Alport綜合征：從基礎(chǔ)到臨床課件

1、Alport綜合征：從基礎(chǔ)到臨床Alport綜合征遺傳性腎臟疾病臨床表現(xiàn): 血尿、感音神經(jīng)性耳聾、聽(tīng)力減退、眼部異常進(jìn)行性腎功能衰竭預(yù)后差大多數(shù)為 X連鎖顯性遺傳（XLAS），由編碼IV型膠原5 鏈的COL4A5基因突變所致主要問(wèn)題 診斷 花費(fèi)少 更有效 創(chuàng)傷小分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制Alport綜合征Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床診斷通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷機(jī)制 COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5 鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘

2、氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺檢測(cè)進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量 IV膠原5鏈甘氨酸替代的影響臨床診斷腎穿電鏡-“金標(biāo)準(zhǔn)” GBM:增厚、變薄以及致密層的分裂年齡太小的患兒不能耐受既使在電鏡下GBM也有不典型變化: 薄基底膜病的變化(年齡偏小的兒童和女性) 缺陷皮穿 方便 創(chuàng)傷小 31mm皮膚穿刺和5(IV)鏈染色診斷方法免疫熒光抗-5 (IV)鏈單克隆抗體正常:陽(yáng)性XLAS男性：陰性XLAS女性:間斷陽(yáng)性丁潔，等：中華兒科雜志，35: 177, 1997 Ding Jie, et al: Chin Med J, 11

3、0: 584, 1997Alport綜合征的臨床診斷皮膚穿刺 抗IV膠原5鏈的單克隆抗體免疫熒光染色 皮膚基底膜 (EBM) 陰性: 男性XLAS 間斷陽(yáng)性: 女性XLAS 連續(xù)陽(yáng)性: 正常人 個(gè)別XLAS 常染色體隱性患者（ARAS）EBM熒光染色 正常人XLAS男性XLAS女性ARAS1（IV）5（IV）腎穿組織熒光染色 正常人XLAS男性 ARAS1（IV）3（IV） 4（IV） 5（IV）皮膚穿刺 -IV型膠原5鏈免疫熒光染色診斷: 89家系, 199患者診斷率:96% Chin J Pediatr 1997; Pediatr Nephrol 2002Alport綜合征的臨床診斷 證實(shí)

4、COL4A5 基因突變:917GA 鏡下血尿 偶有蛋白尿 Chin J Practic Pediatr 2003大多數(shù):van der環(huán), 36% (5/14) Kidney Int 1999 2(4%): EBM 5 (IV) 正常皮膚穿刺 -IV型膠原5鏈免疫熒光染色 年齡最小的1例: 1歲 第1例: 常染色體隱性 Chin J Pediatr 1999 血尿2年 無(wú)家族史 父母非近親婚配 199例AS中2例為ARASAlport綜合征臨床診斷Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的

5、影響Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響基因診斷明確的遺傳性疾病遺傳方式: X連銷顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和常染色體顯性遺傳基因診斷 遺傳咨詢 產(chǎn)前診斷 了解發(fā)病機(jī)制基因診斷基因組DNA分析: PCR-SSCP: 檢測(cè)率 5079% Hum Mutat 1999; Am J Kidney Dis 2001PCR-直接測(cè)序: 檢測(cè)率85% J Am Soc Nephrol 1998 COL4A5 基因大小: 250kb 基因結(jié)構(gòu): 51外顯子 無(wú) “熱點(diǎn)突變”花費(fèi)高 (51外顯子

6、)已報(bào)道的檢測(cè)率不高(不超過(guò)85%)2/3免疫熒光1/3皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)RNA提取新技術(shù)- 5(IV)鏈mRNA分析RT-PCR 5個(gè)相互重疊的片段皮膚穿刺方便創(chuàng)傷小31mm RT-PCR 電泳: 大的缺失/插入直接測(cè)序: 小的/點(diǎn)突變 通過(guò)基因組DNA證實(shí)新技術(shù): 5(IV)鏈mRNA分析檢測(cè)率: 90.3%3/28 (10.7%) 小的插入或缺失 12/28 (42.8%) 錯(cuò)義突變2/28 (7.1%) 無(wú)義突變4/28 (14.4%) 單體型7/28 (25.0%) 剪切突變 基因診斷 4/28 (14.3%) 典型的剪切位點(diǎn) 3/28 (10.7%) 不典型或隱藏的剪切位點(diǎn)Kidn

7、ey Inter, 67(4):1268-1274, 2005 不典型或隱藏的剪切位點(diǎn):10% g.668-12GA- skipping E9 g.1036+5GT- skipping E14 g.1625+56_1625+57insC- partially skipping E21基因診斷被忽視或被認(rèn)為是基因組DNA內(nèi)含子的多態(tài)性基因診斷通過(guò)5(IV)鏈mRNA分析檢測(cè)COL4A5基因突變 簡(jiǎn)單、創(chuàng)傷小 (1個(gè)皮膚樣本) hair-root (鑒定24個(gè)突變) Hum Genet 2002 更經(jīng)濟(jì) (費(fèi)用僅為基因組DNA分析的1/61/7) 基因診斷通過(guò)5(IV)鏈mRNA分析檢測(cè)COL4A

