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1、雙特異性抗體 1第1頁,共80頁。2雙特異性抗體概述構(gòu)建策略應(yīng)用第2頁,共80頁。3概述雙特異性抗體:抗體兩個(gè)結(jié)合點(diǎn)表現(xiàn)為不同的特異性,即分別結(jié)合不同表位。如,一個(gè)結(jié)合靶細(xì)胞(如腫瘤細(xì)胞),另一結(jié)合藥物或免疫效應(yīng)細(xì)胞(如蓖麻毒素、抗癌藥物、細(xì)胞毒性細(xì)胞)第3頁,共80頁。4雙特異性抗體第4頁,共80頁。5第5頁,共80頁。6雙特異性抗體的功用:提高療效,減少副作用。主要用于靶向治療。第6頁,共80頁。7構(gòu)建策略雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo),另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞T細(xì)胞 TCR CD3 CD2第7頁,共80頁。8構(gòu)建策略雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo),另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞吞噬細(xì)胞
2、/APC FcR、CR第8頁,共80頁。9構(gòu)建策略雙特異性抗體的靶標(biāo) 一個(gè)結(jié)合治療靶標(biāo),另一個(gè)指向體內(nèi)效應(yīng)細(xì)胞NK細(xì)胞 FcR、CD56第9頁,共80頁。10雙特異性抗體的效應(yīng)靶效應(yīng)細(xì)胞靶分子 效應(yīng)T細(xì)胞TCR/CD3,CD2殺傷腫瘤細(xì)胞NK細(xì)胞FcRIII,CD44,CD56,CD38殺傷腫瘤細(xì)胞病毒感染細(xì)胞中性粒細(xì)胞FcRI,CR3, Fc RI殺傷腫瘤細(xì)胞病毒感染細(xì)胞單核巨噬細(xì)胞FcRI,CR3, FcRI殺傷腫瘤細(xì)胞病毒感染細(xì)胞樹突狀細(xì)胞FcR抗原遞呈紅細(xì)胞CR1免疫粘附第10頁,共80頁。11構(gòu)建策略雙特異性抗體的構(gòu)建方法雜化雜交瘤技術(shù) 將具有某種特異性(如抗瘤細(xì)胞)的McAb細(xì)胞株
3、與具有抗第二抗原(如蓖麻毒蛋白)的小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合,即產(chǎn)生出雜化雜交瘤細(xì)胞株的二價(jià)瘤體。第11頁,共80頁。12 雜化雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的雙特異性抗體第12頁,共80頁。13雜化雜交瘤分泌的抗體形式 保持原特異性抗體分子: L1H1-H1L1,L2H2-H2L2 重鏈特異性相同的配對(duì)抗體分子: L1H1-H1L2,L1H2-H2L1 L2H1-H1L2,L1H2-H2L2 重鏈、輕鏈特異性不同的配對(duì)抗體分子: L1H1-H2L2,L1H2-H1L2 L1H1-H2L1,L2H2-H1L2 第13頁,共80頁。14只有L1H1-H2L2才是所需的雙特異性抗體第14頁,共80頁。15雜化雜交瘤方法的
4、不足 產(chǎn)量低,僅占10% 產(chǎn)物需篩選,費(fèi)時(shí)費(fèi)力 瘤株不穩(wěn)定第15頁,共80頁。16構(gòu)建策略雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 Nisonoff和Rivers最早開始研究 化學(xué)交聯(lián)無需經(jīng)過細(xì)胞融合,比較簡(jiǎn)便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經(jīng)還原和再氧化,將兩種不同特異性抗體的半分子結(jié)合在一起?;蛴秒p功能交聯(lián)劑,如鄰苯酸酯等,把兩個(gè)抗體半分子交聯(lián)在一起。第16頁,共80頁。17化學(xué)交聯(lián)的雙特異性抗體第17頁,共80頁。18構(gòu)建策略雙特異性抗體的構(gòu)建方法化學(xué)交聯(lián)法 用于制備雙功能抗體的McAb可以是完整分子,也可是經(jīng)胃酶水解獲得F(ab)2片段。后者在減少鼠源免疫原性方面,效果較好。第18頁,共
5、80頁。19構(gòu)建策略雙特異性抗體的構(gòu)建方法基因工程技術(shù) 利用分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)產(chǎn)生雙功能抗體 常見有四種構(gòu)建形式,多為小分子抗體。第19頁,共80頁。20末端半胱氨酸殘基(Cys)共價(jià)交聯(lián) 在兩種scFv分子C末端分別帶上自由的Cys,通過常規(guī)二硫鍵共價(jià)交聯(lián),形成雙特異性抗體 VLAVHALCysVLBVHBLCys-S-S-第20頁,共80頁。21單鏈雙特異性抗體 將兩種scFv分子基因用linker連接在一起,然后表達(dá)形成雙特異性抗體 VLAVHALVLBVHBLL第21頁,共80頁。22微型雙特異性抗體 利用專門二聚化結(jié)構(gòu)將兩種scFv分子連接在一起,形成雙特異性抗體 如利用fos和ju
