藥敏試驗(yàn)方法及耐藥菌株的檢測(cè)課件(PPT 101頁(yè))

1、藥敏試驗(yàn)的方法及耐藥菌株檢測(cè)昆明市延安醫(yī)院檢驗(yàn)科 黃云昆1第1頁(yè)，共101頁(yè)。主要內(nèi)容抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的目的和方法紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序臨床上重要的耐藥細(xì)菌及檢測(cè)方法2第2頁(yè)，共101頁(yè)。什么是抗菌藥物的敏感性試驗(yàn)？測(cè)定抗菌藥物在體外抑制病原微生物生長(zhǎng)的效力，稱抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的抑菌試驗(yàn)，或稱細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性試驗(yàn)。3第3頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏試驗(yàn)的適應(yīng)征當(dāng)某種細(xì)菌被認(rèn)為是感染性疾病病原，需抗生素治療而該細(xì)菌的藥敏譜不能從其種屬推知時(shí)，即須做藥敏試驗(yàn)正常菌群或已知目前對(duì)基本藥物尚未出現(xiàn)耐藥株的細(xì)菌不需做藥敏試驗(yàn).4第4頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏試驗(yàn)的目的和意義供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物時(shí)的參考

2、細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)和耐藥性變遷評(píng)價(jià)新抗菌藥物的藥效學(xué)特征對(duì)細(xì)菌耐藥譜分析和分型有助于某些菌種的鑒定作為醫(yī)院內(nèi)感染流行病學(xué)調(diào)查的手段之一5第5頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏試驗(yàn)的方法稀釋法試管稀釋法（肉湯稀釋法）平板稀釋法（瓊脂稀釋法）擴(kuò)散法（紙片法）Kirby-Bauer(K-B)法Stockes法E-Test(Epsilometer test) 6第6頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏試驗(yàn)的方法自動(dòng)微生物鑒定藥敏系統(tǒng)：結(jié)果為MIC,ml。耐藥篩選試驗(yàn)和折點(diǎn)敏感試驗(yàn) 聯(lián)合藥敏試驗(yàn):兩種藥物的協(xié)同,無(wú)關(guān),拮抗關(guān)系.7第7頁(yè)，共101頁(yè)。稀釋法原理：以一定濃度的抗菌藥物與含有被測(cè)菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行一系列的對(duì)倍稀釋經(jīng)培養(yǎng)后，肉眼

3、觀察細(xì)菌生長(zhǎng)的情況最低抑菌濃度（MIC）：肉眼觀察能抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低一管藥物濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）瓊脂稀釋法試管稀釋法肉湯微量法8第8頁(yè)，共101頁(yè)。紙片擴(kuò)散法（Kirby-Bauer，K-B法） 9第9頁(yè)，共101頁(yè)。E-試驗(yàn)（E-Test）原理：基本同擴(kuò)散法，即濃度呈連續(xù)梯度的抗菌藥物從塑料紙條中向藥敏瓊脂中擴(kuò)散，在試條周圍濃度范圍內(nèi)檢測(cè)菌的生長(zhǎng)被抑制，從而形成透明的抑菌圈。 E-test綜合了稀釋法和擴(kuò)散法的原理和特點(diǎn)，直接定量測(cè)出藥物對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度（MIC）。 菌液，藥敏平板要求同K-B法 E-Test條寬5mm，長(zhǎng)6

4、0mm 150mm平皿貼6條、 90mm平皿貼1條10第10頁(yè)，共101頁(yè)。CLSI的簡(jiǎn)單介紹 NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì) 已經(jīng)被我國(guó)衛(wèi)生部指定為部頒標(biāo)準(zhǔn) 每年有新版CLSI （Clinical and Laboratory StandardsInstitute） 美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 2005年11第11頁(yè)，共101頁(yè)。紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)（KB法）原理：將浸有抗菌藥物的紙片貼在涂有細(xì)菌的瓊脂平板上，抗菌藥物在瓊脂內(nèi)向四周擴(kuò)散，因此敏感細(xì)菌在紙片周圍一定距離內(nèi)的

