,抗原地過量稱為后帶（postzone）。在用免疫學(xué)方法測定抗原時，應(yīng)使反響系統(tǒng)中有足夠的抗體量，否那么測得的量會小于實際含量，甚至出現(xiàn)假陰性。特異性抗原抗體的結(jié)合本質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間。由于兩者在化學(xué)構(gòu)造和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系，所以抗原抗體反響具有高度的特異性。例如乙肝病毒中的外表抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg）,雖來源于同一病毒，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反響。抗原抗體反響的這種特異性使免疫測定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)

8、化合物（例如血清）中測定某一特定的物質(zhì)，而不需先別離待檢物。但是這種特異性也不是絕對的。假使兩種化合物有著部分一樣的構(gòu)造，在抗原抗體反響中可出現(xiàn)穿插反響。例如：絨毛膜促性腺激素（hCG）和黃體生成激素（LH）均由a和B兩個亞單位組成，其構(gòu)造的不同處在B亞單位，而兩者的a亞單位是同類的。用hCG免疫動物所得的抗血清中含有抗a-hCG和抗B-hCG兩種抗體，抗a-hCG抗體將與LH發(fā)生穿插反響。在臨床檢驗中，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG只能用于hCG濃度較高的試驗，否那么婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生穿插反響。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)到達(dá)50mIu/mlhCG

9、）的實際中必須應(yīng)用只對hCG特異的抗B-hCG,以防止與其它激素的穿插反響的發(fā)生。敏感性在測定血清中某一物質(zhì)的含量時，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml程度，酶反響測定法的敏感度約為510仙g/ml,免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反響法相仿。標(biāo)記的免疫測定的敏感度可進(jìn)步數(shù)千倍，達(dá)ng/ml程度。例如，用放射免疫測定法或酶免疫測定法測定HBsAg具敏感度可達(dá)0.1ng/ml。免疫測定在臨床檢驗中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測定的應(yīng)用范圍極廣，在臨床檢驗中可用于測定：體液中的各種蛋白質(zhì)

10、，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等。激素，包括小分子量的甾體激素等?？股睾退幬?。4）病原體抗原，HBsAgHBeAcJo5）另外，也可利用純化的抗原檢測標(biāo)本中的抗體，例如抗-HBs等。標(biāo)記的免疫測定如上所述，免疫測定是一種很敏感的測定方法，抗原抗體反響后直接測定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)510仙g/ml,但在臨床檢驗中，某些待測物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一程度，因此要尋找增加敏感度的方法。標(biāo)記的免疫測定是將檢測試劑中的抗原或抗體用可微量測定的物質(zhì)加以標(biāo)記，通過測定標(biāo)記物來進(jìn)步敏感度。在放射免疫測定和酶免疫測定中，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶，最后用測定放射性和酶活力來計算待檢物的量，敏感度可比

11、直接測定沉淀物進(jìn)步數(shù)百至數(shù)千倍。在標(biāo)記免疫測定中，一般參加過量的標(biāo)記試劑以保證與待測物徹底反響。以標(biāo)記抗體（Ab）檢測抗原（Ag）為例，反響式如下：Ag+AbX-AgAb+AbX。在反響產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab和游離和AbX,如不將兩者別離而測定標(biāo)記物，測得的結(jié)果將為兩者之和。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的別離是標(biāo)記免疫測定中的重要步驟。可采用多種手段，固相載體是其中之一。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反響，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab除去，結(jié)合標(biāo)記物的測定可在固相上進(jìn)展。酶免疫測定酶免疫測定(enzymeimmunoassay)可分為均相(homogenous)和非均相(heterogenous)兩種類型。在均相EIA中可不需進(jìn)展游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的別離而直接測定標(biāo)記物。例如在某種條件下，抗原抗體反響后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對底物作用的活力，因此測出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗中較少應(yīng)用。非均相EIA需