6、n基因的亮氨酸拉鏈序列: VLAVHALfosVLBVHBLjun第22頁,共80頁。23雙體型雙特異性抗體 將兩種不同抗體的VH和VL用較短的linker連接形成兩種不同單鏈,當(dāng)它們共表達(dá)時(shí),其相互間連接在一起,形成雙特異性抗體 1993,Holliger 第23頁,共80頁。24雙特異性抗體的應(yīng)用免疫診斷腫瘤放射顯影腫瘤藥物殺傷腫瘤的免疫殺傷乳腺癌、淋巴母細(xì)胞白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤第24頁,共80頁。25抗體免疫偶聯(lián)物第25頁,共80頁。26抗體免疫偶聯(lián)物概述小分子藥物與抗體偶聯(lián)物毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物應(yīng)用第26頁,共80頁。27概述抗體免疫偶聯(lián)物將單抗與“彈頭”藥物偶聯(lián)在一起,以提
7、高藥物作用的特異性,主要用于腫瘤治療。如,Mylotarg抗CD33單抗偶聯(lián)加里奇霉素,治療老年人急性髓細(xì)胞性白血病,2000年上市。第27頁,共80頁。28與單抗偶聯(lián)的常用“彈頭”藥物類別名稱植物毒素蓖麻毒素,相思豆毒素,皂角苷微生物毒素綠膿桿菌外毒素,白喉毒素抗代謝藥物氨基蝶呤,甲氨蝶呤,阿糖胞苷,5-氟尿嘧啶,5-氟脫氧尿苷蒽環(huán)類藥物阿霉素 柔紅霉素 嗎啉阿霉素烷基化藥物順鉑 苯丙氨酸氮芥 絲裂霉素C抗有絲分裂藥物長(zhǎng)春花堿 秋水仙堿 鬼臼毒素抗生素博萊霉素 加里奇霉素 平陽霉素第28頁,共80頁。29小分子藥物與抗體偶聯(lián)物 一個(gè)單抗可偶聯(lián)一個(gè)至數(shù)十個(gè)小分子藥物。 抗體分子中的多個(gè)基團(tuán)可以
8、用于連接,如巰基,氨基,羥基,胍基,羧基,糖基等。第29頁,共80頁。30小分子藥物與抗體偶聯(lián)物直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。2-亞胺四氫噻吩(2-IT)可在具氨基的化合物上引入巰基第30頁,共80頁。31小分子藥物與抗體偶聯(lián)物直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶二硫基)-丙酸酯)可將巰基引入抗體 如,阿霉素與抗子宮內(nèi)膜腺癌單抗偶聯(lián),效果提高57倍第31頁,共80頁。32小分子藥物與抗體偶聯(lián)物直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同
9、的交聯(lián)劑。PDPH(3-(2-吡啶二硫基)-丙酰肼)可將巰基引入抗體第32頁,共80頁。33小分子藥物與抗體偶聯(lián)物直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑。戊二醛可將藥物與單抗的伯氨基僑聯(lián) 如,柔紅霉素與單抗偶聯(lián)第33頁,共80頁。34小分子藥物與抗體偶聯(lián)物直接偶聯(lián)物 將藥物與單抗直接連接在一起 不同的小分子藥物往往需選擇不同的交聯(lián)劑?;顫婖タ蓪⒑然幬锱c抗體的氨基相偶聯(lián)第34頁,共80頁。35小分子藥物與抗體偶聯(lián)物間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連,然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Lys可將含羧基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。第35頁,共80頁。36
10、小分子藥物與抗體偶聯(lián)物間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連,然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Poly-Glu可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。第36頁,共80頁。37小分子藥物與抗體偶聯(lián)物間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連,然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。Dextran可將含氨基的小分子藥物偶聯(lián)到載體。 如,將平陽霉素與抗乳腺癌/肝癌單抗偶聯(lián)第37頁,共80頁。38小分子藥物與抗體偶聯(lián)物間接偶聯(lián)物 將藥物先與大分子載體相連,然后大分子載體再偶聯(lián)到單抗。脂質(zhì)體脂質(zhì)體與藥物融合,再與抗體連接成免疫脂質(zhì)體 如,阿霉素第38頁,共80頁。39小分子藥物與抗體偶聯(lián)物偶聯(lián)要點(diǎn)與存在問題小分子藥物與單抗偶聯(lián)應(yīng)有一