5、生長(zhǎng)受到抑制，形成相應(yīng)的抑菌圈，其大小與該藥物的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)關(guān)，根據(jù)抑菌圈的大小即可推知該藥物的MIC，可將藥敏結(jié)果判斷為敏感、中介和耐藥。12第12頁(yè)，共101頁(yè)。KB法藥敏培養(yǎng)基腸桿菌科，銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥假單胞菌等非發(fā)酵菌Mueller-Hinton （MH）瓊脂，pH7.27.4，厚度4mm葡萄球菌屬、腸球菌屬M(fèi)ueller-Hinton（MH）瓊脂肺炎鏈球菌、溶血鏈球菌、草綠鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌5%脫纖維羊血MH瓊脂13第13頁(yè)，共101頁(yè)。KB法藥敏培養(yǎng)基嗜血桿菌屬Haemophilus Test Medium（HTM），添加SR158或

6、1%血紅蛋白和1%X、V因子復(fù)合物MH淋病奈瑟球菌1%血紅蛋白和1%X、V因子復(fù)合物的GC瓊脂14第14頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序測(cè)試菌準(zhǔn)備：所測(cè)菌種必須是純的、1624小時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）培養(yǎng)物，不純菌種需首先分純，否則不得進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 15第15頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序菌液濃度制備直接菌懸液法：挑取平皿上至少3個(gè)已分純菌落于無(wú)菌生理鹽水中，制備成0.5麥?zhǔn)蠁挝?McFarland)標(biāo)準(zhǔn)的菌懸液（1.5108CFU/ml），用0.5麥?zhǔn)蠁挝粯?biāo)準(zhǔn)比濁管或比濁儀校正，制備好的菌懸液需15分鐘內(nèi)接種完畢生長(zhǎng)法 ：肉湯培養(yǎng)基增菌、校正濃度16第16頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序0.5M標(biāo)準(zhǔn)比濁管的制作：0.

7、5mL0.048mol/L的Bacl2（1.175%w/v Bacl2H2O）+99.5mL0.18mol/LH2SO4 (1%v/v),混勻，分裝，密封，每月更換或核實(shí)。確認(rèn)方法：分光光度計(jì)d=1cm、=625nm，OD=0.080.10。17第17頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序接種菌液：用無(wú)菌且沒(méi)有毒性的棉簽蘸取菌液后，將棉簽在管壁上輕輕旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉多余的菌液將蘸有菌液的棉簽置于瓊脂表面，從平皿最頂端開(kāi)始往外均勻涂布菌液至整個(gè)平皿，然后旋轉(zhuǎn)平板600 ，繼續(xù)從平皿頂端開(kāi)始涂布，再重復(fù)2次（共3次），最后沿平板邊緣涂抹一周。18第18頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序貼抗菌藥物紙片：接種好菌液的平板置

8、室溫干燥35分鐘，待平板上的水分被瓊脂完全吸收，用鑷子取紙片一張，貼在瓊脂平板表面，輕壓使其貼平，貼好的紙片不可再拿起，因紙片中的藥物已擴(kuò)散到培養(yǎng)基中。各紙片中心相距24 mm，紙片距平板邊緣15 mm。即直徑90mm平板每個(gè)5片 19第19頁(yè)，共101頁(yè)。抗菌藥物紙片的貯存藥敏紙片的貯存大量長(zhǎng)期貯存-200C以下常規(guī)用量40C冰箱保存使用前將貯存容器移至室溫平衡12小時(shí)，避免開(kāi)啟貯存容器時(shí)產(chǎn)生冷凝水。20第20頁(yè)，共101頁(yè)?？咕幬锏倪x擇：CLSI分組A組一級(jí)試驗(yàn)并常規(guī)報(bào)告的藥物B組一級(jí)試驗(yàn)有選擇報(bào)告的藥物C組補(bǔ)充試驗(yàn)有選擇報(bào)告的藥物U組僅用于泌尿道的補(bǔ)充試驗(yàn)的藥物O組對(duì)該組細(xì)菌有臨床適應(yīng)

