第六章一般毒性1課件

1、第六章 一般毒性作用（General Toxicity of Xenobiotics ）汪春充參考書(shū)周宗燦，付立杰主編.現(xiàn)代毒理學(xué)簡(jiǎn)明教程.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2012卡薩瑞特 道爾著.毒理學(xué)基礎(chǔ)周宗燦主編.毒理學(xué)教程（第3版）.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2006All substances are poisons , there is none which is not a poison. The right dose differentiates a poison and remedy.No substance is a poison by itself. It is

2、 the dose that makes a substance a poison. Paracelsus(1473-1548) 歐洲醫(yī)生，醫(yī)藥化學(xué)運(yùn)動(dòng)的始祖所有物質(zhì)都是毒物，沒(méi)有不是毒物的物質(zhì)，唯有劑量使之區(qū)分為毒物還是藥物 物質(zhì)本身不是毒物，主要是劑量才使一個(gè)物質(zhì)變成毒物毒性評(píng)價(jià)或安全性評(píng)價(jià)的基本目的受試物毒作用的表現(xiàn)和性質(zhì)劑量反應(yīng)（效應(yīng)）研究確定毒作用的靶器官確定損傷的可逆性其它：敏感檢測(cè)指標(biāo)和生物學(xué)標(biāo)志、毒作用機(jī)制、毒物動(dòng)力學(xué)、中毒的解救措施毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)不是為了證明化學(xué)品的安全性，而是為了表征化學(xué)品可能產(chǎn)生的毒作用。第一節(jié) 概述（毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)）描述毒理學(xué)是以動(dòng)物中毒模型（model

3、）模擬/預(yù)測(cè)人中毒原型（prototype），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)是常規(guī)試驗(yàn)。gy外推 A.人是最敏感的物種B. 人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)過(guò)程包括化學(xué)物的代謝與體重（或體表面積）相關(guān)。以單位體表面積計(jì)算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相近，以體重計(jì)算則人通常比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物敏感，差別可達(dá)10倍。如果某一化學(xué)物對(duì)幾個(gè)物種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性是相同的，則人的反應(yīng)也可能是相似的毒理學(xué)研究方法體內(nèi)試驗(yàn)體外試驗(yàn)人體觀(guān)察流行病學(xué)研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)人群調(diào)查以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型，最終目的是通過(guò)外源化學(xué)物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的毒性反應(yīng)，向人(原型)外推，以期評(píng)估外源化學(xué)物對(duì)人的危害及危險(xiǎn)性。篩選和預(yù)測(cè)急性毒性和機(jī)制研究進(jìn)一步深化和證實(shí)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中所得到

4、的資料動(dòng)物實(shí)驗(yàn)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（in vivo）體外試驗(yàn)（in vitro）一般毒性試 驗(yàn)特殊毒性試 驗(yàn)微 生 物試 驗(yàn)哺乳動(dòng)物試 驗(yàn)急性毒性重復(fù)劑量毒性亞慢性毒性慢性毒性致突變致癌致畸致突變器官水平組織水平細(xì)胞水平亞細(xì)胞水平分子水平實(shí)驗(yàn)動(dòng)物單次、多次或長(zhǎng)期染毒所產(chǎn)生的綜合毒性效應(yīng)以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為中心，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)、實(shí)施、結(jié)果觀(guān)察和評(píng)價(jià)是毒理學(xué)研究 的基本功 毒理學(xué)研究方法的優(yōu)缺點(diǎn) 研究方法流行病學(xué)研究 受控的臨床研究 毒理學(xué)體內(nèi)試驗(yàn) 毒理學(xué)體外試驗(yàn) 優(yōu)點(diǎn) 真實(shí)的暴露條件在各化學(xué)物之間發(fā)生相互作用測(cè)定在人群的作用表示全部的人敏感性 規(guī)定的限定暴露條件在人群中測(cè)定反應(yīng)對(duì)某組人群(如哮喘)的研究是有力的

5、能測(cè)定效應(yīng)的強(qiáng)度 易于控制暴露條件能測(cè)定多種效應(yīng)能評(píng)價(jià)宿主特征的作用(如：性別、年齡、遺傳特征等和其他調(diào)控因素飲食等)能評(píng)價(jià)機(jī)制 影響因素少，易于控制可進(jìn)行某些深入的研究(如：機(jī)制，代謝)人力物力花費(fèi)較少 缺點(diǎn)耗資、耗時(shí)多(多為回顧性)，無(wú)健康保護(hù)難以確定暴露，有混雜暴露問(wèn)題可檢測(cè)的危險(xiǎn)性增加必需達(dá)到2倍以上測(cè)定指標(biāo)較粗(發(fā)病率，死亡率) 耗資多較低濃度和較短時(shí)間的暴露限于較少量的人群限于暫時(shí)、微小、可逆的效應(yīng)一般不適于研究最敏感的人群動(dòng)物暴露與人暴露相關(guān)的不確定性受控的飼養(yǎng)條件與人的實(shí)際情況不一致暴露的濃度和時(shí)間的模式顯著地不同于人群的暴露 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中可觀(guān)察到體征，而沒(méi)有“癥狀”不能全面反映