11、定空間距離需提高偶聯(lián)產(chǎn)率偶聯(lián)基團(tuán)應(yīng)避開藥物活性基團(tuán)保留單抗靶向性多個(gè)藥物分子偶聯(lián)簡(jiǎn)單,易重復(fù)不形成抗體、藥物或偶聯(lián)物聚合物第39頁,共80頁。40毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。雙功能異氰酸酯親脂性偶聯(lián)劑 如,將白喉毒素與抗瘤單抗偶聯(lián)第40頁,共80頁。41毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。脂肪二醛通過其醛基與藥物/單抗的氨基偶聯(lián)第41頁,共80頁。42毒素及大分子多
12、肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。二馬來酰亞胺衍生物巰基偶聯(lián)劑 第42頁,共80頁。43毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。同型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)相同反應(yīng)功能基團(tuán)。特點(diǎn)與不足步驟簡(jiǎn)單,流程短。副反應(yīng)產(chǎn)物多,均一性差,產(chǎn)率低。第43頁,共80頁。44毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。SPDP先與抗體(藥物)氨基反應(yīng)
13、形成化合物,再與藥物(抗體)巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。 如,相思豆毒素、蓖麻毒素、力達(dá)霉素與抗瘤單抗偶聯(lián)第44頁,共80頁。45毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。苯丁酸氮芥衍生物先與抗體氨基反應(yīng)形成化合物,再與藥物氨基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。第45頁,共80頁。46毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。馬來酰亞胺活潑酯先與藥物氨基反應(yīng)形成化合物,再與抗體巰基反應(yīng)形成偶聯(lián)物。第46頁,共8
14、0頁。47毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。異型雙功能偶聯(lián)劑 具有兩個(gè)不同反應(yīng)功能基團(tuán)。特點(diǎn)反應(yīng)溫和,易控制,產(chǎn)物均一性好,產(chǎn)率高。第47頁,共80頁。48毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物 毒素和多肽類抗腫瘤藥物分子量較大,具有較強(qiáng)的腫瘤殺傷活性,但選擇性差。免疫偶聯(lián)物的純化 由于反應(yīng)產(chǎn)物是混合物,故需進(jìn)行分離純化 常用方法有:凝膠過濾、親和層析、離子交換層析、高效液相色譜。第48頁,共80頁。49毒素及大分子多肽藥物與抗體偶聯(lián)物研究趨勢(shì)連接可控性,高產(chǎn)率,高產(chǎn)物均一性。選擇性連接抗體和藥物某一特定基團(tuán)偶聯(lián)物在體內(nèi)穩(wěn)定循環(huán),
15、并能在腫瘤部位激活或釋放第49頁,共80頁。50抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用單抗-藥物的臨床試驗(yàn)研究亦有20多年歷史存在諸多問題第50頁,共80頁。51單抗-藥物的臨床腫瘤治療試驗(yàn)?zāi)[瘤抗體藥物有效率毒性結(jié)腸抗結(jié)腸N-乙酰美法侖3/9血清病抗結(jié)腸新制癌霉素3/8白血病增多肺抗GA733-2甲氨蝶呤1/11發(fā)燒/厭食/腹瀉/腹痛肺與結(jié)腸抗GA733-2長(zhǎng)春花堿0/13胃腸毒性/腹痛卵巢與結(jié)腸抗CEA長(zhǎng)春堿酰胺0/4無成神經(jīng)細(xì)胞抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤柔紅霉素3/7骨髓抑制其它聯(lián)合阿霉素5/23發(fā)燒/皮疹/寒戰(zhàn)/骨髓抑制聯(lián)合絲裂霉素0/19血小板減少/腹瀉/胃腸毒性第51頁,共80頁。52抗體偶聯(lián)藥物的研究與應(yīng)用
16、單抗-毒素的臨床試驗(yàn)研究廣泛,具一定效果,但與期望尚有距離。第52頁,共80頁。53單抗-毒素的臨床腫瘤治療試驗(yàn)?zāi)[瘤抗體藥物有效率毒性結(jié)腸抗結(jié)腸蓖麻毒素A鏈0/17血管滲漏/腎和神經(jīng)毒性小細(xì)胞肺癌抗NCAM蓖麻毒素1/19血管滲漏黑色素瘤抗gp240蓖麻毒素A鏈4/20血管滲漏卵巢OVB3綠膿桿菌毒素A0/23CNS毒性腦抗轉(zhuǎn)鐵蛋白白喉毒素8/15無多種實(shí)體瘤抗Ley蓖麻毒素A鏈2/32血管滲漏B細(xì)胞淋巴瘤抗CD22蓖麻毒素A鏈6/26發(fā)燒霍奇金淋巴瘤抗CD25蓖麻毒素A鏈1/12血管滲漏CLL抗CD5蓖麻毒素A鏈4/14血管滲漏皮膚TCL抗CD5蓖麻毒素A鏈0/8血管滲漏第53頁,共80頁。