9、證但一般不允許常規(guī)試驗(yàn)與報(bào)告的藥物Inv組對(duì)該菌群做研究用且尚未經(jīng)FDA批準(zhǔn)的藥物21第21頁(yè)，共101頁(yè)。22第22頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序孵育：將貼好紙片的藥敏平板放入培養(yǎng)箱內(nèi)，平板在孵箱內(nèi)最好單獨(dú)擺放，如疊放不得超過(guò)2個(gè)。23第23頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序孵育條件腸桿菌科： 35 2 ，16-18h銅綠： 35 2 ，16-18h，囊性纖維化病人需延長(zhǎng)至24h不動(dòng)桿菌、嗜麥芽、洋蔥：20-24h葡萄球菌：33-35 （不可 35 )，金葡16-18h ,SCoN24h，OXA、MET、NAF、VAN、FOX24h腸球菌： 35 2 ，16-18h，VAN 24h24第24頁(yè)，共101頁(yè)。

10、操作程序孵育條件溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌腦膜炎奈瑟菌 35 2 、5%CO2淋病奈瑟菌 36 1 （不可37 )、5%CO2 溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、奈瑟菌屬20-24小時(shí)流感嗜血桿菌16-18小時(shí)25第25頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序抑菌環(huán)直徑（mm）的測(cè)量：將藥敏平板倒置，在直射光下測(cè)量用精確度為1 mm的游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌環(huán)直徑。抑菌環(huán)的邊以肉眼見(jiàn)不到細(xì)菌生長(zhǎng)為限。對(duì)鏈球菌、嗜血桿菌等因血平皿或特珠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)充平皿的影響，可將平皿蓋移去，在反射光下測(cè)量對(duì)某些特殊的細(xì)菌和抗菌藥則需要用透射光，如量取苯唑西林或Va對(duì)葡萄球菌的抑菌圈時(shí)，必須要觀察抑菌圈內(nèi)是否存在任何生長(zhǎng)的菌落。26

11、第26頁(yè)，共101頁(yè)。應(yīng)注意溶血性細(xì)菌的結(jié)果閱讀鏈球菌 -溶血性鏈球菌 草綠色鏈球菌 肺炎鏈球菌等 應(yīng)忽略溶血圈，讀取生長(zhǎng)完全被抑制處27第27頁(yè)，共101頁(yè)。應(yīng)注意產(chǎn)色素細(xì)菌的結(jié)果閱讀有些細(xì)菌會(huì)在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生色素 銅綠假單胞菌 黃桿菌 沙雷菌 應(yīng)忽略色素分泌圈，讀取生長(zhǎng)完全被抑制處28第28頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序?qū)ψ冃螚U菌藥敏及磺胺藥產(chǎn)生的抑菌環(huán)內(nèi)會(huì)出現(xiàn)輕微生長(zhǎng)，如生長(zhǎng)的菌膜厚度20%可忽略不計(jì) 29第29頁(yè)，共101頁(yè)。操作程序結(jié)果的判斷：按CLSI最新判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷為敏感、中介或耐藥 30第30頁(yè)，共101頁(yè)。臨床意義敏感（susceptible,S）：測(cè)試菌可被常規(guī)劑量、常規(guī)給藥途徑

12、在體內(nèi)所能達(dá)到的血藥濃度所抑制或殺滅。中介(intermediate,I)：測(cè)試菌對(duì)常規(guī)劑量、常規(guī)給藥途徑在體內(nèi)所能達(dá)到的血藥濃度敏感性降低，加大劑量、藥物濃集部位可能有效；實(shí)驗(yàn)因素所致的不可判斷。耐藥(resistance,R)：細(xì)菌對(duì)藥物的相對(duì)抗性。31第31頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏報(bào)告中的注意事項(xiàng)分離自腦脊液標(biāo)本的細(xì)菌下列抗菌藥不能報(bào)告口服藥第一代、第二代頭孢菌素(除頭孢呋辛)克林霉素大環(huán)內(nèi)酯類四環(huán)類氟喹諾酮類32第32頁(yè)，共101頁(yè)。藥敏報(bào)告中的注意事項(xiàng)分離自尿液標(biāo)本的細(xì)菌下列抗菌藥不常規(guī)報(bào)告阿奇霉素氯霉素克拉霉素克林霉素紅霉素33第33頁(yè)，共101頁(yè)。影響K-B法抑菌區(qū)大小的技術(shù)因素接種