6、毒作用，不能作為毒性評(píng)價(jià)和危險(xiǎn)性評(píng)價(jià)的最后依據(jù)難以觀(guān)察慢性毒作用 Lumley(1990)/Igarashi(1994)根據(jù)有限的臨床資料報(bào)告對(duì)人的毒性約一半不能由臨床前（動(dòng)物）毒性研究預(yù)測(cè)。Heywood（1983）報(bào)告27個(gè)化學(xué)物（多為藥物）的靶器官毒性在大鼠和狗（或猴）之間的相符率僅20%。Olson等（1998）報(bào)告131種化學(xué)物對(duì)動(dòng)物的毒性與人的毒性的相符率，嚙齒類(lèi)6%，非嚙齒類(lèi)28%，合并達(dá)36%，所有物種相符率可達(dá)69%。按照目前的廣泛進(jìn)行毒理學(xué)安全性評(píng)價(jià)，可在一定程度上提高新藥和各種化學(xué)品的使用安全性，但仍不能完全排除對(duì)人健康危害的風(fēng)險(xiǎn)WHO在臨床前藥物安全性實(shí)驗(yàn)原則的文件中指

7、出：雖然事先對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行了最仔細(xì)徹底的研究，但給人使用時(shí)總是不可能避免地要冒一定的風(fēng)險(xiǎn) 基本假設(shè)為：人是最敏感的動(dòng)物物種；人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生物學(xué)過(guò)程包括化學(xué)物的代謝，與體重(或體表面積)相關(guān)。這兩個(gè)假設(shè)也是全部實(shí)驗(yàn)生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的前提。以單位體表面積計(jì)算在人產(chǎn)生毒作用的劑量和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物通常相近似。而以體重計(jì)算則人通常比實(shí)驗(yàn)動(dòng)物敏感，差別可能達(dá)10倍。 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對(duì)人潛在危害的必需的和可靠的方法。 描述毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本原則1.化學(xué)物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的作用可以外推于人 此原則是根據(jù)質(zhì)反應(yīng)的概念，隨劑量或暴露增加，群體中效應(yīng)發(fā)生率增加。 選用成年的健康(雄性和雌性未孕)實(shí)

8、驗(yàn)動(dòng)物是為了使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有代表性和可重復(fù)性。以成年健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物作為一般人群的代表性實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停鴮⒂啄旰屠夏陝?dòng)物、妊娠的雌性動(dòng)物、疾病狀態(tài)作為特殊情況另作研究。這樣可降低實(shí)驗(yàn)對(duì)象的多樣性，減少實(shí)驗(yàn)誤差。3. 成年的健康(雄性和雌性末孕)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 和人可能的暴露途徑是基本的選擇 外源化學(xué)物以不同途徑染毒，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物表現(xiàn)的毒性可有很大差異 。因此，毒理學(xué)試驗(yàn)中染毒途徑的選擇，應(yīng)盡可能模擬人接觸該受試物的方式。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的局限性（不確定性） WH0在臨床前藥物安全性實(shí)驗(yàn)原則文件中指出“雖然事先對(duì)生物活性物質(zhì)進(jìn)行了最仔細(xì)徹底的研究，但給人使用時(shí)總是不可避免地要冒一定的風(fēng)險(xiǎn)?！边@就是利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的局限性。1

9、、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果外推到人的不確定性。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人對(duì)外源化學(xué)物的反應(yīng)敏感性不同，有時(shí)甚至存在著質(zhì)的差別。 2、高劑量結(jié)果向低劑量外推的不定期性。4、小數(shù)量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物結(jié)果外推大數(shù)量人群的不確定性。毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物數(shù)量有限，那些發(fā)生率很低的毒性反應(yīng)，在少量動(dòng)物中難以發(fā)現(xiàn)。 5、一般人群結(jié)果外推易感人群的不確定性3、異質(zhì)性小的群體外推異質(zhì)性大的不定期性。6、不同暴露方式（途徑、期限、頻率）的結(jié)果的外推不確定性1統(tǒng)計(jì)原則隨機(jī)：代表性對(duì)照：鑒別處理因素與非處理因素的差異及處理因素效應(yīng)大小，消除和減少隨機(jī)化原則所不能控制的抽樣誤差及實(shí)驗(yàn)者操作熟練程度等造成的差異 空白/陰/陽(yáng)性對(duì)照，自身對(duì)照，歷史性對(duì)照重復(fù)

10、：樣本量、重復(fù)次數(shù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程應(yīng)遵循基本原則 2動(dòng)物選擇原則首先考慮代謝與毒性效應(yīng)上與人一致注重對(duì)受試物毒性敏感的動(dòng)物物種種屬、品系、個(gè)體差異自然壽命不太長(zhǎng)、易于飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作、經(jīng)濟(jì)易獲得動(dòng)物年齡、性別毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)基本原則沒(méi)有一種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物完全符合物種選擇的原則，目前常規(guī)選擇2個(gè)物種：嚙齒類(lèi)+非嚙齒類(lèi)急性毒性試驗(yàn)：大鼠、小鼠、狗亞慢性、慢性：大鼠、狗皮膚刺激試驗(yàn)和致敏試驗(yàn)：兔、豚鼠眼刺激試驗(yàn)：兔遺傳毒理學(xué)試驗(yàn)：小鼠致畸試驗(yàn)：大鼠、小鼠、兔致癌試驗(yàn)：大鼠、小鼠遲發(fā)性神經(jīng)毒性試驗(yàn)：母雞為什么常選大、小鼠呢？ 因?yàn)樗亩拘苑磻?yīng)與人較為一致，而且繁殖快、易飼養(yǎng)、價(jià)格便宜且易獲取。使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)推論于人