17、54抗體融合蛋白第54頁,共80頁。55抗體融合蛋白概述重組免疫毒素基因工程抗體-酶基因工程抗體-細(xì)胞因子抗體-超抗原免疫粘連素第55頁,共80頁。56概述抗體融合蛋白將抗體(片段)與其它效應(yīng)蛋白基因融合,構(gòu)建融合表達(dá)載體,然后在合適的表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)融合蛋白。融合蛋白具均一性,易生產(chǎn)第56頁,共80頁。57重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素白喉毒素及其衍生物 白喉?xiàng)U菌所產(chǎn)生,修飾延長(zhǎng)因子,阻斷蛋白合成 毒性極強(qiáng),1-2個(gè)分子即可殺死1個(gè)細(xì)胞。 腫瘤細(xì)胞敏感 體內(nèi)水解為A/B兩片段,A為毒性部分,B為結(jié)合部分第57頁,共80頁。58重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋
18、白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素假單胞桿菌外毒素及其衍生物 不可逆修飾延長(zhǎng)因子,阻斷蛋白合成 毒性很強(qiáng) 單鏈,分結(jié)合部與毒性部位第58頁,共80頁。59重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建常用毒素蓖麻毒素及其衍生物 滅活核糖體,抑制蛋白合成 體內(nèi)水解為A/B兩鏈,A為毒性部分,B為結(jié)合部分 第59頁,共80頁。60重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)重組免疫毒素的構(gòu)建構(gòu)建重組免疫毒素 常用抗體片段的C端與毒素融合 第60頁,共80頁。61重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤靶向IL-2受體的免疫毒素 多數(shù)T/B細(xì)胞型白血病與淋巴
19、瘤都過度表達(dá)IL-2受體亞基CD25 如,抗CD25單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物 (臨床) 第61頁,共80頁。62重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤靶向CD22的免疫毒素 約70%B細(xì)胞型淋巴瘤和白血病為CD22陽性 如,抗CD22單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物 (臨床前) 第62頁,共80頁。63重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究血液惡性腫瘤其他靶向血液抗原的免疫毒素 CD19,CD6,CD30,CD33,CD46第63頁,共80頁。64重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究實(shí)體瘤抗Lewis Y重組疫毒素 Lewis
20、 Y存在于結(jié)腸癌,乳腺癌,胃癌,肺癌,膀胱癌表面。 如,抗Lewis Y單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物,對(duì)結(jié)腸癌和乳腺癌有確切療效。 第64頁,共80頁。65重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)臨床試驗(yàn)與研究實(shí)體瘤抗Her2/neu重組疫毒素 Her2/neu 在乳腺癌,肝癌,卵巢癌,胃癌,有高表達(dá)。 抗Her2單抗-假單胞桿菌外毒素衍生物(臨床) 第65頁,共80頁。66重組免疫毒素 將單抗分子與毒素蛋白融合表達(dá)存在問題特異性非特異性毒性血管滲漏內(nèi)皮細(xì)胞損傷免疫原性實(shí)體瘤滲透第66頁,共80頁。67基因工程抗體-酶 把單抗分子與酶融合表達(dá),使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位??贵w介導(dǎo)的酶-前
21、藥療法 酶集中于靶標(biāo)部位,催化無或低活性的抗癌前藥轉(zhuǎn)化為胞毒性藥物,從而發(fā)揮藥物特異性釋放、活化,提高療效??笴EA抗體-葡萄苷酸酶前藥doxorubicin葡萄苷酸衍生物療效顯著提高第67頁,共80頁。68基因工程抗體-酶 把單抗分子與酶融合表達(dá),使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位??贵w介導(dǎo)的酶-前藥療法抗p97抗體-內(nèi)酰胺酶P97黑瘤抗原前藥7-(4-羧基丁酰胺)-頭孢菌素氮芥療效較化學(xué)偶聯(lián)物顯著提高第68頁,共80頁。69基因工程抗體-酶 把單抗分子與酶融合表達(dá),使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位?;诤怂崦傅娜诤系鞍?核酸酶與單抗融合,靶向腫瘤細(xì)胞核糖核酸酶免疫毒素多種核糖核酸酶具抗瘤活性如,牛胰/牛精核糖核酸酶第69頁,共80頁。70基因工程抗體-酶 把單抗分子與酶融合表達(dá),使特定的催化效應(yīng)靶向特定的部位。靶向溶栓劑 血纖溶酶原激活劑與單抗融合,靶向凝血塊 如,尿激酶血纖溶
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