13、密度：菌落接近融合生長(zhǎng)為宜紙片放置時(shí)間孵育溫度孵育時(shí)間培養(yǎng)皿的大小、培養(yǎng)基深度、抗菌藥物紙片間距紙片中抗菌藥物的含量培養(yǎng)基組分：培養(yǎng)基中細(xì)菌生長(zhǎng)速度、藥物擴(kuò)散速度、藥物活性等因素均可影響抑菌區(qū)的大小。34第34頁(yè)，共101頁(yè)。方法學(xué)評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單、試劑量較低、不需特殊設(shè)備、易于由人判斷抗菌藥物可自由選擇缺點(diǎn)影響因素多，方法必須標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化不能定量特殊耐藥菌不能檢測(cè)（如VISA和低水平VRE）35第35頁(yè)，共101頁(yè)。質(zhì)量控制質(zhì)量控制的目的是保證檢驗(yàn)結(jié)果的精確性、可靠性和可重復(fù)性，規(guī)范試驗(yàn)中使用的各種試劑，規(guī)范操作者的操作規(guī)程和對(duì)結(jié)果的判斷。質(zhì)量控制的方法采用已知抗菌藥物敏感的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行測(cè)

14、試36第36頁(yè)，共101頁(yè)。質(zhì)量控制常用標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希氏菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC25923銅綠假單胞菌ATCC27853大腸埃希氏菌ATCC35218肺炎克雷伯菌ATCC700603糞腸球菌ATCC2921237第37頁(yè)，共101頁(yè)。質(zhì)控頻率日測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)每日進(jìn)行質(zhì)控菌株/特定抗菌藥物試驗(yàn)時(shí)，20個(gè)連續(xù)樣品中，測(cè)定值在預(yù)定值范圍外1次，即為95%可信。若1次則需查找誤差原因并予以糾正38第38頁(yè)，共101頁(yè)。質(zhì)量控制周測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)30天測(cè)試質(zhì)控菌株/特定抗菌藥物，測(cè)定值不在預(yù)定值范圍3次，可改為周測(cè)試，若3則需查找原因在進(jìn)行周測(cè)試時(shí)若出現(xiàn)一次不在預(yù)定值范圍，則需連續(xù)5天測(cè)試，若

15、均在預(yù)定值范圍內(nèi)，可恢復(fù)周測(cè)試，若有任何一次超出預(yù)定值，則需查找原因，重新開(kāi)始連續(xù)5天測(cè)試，日測(cè)試需進(jìn)行到問(wèn)題解決為止39第39頁(yè)，共101頁(yè)。耐藥性的概念細(xì)菌（真菌）對(duì)抗菌藥物的相對(duì)抗性固有耐藥（intrinsic resistance,天然耐藥）獲得性耐藥(acquired resistance)交叉耐藥(cross resistance)多重耐藥(multidrug resistance，MDR)40第40頁(yè)，共101頁(yè)。耐藥性監(jiān)測(cè)的意義拖延耐藥基因的出現(xiàn)制止已出現(xiàn)耐藥基因的播散耐藥基因和機(jī)制的推斷提高“醫(yī)院感染控制”的質(zhì)量耐藥監(jiān)測(cè)是經(jīng)驗(yàn)用藥的基礎(chǔ)41第41頁(yè)，共101頁(yè)。-內(nèi)酰胺酶的檢