11、必須慎而慎之。因?yàn)閯?dòng)物的反應(yīng)敏感性一般不及人。曾有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)有138種化合物人對(duì)之反應(yīng)比大鼠更為敏感。人與大鼠對(duì)不同化合物的急性毒性敏感比值 化合物種類(lèi)化合物數(shù)目敏感比值*無(wú)機(jī)化合物404.20.66有機(jī)磷化合物161.90.46有機(jī)氯化合物201.80.30藥物6210.55.80*以大鼠為1，人：大鼠另外，由于不同種屬動(dòng)物其生理狀況不一，在做實(shí)驗(yàn)時(shí)要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要注意：嚙齒類(lèi)動(dòng)物：無(wú)嘔吐反應(yīng)貓、狗：嘔吐反射靈敏，可用于研究引發(fā)嘔吐的實(shí)驗(yàn)兔、豚鼠：多用于經(jīng)皮膚接觸的毒作用研究。猴：用于一些特殊的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中小動(dòng)物至少應(yīng)為清潔動(dòng)物及以上級(jí)別，國(guó)際上SPF動(dòng)物已成為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12、微生物等級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 等級(jí) 要 求級(jí)普通動(dòng)物(CV)應(yīng)沒(méi)有傳染給人的疾病級(jí)清潔動(dòng)物(CL)除級(jí)標(biāo)準(zhǔn)外，種系清楚，沒(méi)有該動(dòng)物特有的疾病級(jí)無(wú)特定病原體動(dòng)物(SPF)除級(jí)標(biāo)準(zhǔn)外，動(dòng)物為剖腹產(chǎn)或子宮切除產(chǎn)、按純系要求繁殖，在隔離器內(nèi)或?qū)恿魇覂?nèi)飼養(yǎng)，可有不致病細(xì)菌叢，沒(méi)有致病病原體級(jí)無(wú)菌動(dòng)物(GF)在全封閉無(wú)菌條件下飼養(yǎng)的純系動(dòng)物，動(dòng)物體外不帶有任何微生物和寄生蟲(chóng)(包括絕大部分病毒)3劑量分組原則實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須暴露于高劑量，這是發(fā)現(xiàn)對(duì)人潛在危害的必需和可靠的辦法。 除對(duì)照組外，一般設(shè)3個(gè)或3個(gè)以上劑量組，以觀(guān)察劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系，確定受試化學(xué)物引起的毒效應(yīng)及其毒性參數(shù)。 高劑量組：應(yīng)出現(xiàn)明確的有害作用，或高

13、劑量組已達(dá)到極限劑量或染毒的最大劑量低劑量組：應(yīng)不出現(xiàn)任何可觀(guān)察到的有害作用（即相當(dāng)于NOAEL），但應(yīng)當(dāng)高于人可能的接觸劑量，至少等于人可能的接觸劑量中劑量組：介于高低劑量組之間，應(yīng)出現(xiàn)較輕的毒性效應(yīng)（相當(dāng)于LOAEL）三組劑量一般按等比例計(jì)算，低劑量組一般為高劑量組的1/10-1/204試驗(yàn)期限一般由毒性實(shí)驗(yàn)的定義決定： 急性毒性：一次或1d內(nèi)多次觀(guān)察14d 亞慢性毒性：持續(xù)至實(shí)驗(yàn)動(dòng)物壽命的10%（大/小鼠90d，狗1年） 某些試驗(yàn)（如致畸和多代生殖試驗(yàn)）由受試實(shí)驗(yàn)動(dòng)物物種或品系決定。 5給受試物途徑盡可能利用人擬用途徑 吸收速率：靜脈注射吸入腹腔注射經(jīng)口經(jīng)皮質(zhì)量控制優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范（goo

14、d laboratory practice，GLP） ：嚴(yán)格控制可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的各種主客觀(guān)因素，降低試驗(yàn)誤差，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性 實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程、試劑/動(dòng)物選擇、儀器使用、實(shí)驗(yàn)環(huán)境 安全性評(píng)價(jià)的最終產(chǎn)品并沒(méi)有實(shí)體，而是數(shù)據(jù)。因此，難以通過(guò)檢查最終產(chǎn)品來(lái)保證其質(zhì)量，只有通過(guò)保證有關(guān)安全性試驗(yàn)的計(jì)劃、實(shí)施等所有的因素和過(guò)程的可靠性才能保證最終產(chǎn)品的可靠性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義生物學(xué)意義毒理學(xué)意義統(tǒng)計(jì)分析是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義是否具有生物學(xué)意義，即是否是真實(shí)的效應(yīng)是否具有毒理學(xué)意義，即是否是有害效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義無(wú)生物學(xué)意義有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義有生物學(xué)意義無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義無(wú)生物學(xué)意義無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義有生物學(xué)

15、意義 I IIIV III毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義生物學(xué)意義毒理學(xué)意義在判斷生物學(xué)意義時(shí)應(yīng)先考慮： 劑量依賴(lài)性趨勢(shì) 結(jié)果的重現(xiàn)性 相關(guān)指標(biāo)結(jié)果的一致性 差別的大小和類(lèi)型 兩種性別的一致性一般毒性外來(lái)化學(xué)物在一定劑量、一定接觸時(shí)間和接觸方式下對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生的綜合毒效應(yīng)，即基礎(chǔ)毒性特殊毒性：致癌、致畸、致突變 生殖發(fā)育毒性污染物理化特性了解毒性大小和特征了解在體內(nèi)蓄積和耐受了解對(duì)機(jī)體毒作用靶點(diǎn)和指標(biāo)確定閾和閾下劑量急性毒性試驗(yàn)亞急性毒性試驗(yàn)亞慢性毒性試驗(yàn)慢性毒性試驗(yàn)一般毒性試驗(yàn)外源化學(xué)物對(duì)全身各系統(tǒng)的毒性效應(yīng)全身各系統(tǒng)對(duì)外源化學(xué)物的毒性反應(yīng)目的要求掌握一般毒性作用的概念、試驗(yàn)?zāi)康氖煜ひ话愣拘栽?/p>