8、5基因突變:可信、一致每一個(gè)突變均在DNA水平進(jìn)一步得到證實(shí) Kidney Inter, 67(4):1268-1274, 2005 成纖維細(xì)胞沒(méi)有可變剪切體其他組織 腎臟: 有41A和41B外顯子 Kidney Int 1993 白細(xì)胞: 無(wú)41A和41B外顯子 Pediatr Nephrol 2001 90.3% (28/31) XLAS患者突變檢測(cè) 19 新突變Chin J Pediatr 1999; Pediatr Nephrol 2002; Chin J Nephrol 2003 基因診斷 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 3

9、5 37 39 41 43 45 47 49 51 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 COL4A5 基因53Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響突變mRNA的表達(dá)量XLAS女性患者臨床表現(xiàn)不一 大多數(shù)女性: 鏡下血尿 無(wú)或輕

10、微蛋白尿 腎功能正常8-15% 腎功能衰竭（CRF） NDT 1990; Am J Kidney Dis 200140歲出現(xiàn)終末期腎衰（ESRD）: 大約12%60歲出現(xiàn)終末期腎衰: 大約30-40% J Am Soc Nephrol 2000日本報(bào)道: EBM中5(IV)表達(dá)陰性率和疾病的程度相關(guān) J Am Soc Nephrol 1998突變mRNA的表達(dá)量XLAS 女性患者臨床表現(xiàn)不一 家族之間腎臟疾病的嚴(yán)重程度明顯不同推測(cè)X染色體隨機(jī)或非隨機(jī)失活所致?突變mRNA的表達(dá)量X連鎖女性臨床資料 PatentGross hematuriaMicroscopic hematuriaDegree

11、 of proteinuria Renal insufficiencyEBM 5 (IV) stainingLL Yes + + No MosaicLY No + + No MosaicSL No + -+ No MosaicWS Yes + - No MosaicZF No + + Yes MosaicZY No + + No Mosaic 方法成纖維細(xì)胞培養(yǎng)RNA提取RT-PCRPAGE光密度比值分析突變mRNA的表達(dá)量Normal band Mutant band突變mRNA的表達(dá)量PatientTimes of PCRRange of OD of normal fragmentRang

12、e of OD of abnormal fragmentRatio of mutant mRNA/total mRNALL8637010556, even no normal fragment38907544500.85LY8no normal fragment4715309401SL861742410211505290, even no abnormal fragment0.19WS4150002945811925208000.42ZF44601175956118352130.67ZY420952453565520227700.25光密度比值分析 突變mRNA的表達(dá)量蛋白尿和mRNA表達(dá)量的

13、關(guān)系突變mRNA的表達(dá)量結(jié)論:突變COL4A5 基因的mRNA表達(dá)量和 XLAS 女性患者的表型相關(guān) XLAS女性患者突變COL4A5 基因的mRNA表達(dá)量多者表型更嚴(yán)重Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響Alport綜合征:從基礎(chǔ)到臨床通過(guò)皮膚穿刺進(jìn)行臨床診斷通過(guò)mRNA分析進(jìn)行基因診斷COL4A5基因突變后mRNA的表達(dá)量IV型膠原5鏈甘氨酸替代的影響甘氨酸替代 發(fā)病機(jī)制假說(shuō): 突變的COL45A基因編碼異常的5(IV) 鏈: 易降解 不能和其他的(IV)鏈形成復(fù)雜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)

14、Medicine 1999 進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): 突變5(IV)連幾乎不能和其他(IV)鏈形成三螺旋結(jié)構(gòu) 或者:形成的三螺旋結(jié)構(gòu)中含有突變的5(IV)鏈: 很少一部分 Kidney Int 2003甘氨酸替代35NC11430 aa 5(IV)鏈中2530%的甘氨酸 大約3040%突變涉及甘氨酸殘基的替代 J Am Soc Nephrol 2000NH2229 aa（interrupted Gly-X-Y repeats） COOHNC1甘氨酸替代同一位點(diǎn)的甘氨酸被不同氨基酸替代 不同位點(diǎn)的甘氨酸被同一氨基酸替代 青少年型 AS 成人型 AS甘氨酸替代兩例甘氨酸替代患者Glycine - SerineGlycine - Valine 方法質(zhì)粒構(gòu)建 pET-28a蛋白表達(dá) E.Coli蛋白鑒定 immunoblot + mass spectrometry 圓二色普檢測(cè) 甘氨酸替代 甘氨酸替代Blue: normal圓二色普檢測(cè)green- G1030S (Adult-type) black- G1015V (Juvenile-type)甘氨酸替代 重組蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成（%） 研究對(duì)象 -螺旋