16、測(cè)頭孢哨噻吩（Nitrocefin)法碘測(cè)定法42第42頁(yè)，共101頁(yè)。-內(nèi)酰胺酶陽(yáng)性的臨床意義預(yù)示嗜血桿菌、淋病奈瑟菌和卡他莫拉菌對(duì)青霉素、氨芐西林和阿莫西林耐藥預(yù)示葡萄球菌、腸球菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、替卡西林、羧芐西林、哌拉西林耐藥43第43頁(yè)，共101頁(yè)。革蘭陰性菌耐藥性的檢測(cè)超廣譜內(nèi)酰胺酶（ESBLs） 染色體介導(dǎo)高產(chǎn)頭孢菌素酶（AmpC酶）碳青霉烯酶 44第44頁(yè)，共101頁(yè)。ESBLs的分類根據(jù)基因同源性不同分為：TEM型 80SHV型 46CTX-M型 37OXA型 18其它型 20/studies/webt.htm.CTX-M-1組CTX-M-2組CTX-M-8組C

17、TX-M-9組45第45頁(yè)，共101頁(yè)。ESBLs 的 檢測(cè)單紙片篩選試驗(yàn)頭孢泊肟（10g/片）17mm頭孢他啶（30g/片）22mm氨曲南（30g/片）27mm頭孢噻肟（30g/片）27mm頭孢曲松（30g/片）25mm46第46頁(yè)，共101頁(yè)。ESBLs 的 檢測(cè)雙紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)：內(nèi)酰胺酶抑制劑確證試驗(yàn)：頭孢他啶/克拉維酸（30/10g/片） 頭孢他啶5mm頭孢噻肟/克拉維酸（30/10g/片） 頭孢噻肟5mm47第47頁(yè)，共101頁(yè)。抑制劑增強(qiáng)的紙片擴(kuò)散法頭孢噻肟 克拉維酸頭孢噻肟頭孢他啶頭孢他啶 克拉維酸48第48頁(yè)，共101頁(yè)。ESBLs Detection Methods:Inhib

18、ition by Clavulanic Acid Ronald J. Jones （Reprinted with Permission of Author）. ESBL Etest Prescribing Information AB BIODISK49第49頁(yè)，共101頁(yè)。ESBLs 的耐藥性 所有青霉素類頭孢菌素類（、代）氨曲南如已使用CLSI2010新折點(diǎn)，以上頭孢菌素和氨曲南的檢測(cè)結(jié)果無(wú)需修正50第50頁(yè)，共101頁(yè)。頭孢菌素酶哪些細(xì)菌產(chǎn)生AmpC酶?腸桿菌屬（陰溝、產(chǎn)氣）弗勞地枸櫞酸桿菌摩根摩根菌普魯菲登菌屬粘質(zhì)沙雷菌等51第51頁(yè)，共101頁(yè)。分子量大約為39000左右等電點(diǎn)大多9

19、.0能分解三代頭孢菌素及單環(huán)酰胺類抗生素不被-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制，但可被氯唑西林抑制頭孢菌素酶52第52頁(yè)，共101頁(yè)。低基礎(chǔ)水平持續(xù)表達(dá)低基礎(chǔ)水平和高誘導(dǎo)產(chǎn)生高基礎(chǔ)水平持續(xù)表達(dá)：AmpC調(diào)節(jié)基因突變表型分類53第53頁(yè)，共101頁(yè)。54第54頁(yè)，共101頁(yè)。AmpC酶的檢測(cè)（三維試驗(yàn)） 酶的提取 凍融法 超聲波破碎法 1個(gè)菌落 1個(gè)菌落 種入12ml大豆湯。35 0C震搖4-6h 種入40ml大豆湯。35 0C震搖過(guò)夜4 0C 40000rpm，離心20min，去上清液 4 0C 4000rpm，離心20分鐘，去上清液 沉淀物-89 0C反復(fù)凍溶5次 重懸在5mlpH7.0 的.01MPB