16、驗(yàn)方法要點(diǎn)熟悉蓄積毒作用概念了解蓄積毒作用研究方法第二節(jié) 急性毒性作用acute toxicity 機(jī)體一次或24h內(nèi)多次接觸外源化學(xué)物后在短期內(nèi)（最長(zhǎng)14天）所產(chǎn)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為和外觀(guān)改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)一、急性毒性的概念急性毒性（acute toxicity）急性毒性的概念需要注意急性接觸的次數(shù) 一次:經(jīng)口、注射； 呼吸道、皮膚(一段時(shí)間) 24h多次（不超過(guò)3次）中毒效應(yīng)出現(xiàn)的時(shí)間 不能僅以接觸毒物后毒性癥狀出現(xiàn)的時(shí)間，主要以接觸毒物的時(shí)間，觀(guān)察時(shí)間：714天強(qiáng)度 一次性大劑量，中毒癥狀明顯，常發(fā)生死亡二、急性毒性試驗(yàn)的目的求出致死劑量及其他急性毒性參數(shù)觀(guān)察中毒表現(xiàn)、

17、毒作用強(qiáng)度和死亡情況，初步評(píng)價(jià)毒物的毒效應(yīng)特征、靶器官、劑量-反應(yīng)（效應(yīng)）關(guān)系 等為其他毒理試驗(yàn)提供接觸劑量和選擇觀(guān)察指標(biāo)的依據(jù)為毒理學(xué)機(jī)制研究提供線(xiàn)索 急性毒性的參數(shù)半數(shù)致死劑量：LD50GB15193.3-2003食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)毒性分級(jí)大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)相當(dāng)人（70kg）的致死量mg/kg（g/人）6級(jí)，極毒5級(jí)，劇毒 4級(jí)，中等毒3級(jí)，低毒 2級(jí)，實(shí)際無(wú)毒1級(jí)，無(wú)毒15000稍嘗 （0.05）5004000 （0.5）400030000 （5）30000250000（50）25000050000（500）500000 （2500）急性毒性危害

18、類(lèi)別和急性毒性估計(jì)值（GHS） （WHO-全球化學(xué)品統(tǒng)一分類(lèi)和標(biāo)簽制度）接觸途徑第1類(lèi)第2類(lèi)第3類(lèi)第4類(lèi)第5類(lèi)經(jīng)口（mg/kg體重）5503002000經(jīng)皮（mg/kg體重）50200100020005000氣體（ppm，V）10050025005000蒸氣（mg/L）0.52.01020粉塵與煙霧（mg/L）0.050.51.05急性毒性的參數(shù)劑量-反應(yīng)曲線(xiàn)ED,TD：ED50, TD50, （1）霍恩法（Horn）（2）改進(jìn)寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計(jì)算方法LD50的幾種計(jì)算方法（1）霍恩法（Horn）： （劑量遞

19、增法/平均移動(dòng)法） 劑量對(duì)數(shù)與死亡率（反應(yīng)率）的轉(zhuǎn)換數(shù)（概率單位）呈直線(xiàn)關(guān)系。簡(jiǎn)單、精確度不夠！4個(gè)劑量組，每組動(dòng)物數(shù)相等（4-5只），劑量按等比級(jí)排列一般為2個(gè)參考染毒系列：劑量組距為2.15倍或3.16倍根據(jù)每組動(dòng)物數(shù)、組距、每組動(dòng)物死亡數(shù)，查表求出受試物L(fēng)D50、 95%CILD50的幾種計(jì)算方法（2）改進(jìn)寇氏法（Karber法/平均致死劑量法）利用劑量對(duì)數(shù)與死亡率呈S型曲線(xiàn)而設(shè)計(jì)的方法該法計(jì)算簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確率高，較為常用要求：每組動(dòng)物數(shù)相同、至少5個(gè)實(shí)驗(yàn)組、各劑量組組距呈等比級(jí)數(shù)、死亡率呈正態(tài)分布、最低劑量組死亡率80。lgLD50及其95可信限為1.35211.960.02131.352

20、10.0417LD50及95可信區(qū)間范圍為22.50mgkg(20.4424.76mgkg) （1）霍恩法（Horn）（2）改進(jìn)寇氏法（3）Bliss法 最大似然性法（maximum likelihood method），最精確的計(jì)算方法LD50的幾種計(jì)算方法三、急性毒性試驗(yàn)方法的要點(diǎn)經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)：死亡急性毒性替代試驗(yàn)固定劑量法急性毒性分級(jí)法上-下移動(dòng)法（階梯法）限量試驗(yàn)經(jīng)典急性致死（LD50）試驗(yàn)設(shè)計(jì)流程總體原則經(jīng)典急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染毒途徑染毒劑量觀(guān)察周期觀(guān)察指標(biāo)的選擇、計(jì)算方法和評(píng)價(jià) 急性毒性反應(yīng)與人近似 易于飼養(yǎng)、操作方便 繁殖力較強(qiáng)，數(shù)量較大 價(jià)格較低，易于獲得（一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的

21、選擇和要求主要原則除特殊需要外，首選哺乳動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種和品系 嚙齒類(lèi)（rodent species） 非嚙齒類(lèi)（nonrodent species） 小鼠：昆明種、NIH、ICR 大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar 犬或猴 為了有利于預(yù)測(cè)化合物對(duì)人的危害，要求選擇兩種以上的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，最好一種為嚙齒類(lèi)，一種為非嚙齒類(lèi)，分別求出其急性毒性參數(shù)。根據(jù)接觸途徑選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 急性經(jīng)口和吸入毒性試驗(yàn)大鼠、小鼠 急性經(jīng)皮毒性試驗(yàn)成年大鼠、豚鼠、家兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的物種和品系實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡和體重剛成年、健康、未曾交配和受孕的動(dòng)物小動(dòng)物根據(jù)體重同一次試驗(yàn)相同性別實(shí)驗(yàn)動(dòng)物起始體重變異范圍不應(yīng)超

22、過(guò)平均體重的20%實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存年限與體重選擇動(dòng)物種類(lèi)生活年限（年）生殖年齡（月）初成年體重（克）急性實(shí)驗(yàn)選擇體重（克）慢性實(shí)驗(yàn)選擇體重（克）小白鼠1.5221518251518大白鼠22.52315010015050100豚 鼠683250200250150200家 兔493415001500200012001500貓10123410001500250010001500狗1520341200080001500040006000實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的性別雌雄各半如雌、雄動(dòng)物毒效應(yīng)有明顯差異，應(yīng)分別并求出雌性和雄性動(dòng)物的LD50值特殊的試驗(yàn)研究可僅作單一性別的急性毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與數(shù)量根據(jù)組數(shù)和每組數(shù)量

23、來(lái)決定總數(shù)量LD50，一般為4-6組大、小鼠每組每性別至少5只，犬類(lèi)3只嚴(yán)格遵循隨機(jī)、均衡的原則隨機(jī)性： 每只動(dòng)物分散到各組去的機(jī)會(huì)均等，以避免成見(jiàn)或系統(tǒng)誤差均衡性： 各組動(dòng)物的平均體重及體重的離散度盡可能一致 每只動(dòng)物的體重不應(yīng)超過(guò)全體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均體重的20% 每組之間的平均體重相差不應(yīng)超過(guò)10%控制離散度控制均衡性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的預(yù)檢給藥前檢疫觀(guān)察大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2-3周適應(yīng)新環(huán)境，減少環(huán)境和生理?xiàng)l件變化可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響篩檢健康狀況不符合試驗(yàn)要求的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的給藥前禁食處理經(jīng)口途徑染毒，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物胃腸道內(nèi)食物存留量對(duì)化學(xué)毒物的毒性可產(chǎn)生較明顯的干擾 大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提

24、供飼料 經(jīng)口多次染毒可不禁食（二）受試物及處理理化特性水溶液、混懸液、油溶液水溶性受試物：蒸餾水、去離子水、生理鹽水，保持與體內(nèi)滲透壓一致（注射） 水不溶性受試物：溶于或懸浮于適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑中受試物一般應(yīng)臨用前新配受試物成分和配方應(yīng)穩(wěn)定不變適宜容積染毒毒性較大的受試物給藥量較小毒性較低的受試物常需較大量的染毒給藥容積根據(jù)染毒途徑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)口：20ml/kg(空腹動(dòng)物) 經(jīng)皮：2ml/kg 靜脈：1ml/kg(5min以上)受試物及處理(三) 染毒方法模擬實(shí)際接觸的途徑和方式受試物的性質(zhì)和用途受試物毒性評(píng)價(jià)程序的要求有利于不同化學(xué)物之間結(jié)果的比較工業(yè)毒物：經(jīng)呼吸道、皮膚農(nóng)用化學(xué)物：經(jīng)口、皮膚

25、、呼吸道藥品：經(jīng)口、注射、皮膚食品：經(jīng)口環(huán)境污染物：經(jīng)口、呼吸道、皮膚 染毒途徑染毒方法消化道、呼吸道、皮膚、注射 染毒途徑影響受試物急性毒性 染毒方法不同途徑的吸收量和吸收速率吸收速率：靜脈注射呼吸道肌肉注射腹腔注射皮下注射消化道皮內(nèi)注射經(jīng)皮同一受試物不同染毒途徑LD50的大小通常符合上述規(guī)律經(jīng)口（胃腸道）染毒LD50值來(lái)比較不同化學(xué)物急性毒性大小灌胃：溶液或混懸液，以注射器經(jīng)導(dǎo)管注入胃內(nèi)，等容量灌胃法吞咽膠囊：將受試物裝入膠囊中，放至舌后部，迫使動(dòng)物咽下。犬、猴喂飼：將受試物摻入動(dòng)物飼料或飲水中供實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自行攝入染毒方法空腹灌胃后23h復(fù)食灌胃的體積不超過(guò)體重的1%-2% 小鼠0.2-1.