20、S中加入1.5mlpH7.0的0.01MPBS， 超聲波破碎10秒，間隔15秒，重復(fù) 旋轉(zhuǎn)混勻。 10次4 0C 12,000轉(zhuǎn)rpm離心20分鐘 4 0C 12,000rpm離心20分鐘取上清液，-20 0C保存?zhèn)溆?取上清液，-20 0C保存?zhèn)溆?5第55頁(yè)，共101頁(yè)。-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)CTX酶粗提液酶粗提液+克拉維酸酶粗提液+氯唑西林酶粗提液+克拉維酸+氯唑西林56第56頁(yè)，共101頁(yè)。產(chǎn)AmpC酶菌株的耐藥性對(duì)下列藥物耐藥頭霉素類（頭孢西丁、頭孢美唑）第三代頭孢菌素酶抑制劑復(fù)方制劑并可同時(shí)對(duì)氟喹酮類和氨基糖苷類耐藥對(duì)第四代頭孢菌素（頭孢吡肟）和碳青霉烯類敏感如為ESBLs+AmpC酶菌

21、株第四代頭孢菌素亦耐藥57第57頁(yè)，共101頁(yè)。指所有能明顯水解亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素的一類內(nèi)酰胺酶分別屬于Ambler分子分類中的A類、B類、D類酶 。 碳青霉烯酶 58第58頁(yè)，共101頁(yè)。天然來(lái)源碳青霉烯酶嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的L1酶獲得性碳青霉烯酶（Ambler分子分類）B類酶（金屬酶）：IMP、VIM類及SPM-1A類酶：NMC-A、KPC-1、GES-2等D類酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其來(lái)源可分為59第59頁(yè)，共101頁(yè)。IMP紙片EDTA2-巰基丙酸陽(yáng)性對(duì)照株結(jié)果臨床標(biāo)本結(jié)果IMP紙片EDTA2-巰基丙酸金屬酶篩選結(jié)果60第60頁(yè)，共1

22、01頁(yè)。 2001年在美國(guó)北卡羅來(lái)納州首次報(bào)道 屬于A類2f組絲氨酸碳青霉烯酶-內(nèi)酰胺酶 水解包括碳青霉烯類抗生素在內(nèi)的所有-內(nèi)酰胺類抗生素,但對(duì)頭孢他啶和頭孢西丁相對(duì)較弱,不被EDTA抑制，加Zn之后活性不增強(qiáng) 酶抑制劑如克拉維酸有部分抑制作用 編碼基因位于質(zhì)粒上 肺炎克雷伯菌產(chǎn)生的碳青霉烯酶KPC（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase)61第61頁(yè)，共101頁(yè)。肺炎克雷伯菌其他腸桿菌科細(xì)菌：大腸埃希菌、產(chǎn)酸克雷伯菌、沙門(mén)菌、腸桿菌屬、黏質(zhì)沙雷菌、弗勞地枸椽酸桿菌和奇異變形桿菌銅綠假單胞菌惡臭假單胞菌產(chǎn)KPC酶的菌株62第62頁(yè)，共101頁(yè)。產(chǎn)KPC酶菌株的

23、檢測(cè)何時(shí)需進(jìn)行KPC酶的檢測(cè)頭孢他啶 R頭孢噻肟 R頭孢曲松 R頭孢吡肟不定厄他培南 MIC2 g/ml 19-21mm亞胺培南 MIC2-4 g/ml 美羅培南 MIC2-4 g/ml 16-21mm注意：亞胺培南不用于篩選變形桿菌屬/普羅威登菌屬/摩根菌屬，也不用于K-B法篩查（檢測(cè)性能差）63第63頁(yè)，共101頁(yè)。The modified Hodge test Mueller-Hinton agar plate was inoculated with a 1:10 dilution of a 0.5McFarland suspension of E. coli ATCC 25922 an

24、d streaked for confluent growth using a swab. A10-ug imipenem disk was placed in the center, and each test isolate was streaked from the disk to the edge of the plate. Isolate A is a KPC producer and positive by the modified Hodge test. IsolatesB, C, Dand E do not produce a carbapenemase and are neg