26、0ml/只，0.1-0.5ml/10g 大鼠5ml/只，0.5-1.5ml/100g 家兔10ml/2kg， 狗3006.0301.0家兔20002400100.0大鼠1001993.025003500150.0200249453500200.02503006.0貓2500300050803008.03000100150狗1000015000200500灌胃法灌胃法是用灌胃器將所應(yīng)投給動(dòng)物的藥灌到動(dòng)物胃內(nèi)。小鼠的灌胃針長(zhǎng)約45cm，直徑為1mm，大鼠的灌胃針長(zhǎng)約68cm，直徑約1.2mm。灌胃針的尖端焊有一小圓金屬球，金屬球?yàn)橹锌盏?。焊金屬球的目的是防止針頭刺入氣管或損傷消化道。針頭金屬球端彎

27、曲成20左右的角度，以適應(yīng)口腔、食道的生理彎曲度走向染毒方法鼠類(lèi)的灌胃法：用左手固定鼠，右手持灌胃器，將灌胃針從鼠的口腔插入，壓迫鼠的頭部，使口腔與食道成一直線(xiàn),將灌胃針沿咽后壁慢慢插入食道，可感到輕微的阻力,此時(shí)可略改變一下灌胃針?lè)较?，以刺激引起吞咽?dòng)作，順勢(shì)將藥液注入。一般灌胃針插入小鼠深度為34cm，大鼠或豚鼠為46cm。靜式吸入染毒動(dòng)式吸入染毒經(jīng)呼吸道染毒 氣管內(nèi)注入染毒方法 吸入染毒靜式吸入染毒染毒方法方法：一定體積的密閉容器，加入易揮發(fā)的液態(tài)或氣態(tài)受試物染毒柜體積、動(dòng)物數(shù)、時(shí)間，依據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物最低需氣量計(jì)算優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、方便、受試物消耗少，適合于小鼠缺點(diǎn)：氧氣減少，濃度不穩(wěn)定，經(jīng)皮吸收

28、，不適合稍大動(dòng)物，揮發(fā)性不強(qiáng)的受試物用此法受限 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的最低需氣量及不同染毒柜容積放置動(dòng)物數(shù)（染毒2h）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸量最低需氧量定式染毒2h可放動(dòng)物數(shù)(L/h)(L/h)25L50L100L300L1000L小鼠1.454.503561012153640120150大鼠10.1830.54011 2561618豚鼠10.1830.54011 2561618貓19.3057.9000034910家兔42.25126.80000145猴51.60154.80000134狗312.6097.8000001動(dòng)式吸入染毒 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處于有空氣流動(dòng)的染毒柜中，新鮮空氣不斷流入，污染空氣不斷流出。溫度、濕

29、度、氧及二氧化碳分壓相對(duì)恒定，并有隨時(shí)補(bǔ)充受試物，維持濃度穩(wěn)定?？刹蓸颖O(jiān)測(cè)受試物濃度，可持續(xù)接觸受試物，無(wú)時(shí)間限制 染毒方法動(dòng)式吸入染毒裝置的組成染毒柜機(jī)械通風(fēng)系統(tǒng)配氣系統(tǒng)染毒方法動(dòng)式吸入染毒設(shè)備A 整體暴露 B 口鼻暴露動(dòng)式吸入染毒優(yōu)缺點(diǎn)染毒方法優(yōu)點(diǎn)：受試物濃度和氧分壓比較穩(wěn)定缺點(diǎn)：設(shè)備要求高，消耗受試物量很大，操作比較復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)工經(jīng)皮膚染毒染毒方法農(nóng)藥、化妝品、工業(yè)、環(huán)境、外用藥物常用大鼠染毒方式：脫毛：化學(xué)或機(jī)械法脫毛（體表面積的10%）染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法 經(jīng)注射途徑染毒染毒方法注射藥品、機(jī)制研究、毒物代謝動(dòng)力學(xué)分類(lèi)： 幾種動(dòng)物不同注射途徑注射量(ml)范圍注射途徑小鼠大

30、鼠豚鼠兔狗靜脈肌肉皮下腹腔0.20.50.10.20.10.50.21.01.02.00.20.50.51.01.03.01.05.00.20.50.51.02.05.03.0100.51.01.03.05.010.05.015.02.05.03.010.0（四） 劑量選擇參考新化學(xué)物的理化性質(zhì)參考相關(guān)資料先用少量動(dòng)物，以較大的劑量間隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死劑量范圍，然后設(shè)計(jì)正式實(shí)驗(yàn)的劑量和分組根據(jù)試驗(yàn)所選的LD50計(jì)算方法確定劑量組數(shù)預(yù)試一般每組4只動(dòng)物，每次3組，以10倍為組距。根據(jù)第一次預(yù)試結(jié)果判定需要增加還是降低劑量，組距保持不變，直至粗略預(yù)測(cè)到LD100及

31、LD0為止。 各組劑量的計(jì)算i =（lgLD90-lgLD10）/（n-1）或 i =（lgLD100- lgLD0）/（n-1） i為組距，n為設(shè)計(jì)的劑量組數(shù)。以最低劑量值（LD0或LD10）的對(duì)數(shù)劑量加上一個(gè)i值，即是第二個(gè)劑量組的對(duì)數(shù)劑量，依次類(lèi)推直至最高劑量組劑量選擇劑量選擇化學(xué)物L(fēng)D50大于2g/kg 或5g/kg，表明毒性不大我國(guó)藥品的毒理研究指導(dǎo)原則規(guī)定要以最大容積最高濃度給予動(dòng)物后未見(jiàn)死亡不必計(jì)算LD50全面觀(guān)察動(dòng)物的各種反應(yīng)和變化，仔細(xì)分析實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在染毒后出現(xiàn)的中毒表現(xiàn)、劑量效應(yīng)、時(shí)間分布。觀(guān)察記錄的內(nèi)容：中毒體征及發(fā)生過(guò)程 死亡情況和時(shí)間分布 體重 病理形態(tài)學(xué)變化（五） 毒

32、性作用觀(guān)察毒性作用觀(guān)察中毒體征及發(fā)生過(guò)程詳細(xì)觀(guān)察和記錄動(dòng)物出現(xiàn)的中毒體征 發(fā)生時(shí)間 體征發(fā)展的經(jīng)過(guò)各個(gè)系統(tǒng)的特征初步確定急性毒性靶器官不同表現(xiàn)提供毒性機(jī)制的信息 續(xù)表6-1 嚙齒類(lèi)動(dòng)物急性中毒表現(xiàn) 毒性作用觀(guān)察死亡情況和時(shí)間分布實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)對(duì)LD50值產(chǎn)生明顯影響分析中毒死亡時(shí)間的分布規(guī)律可以提供重要信息 ：原形，代謝體重毒性作用觀(guān)察反映動(dòng)物中毒后綜合性整體變化，比較客觀(guān)簡(jiǎn)便的量化指標(biāo)應(yīng)定期多次稱(chēng)量動(dòng)物的體重變化，一般為每周1次或2次對(duì)體重指標(biāo)的變化要仔細(xì)觀(guān)察和分析 體重變化的原因毒性作用觀(guān)察影響食欲或消化系統(tǒng)的功能影響食物的吸收和利用影響水的攝取腎功能急性損傷毒性作用觀(guān)察病理檢查死亡動(dòng)物

33、：大體病理變化，如臟器外觀(guān)、大小、色澤的變化，有無(wú)充血、出血、水腫或其他改變存活動(dòng)物：觀(guān)察期結(jié)束時(shí)亦應(yīng)進(jìn)行解剖檢查，必要時(shí)做組織病理學(xué)檢查（六） 觀(guān)察時(shí)間和周期染毒以后應(yīng)即刻開(kāi)始觀(guān)察動(dòng)物中毒表現(xiàn)和死亡情況給藥當(dāng)天應(yīng)連續(xù)或多次觀(guān)察，以后可根據(jù)情況，每天2次或多次觀(guān)察直至試驗(yàn)周期結(jié)束觀(guān)察周期一般為14天LD50(LC50)計(jì)算時(shí)以觀(guān)察周期內(nèi)各組動(dòng)物的總死亡數(shù)為依據(jù)不同化學(xué)物質(zhì)引起動(dòng)物死亡的時(shí)間存在個(gè)體差異速殺型化學(xué)毒物僅計(jì)算24h的死亡率 觀(guān)察時(shí)間和周期急性毒性替代試驗(yàn)-固定劑量法不以動(dòng)物死亡作為觀(guān)察終點(diǎn)利用預(yù)先選定或固定的一系列劑量染毒，通過(guò)觀(guān)察化學(xué)物的毒性效應(yīng)對(duì)該化學(xué)物進(jìn)行毒性分級(jí)劑量：5、5

34、0、300mg/kg，最高限量2000mg/kg分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（歐共體）： 高 毒： LD502000mg/kg平均用大鼠14.8只，經(jīng)典方法平均用大鼠24.2只。OECD組織驗(yàn)證：（11個(gè)國(guó)家的33個(gè)實(shí)驗(yàn)室比較固定法和經(jīng)典法的結(jié)果）毒性分級(jí)：比較了30種化合物，根據(jù)歐共體急性口服毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，一致性80.2%毒性反應(yīng)：毒性反應(yīng)類(lèi)型、出現(xiàn)和持續(xù)時(shí)間等方面未見(jiàn)明顯差別所用動(dòng)物數(shù)：經(jīng)典發(fā)平均用大鼠24.2只，固定劑量法平均用大鼠14.8法替代試驗(yàn)-急性毒性分級(jí)法以死亡為終點(diǎn)的分階段試驗(yàn)法，每階段3只動(dòng)物，平均經(jīng)2-4階段，根據(jù)死亡動(dòng)物數(shù)，判斷急性毒性。首選大鼠，從25、200、2000mg/kg體重3個(gè)

35、固定劑量中選擇一個(gè)劑量開(kāi)始試驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果判斷：不需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行分級(jí)；下一階段以相同劑量的另一種性別試驗(yàn)；下一階段以較高或較低的劑量水平進(jìn)行（從200mg/kg體重開(kāi)始）。動(dòng)物觀(guān)察14天，染毒當(dāng)天觀(guān)察體征和死亡至少兩次，之后每日觀(guān)察一次。每周測(cè)體重，所有動(dòng)物進(jìn)行大體解剖，必要時(shí)進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。上下移動(dòng)法（階梯法）以死亡為終點(diǎn)，也可用于觀(guān)察不同的終點(diǎn)。根據(jù)初步資料確定第一只動(dòng)物接受化學(xué)物的劑量，由第一只動(dòng)物染毒后的反應(yīng)決定第二只動(dòng)物的接受劑量，如死亡則下一個(gè)劑量降低，如存活則下一個(gè)劑量增高。該方法需要選擇一個(gè)比較合適的劑量范圍，使得大部分動(dòng)物的所接受的化學(xué)物劑量在真正的平均致死劑量左右。方