25、ative by the test.K. F. Anderson, D. R. Lonsway, J. K. Rasheed，etal. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug. 2007, p. 27232725Modified Hodge test64第64頁(yè)，共101頁(yè)。單產(chǎn)KPC酶菌株表現(xiàn)只是對(duì)碳青霉烯類抗生素低度耐藥，合并膜孔蛋白缺失，高度耐藥?？膳c其它質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因同時(shí)存在，如qnr、OXA、ESBLs、AmpC、氨基糖苷甲基化酶基因等，可形成所有常規(guī)抗菌藥物耐藥。產(chǎn)KPC酶菌株的耐藥性65第65頁(yè)，共101頁(yè)。關(guān)于碳青霉烯酶陽(yáng)性但碳青霉烯類

26、“敏感” 的菌株對(duì)報(bào)告可作評(píng)論：“這株細(xì)菌證實(shí)產(chǎn)碳青霉烯酶。碳青霉烯類對(duì)處于敏感范圍(厄他培南2 g/ml、亞胺培南4 g/ml和/或美羅培南4g/ml)的腸桿菌科細(xì)菌引起感染的臨床功能還未明。但是在體外證實(shí)是碳青霉烯酶產(chǎn)生株”66第66頁(yè)，共101頁(yè)。產(chǎn)KPC酶菌株體外藥敏試驗(yàn)可對(duì)所有常用抗菌藥物耐藥，但對(duì)替加環(huán)素、多粘菌素B和多粘菌素E敏感率較高，在國(guó)外已用于治療因?yàn)槟蛞褐袧舛鹊停婕迎h(huán)素不推薦用于治療尿道感染產(chǎn)KPC酶菌株的治療67第67頁(yè)，共101頁(yè)。革蘭陽(yáng)性菌的耐藥性檢測(cè)MRSA與MRCoNSVREPRSPVISA、hVISA與VRSA68第68頁(yè)，共101頁(yè)。誘導(dǎo)性-內(nèi)酰胺酶69第

27、69頁(yè)，共101頁(yè)。誘導(dǎo)性-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)70第70頁(yè)，共101頁(yè)。如何報(bào)告葡萄球菌屬青霉素結(jié)果71第71頁(yè)，共101頁(yè)。MRSA的定義72第72頁(yè)，共101頁(yè)。MRSA的定義73第73頁(yè)，共101頁(yè)。 mecA-介導(dǎo)的金葡菌耐藥檢測(cè)方法比較 敏感性:苯唑 MIC = 苯唑 紙片 = 頭孢西丁紙片 = PBP2a = mecA* 99% 98% 98% 100%特異性:苯唑 MIC = 苯唑 紙片 =頭孢西丁紙片 = PBP2a = mecA 100% 99% 100% 100%courtesy of Swenson and Tenover*mecA = gold standard4774第7

28、4頁(yè)，共101頁(yè)。MRS的表型試驗(yàn) 紙片擴(kuò)散法 用頭孢西丁 ( 30 g) 紙片金葡菌 其結(jié)果和苯唑西林紙片法一致（mecA金葡）CoNS 優(yōu)于苯唑西林紙片法（已被取消）結(jié)果清晰，讀起來(lái)比苯唑西林容易。報(bào)告時(shí)仍報(bào)苯唑西林，而不是頭孢西丁MIC試驗(yàn) 仍用苯唑西林藥4375第75頁(yè)，共101頁(yè)。MRS的表型試驗(yàn)頭孢西丁折點(diǎn) 頭孢西丁抑菌圈 (mm) Res Susc 金葡菌和 21* 22* 路登葡萄球菌 CoNS 24* 25*報(bào)告苯唑西林耐藥*報(bào)告苯唑西林敏感 CLSI/NCCLS M100-S15 Table 2C (M2, M7)4476第76頁(yè)，共101頁(yè)。MRSA的檢測(cè)77第77頁(yè)，共

29、101頁(yè)。針對(duì)CoNS的試驗(yàn)規(guī)則改變78第78頁(yè)，共101頁(yè)。MRSA/MRSE的耐藥性青霉素類頭孢菌素類碳青霉烯類含酶抑制劑的復(fù)方制劑均應(yīng)報(bào)告耐藥，而不考慮其體外藥敏結(jié)果79第79頁(yè)，共101頁(yè)。葡萄球菌“大環(huán)內(nèi)脂類耐藥的葡萄球菌可以改變、誘導(dǎo)克林霉素耐藥 由erm基因?qū)е?23S rRNA 甲基化耐藥，與大環(huán)內(nèi)脂類, 林可霉素, 和 鏈陽(yáng)霉素 B型有交叉，又叫 MLSB 耐藥或只耐大環(huán)內(nèi)脂類 (msrA 基因編碼的泵出機(jī)制 ).”M100-S14 (M2, M7); Table 2CStaphylococcus80第80頁(yè)，共101頁(yè)。機(jī)制基因紅霉素克林霉素泵出msrARS改變核糖體(誘導(dǎo)

30、)ermRS*改變核糖體(結(jié)構(gòu))ermRR結(jié)構(gòu)型msrA= 大環(huán)內(nèi)脂類及鏈陽(yáng)霉素erm= 紅霉素核糖體甲基化 *需要誘導(dǎo)展現(xiàn)耐藥 葡萄球菌 紅霉素 / 克林霉素Staphylococcus81第81頁(yè)，共101頁(yè)?？烧T導(dǎo)的克林霉素耐藥 (erm-介導(dǎo))常規(guī)D試驗(yàn): 陽(yáng)性 15 g 紅霉素紙片及 2 g克林霉素之間距離為15-26.拌隨QC 株!“D Test” 陽(yáng)性反應(yīng) 82第82頁(yè)，共101頁(yè)?？烧T導(dǎo)的克林霉素耐藥 (erm-介導(dǎo))另一例子“D Test” 陽(yáng)性 反應(yīng)15 - 26 mmPhotos courtesy of J. Jorgensen and K. Fiebelkorn.83第

31、83頁(yè)，共101頁(yè)。“D Test” 陰性 反應(yīng)無(wú)誘導(dǎo)(泵出msrA-介導(dǎo)的紅霉素耐藥)84第84頁(yè)，共101頁(yè)。金葡菌clindamycin R erythromycin R oxacillin R penicillin R vancomycin /“此 金葡菌 假定耐藥，因?yàn)椴槌稣T導(dǎo)型的克林霉素耐藥 . 但有些病人對(duì)克林霉素仍有效.”“D Test” 陽(yáng)性及評(píng)論85第85頁(yè)，共101頁(yè)。葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的藥敏試驗(yàn)86第86頁(yè)，共101頁(yè)。葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的藥敏試驗(yàn)87第87頁(yè)，共101頁(yè)。葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的藥敏試驗(yàn)88第88頁(yè)，共101頁(yè)。hVISA的意義heterogenous v

32、ancomycin-intermediate resistance S. aureus (hVISA)which had been first reported by Hiramatsu et al in 1997.hVISA strains were reported from some Asiancountries. These various types of reduced susceptibility to vancomycin could lead to clinical failures of vancomycin treatment89第89頁(yè)，共101頁(yè)。hVISA的意義90

33、第90頁(yè)，共101頁(yè)。耐藥肺炎鏈球菌的檢測(cè)耐藥肺炎鏈球菌:PNSP（PISP+PRSP）PNSP（腦膜炎標(biāo)準(zhǔn)）對(duì)青霉素的MIC值2.0g/ml=R,（PRSP）MIC值在0.12g1.0g/ml之間的菌株為相對(duì)耐藥（低耐）菌株（PISP） MIC值0.06g/ml=S91第91頁(yè)，共101頁(yè)。CLSI對(duì)肺炎鏈球菌性的MIC折點(diǎn)注意：腦膜炎和非腦膜炎不同！92第92頁(yè)，共101頁(yè)。肺炎鏈球菌耐藥性的檢測(cè)20 mm 報(bào)告青霉素敏感青霉素的最低抑菌濃度=0.03mcg/ml19 mm 不能報(bào)告青霉素的結(jié)果，需進(jìn)行青霉素最小抑菌濃度的測(cè)試，因此時(shí)青毒素的結(jié)果可能為S、I或R。青霉素的最低抑菌濃度=1 mcg/ml；非腦膜炎型的感