36、法改進(jìn)后，僅需要6-9只動(dòng)物。 急性毒性試驗(yàn)求出LD50(LC50)值，通過(guò)LD50值進(jìn)行急性毒性分級(jí)(acute toxicity classification)，評(píng)價(jià)毒物的急性毒性強(qiáng)弱，比較毒物的急性毒性大小四、急性毒性分級(jí)和評(píng)價(jià)急性毒性分級(jí)和評(píng)價(jià) 外源化學(xué)物急性毒性分級(jí)(WHO,2003）GB15193.3-2003食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序和方法的急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)毒性分級(jí)大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)相當(dāng)人（70kg）的致死量mg/kg（g/人）6級(jí)，極毒5級(jí)，劇毒 4級(jí)，中等毒3級(jí)，低毒 2級(jí)，實(shí)際無(wú)毒1級(jí)，無(wú)毒15000稍嘗 （0.05）5004000 （0.5）400030000

37、（5）30000250000（50）25000050000（500）500000 （2500）農(nóng)藥急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（GB1567農(nóng)藥登記毒理學(xué)試驗(yàn)方法）大鼠、兔、豚鼠大鼠大鼠急性毒性危害類(lèi)別和急性毒性估計(jì)值（GHS） （WHO-全球化學(xué)品統(tǒng)一分類(lèi)和標(biāo)簽制度）接觸途徑第1類(lèi)第2類(lèi)第3類(lèi)第4類(lèi)第5類(lèi)經(jīng)口（mg/kg體重）5503002000經(jīng)皮（mg/kg體重）50200100020005000氣體（ppm，V）10050025005000蒸氣（mg/L）0.52.01020粉塵與煙霧（mg/L）0.050.51.05LD50的局限性L(fǎng)D50的值不能等同于急性毒性，死亡僅僅是評(píng)價(jià)急性毒性的許多觀(guān)察

38、終點(diǎn)之一?；瘜W(xué)物單次大劑量急性中毒，動(dòng)物多死于神經(jīng)系統(tǒng)和心血管功能障礙，并不能很好地顯示毒作用的特征和靶器官LD50值不穩(wěn)定:OECD的80個(gè)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定5種化學(xué)物L(fēng)D50，差別可達(dá)2.44-8.38倍物種差異對(duì)LD50影響大：16種化學(xué)藥品對(duì)人的致死劑量小于小鼠的1/10，甚至差別更大。不能期望使用動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)結(jié)果來(lái)擬定人的臨床劑量急性毒性試驗(yàn)程序受試物資料的采集：化學(xué)結(jié)構(gòu)式、理化性質(zhì)、純度等，或查閱文獻(xiàn)，搜集與之相近的化學(xué)物毒性資料。 實(shí)驗(yàn)室的要求：GLP。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇原則，年齡和體重等。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組的隨機(jī)性與均衡性。受試物劑量的分組確定。選定染毒途徑，符合人類(lèi)實(shí)際接觸情況。中毒表現(xiàn)

39、的觀(guān)察，相關(guān)參數(shù)的計(jì)算。毒性分析。鑒定報(bào)告應(yīng)包括如下內(nèi)容1.受試樣品名稱(chēng)、理化性狀、配制方法、所用濃度；2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、品系和來(lái)源（注明合格證號(hào)和動(dòng)物級(jí)別）;3.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境，包括飼料來(lái)源、室溫、相對(duì)濕度、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室合格證號(hào)； 4.所用染毒途徑、染毒濃度和動(dòng)物分組，每組所用動(dòng)物性別、數(shù)量及體重范圍；5.計(jì)算LD50/LC50的方法；6.染毒后動(dòng)物中毒表現(xiàn)及出現(xiàn)時(shí)間和恢復(fù)情況、死亡時(shí)間、大體解剖所見(jiàn)；7.列表報(bào)告結(jié)果，計(jì)算的LD50/LC50及其95%可信區(qū)間；8.結(jié)論。 復(fù)習(xí)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的基本原則毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用對(duì)照組的意義實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇的原則和注意事項(xiàng)LD50的概念及毒理學(xué)意義第三節(jié)

40、 局部毒性試驗(yàn) (Local toxic effect) (Local irritant effect)機(jī)體暴露于化學(xué)物后，在其接觸和暴露部分造成的局部毒性損傷、刺激（如眼刺激、皮膚刺激）和（或）變態(tài)反應(yīng)等農(nóng)藥、化妝品、消毒劑的常規(guī)項(xiàng)目刺激性、腐蝕性、致敏性家兔眼刺激性：眼球表面接觸受試物后產(chǎn)生的可逆性 炎性變化眼腐蝕性：眼球表面接觸受試物后產(chǎn)生的不可逆 性組織損傷一、眼刺激試驗(yàn)Draize眼刺激試驗(yàn)（標(biāo)準(zhǔn)方法）9只家兔，每只兔的一只眼睛滴入0.1 ml受試物。其中3只在滴人后2秒鐘用20 ml微溫水沖洗；3只在4秒后沖洗；3只不作沖洗。于滴入后24 h、48 h和72 h、4d和7d，以肉眼或手提式裂隙燈檢查眼的反應(yīng)。記錄結(jié)膜（發(fā)紅、球結(jié)膜水腫和分泌物）、角膜（渾濁程度和范圍）和虹膜（充血、腫脹、對(duì)光反應(yīng)）的反應(yīng)程度和持續(xù)時(shí)間按規(guī)定分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算染毒后前4d最高總積分平均值