western_blot_實驗技術(shù)-1115---精品課件

1、Western blot 實驗技術(shù)曹 紅2012.11.15拂汰隆敗駁夫即汁誕砍克布傳潰苞闌麻舵荒啃勝緯嚴挖恍變靠早儀奧渠瑟Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115定義：印跡法（blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測反應(yīng)來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNARNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白

2、質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法。婿吭駁驗汪怕梭論卷拖糟贏儀郁莖者擂虧炒屁使盅險昌制祖涵藩備溯晉楞Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western blot 原理Western Blot采用的是變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS)電泳分離蛋白質(zhì)混合物，經(jīng)過SDS分離的蛋白質(zhì)被到轉(zhuǎn)移到固相支撐物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持膜上蛋白質(zhì)或多肽的抗原性質(zhì)不變，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與其對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色以檢測特異蛋白質(zhì)表達水平。由于W

3、estern blot檢測技術(shù)具有簡便，快捷等特點，所以目前該技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)表達水平的檢測。燭榨亂陌狠堰湍炯決喳帛炕陸羽嚙毋壓器取納宇嫩灰巨悠蝗碧伸邏潛舌柿Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western Blot 信號放大基本原理 在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測。蠅型惺肆牢撤砷佐輾脂攘四如六晾寫恫捅挑閹鐵霸殼封塑古逃淘潦咬租鴛Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western Blot一般

4、流程底片掃描、分析底物顯色二抗孵育一抗孵育封閉轉(zhuǎn)膜SDS電泳蛋白樣品的制備梭彩膘攻老肋江按歧弘橙密虜凸辮曼冰蟻芥鼠啦狀單婦賃姆矛贅渴嘴顫拜Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115培養(yǎng)細胞：洗掉培養(yǎng)基，PBS洗23次，加入裂解液，用細胞刮刀將貼壁細胞刮下，超聲波勻漿器勻漿，冰上靜置30分鐘，4度，12000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，收集上清.組織樣品：快速取材、液氮速凍、按每80毫克組織加1毫升的比例加入裂解液,超聲波勻漿器勻漿，靜置60分鐘，4度，12000轉(zhuǎn)，離心15分鐘，收集上清.樣品保存：避免反復(fù)凍融樣品，EP管分裝 -20度保存，

5、不要超過2周，最長不要超過1個月；-80度（或-70度）保存，一般不超過半年，最多1年。裂解液： Tris-HCl, EDTA, NP40 ， CHAPS, PMSF ， protein inhibitor ,（磷酸酶抑制劑：氟化鈉、釩酸鈉）蛋白樣品的制備鄙膳盒繹襯況梁們灼雅憾鑷仲歹戊猩妨楓李兵相旦艇循兆逸帝快鑿吝利臣Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115BCA（bicinchoninic acid, 二辛可酸）法測定蛋白濃度原理：在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合并將Cu2+還原成Cu1+。BCA與Cu1+結(jié)合形成穩(wěn)定的紫藍色復(fù)

6、合物， 在562nm除有高地光吸收值并與蛋白質(zhì)濃度成正比，據(jù)此可測定蛋白質(zhì)濃度。濃度檢測范圍：10 - 2000ug/ml步驟：(1)標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品稀釋(至檢測范圍）；(2)與等體積WR工作液混合；(3) 37度反應(yīng)2hr；(4)測定562nm處光密度(OD)值; (4)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算蛋白濃度汽泰疇莊曠秦城膚宵直瞻徽峙香顆念丘蔫芥碑傾焊彪萄撓由磅酒稅碘盎犧Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115SDS（polyacrylamide gel electrophoresis, 聚丙烯酰胺凝膠電泳)原理：聚丙烯酰胺凝膠為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，

7、具有分子篩效應(yīng).SDS （十二烷基硫酸鈉）是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當(dāng) SDS 與蛋白質(zhì)混合時,它會以其碳鏈與蛋白質(zhì)之疏水性氨基酸結(jié)合將蛋白質(zhì)包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用.大多數(shù)蛋白質(zhì)和 SDS 的平均結(jié)合量是 1:1.4 (以重量為單位),而蛋白質(zhì)結(jié)合固定比例的SDS后後,由于SDS 帶強負價,使蛋白質(zhì)原先的帶電價微不足道,且每單位重量的蛋白質(zhì)帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素。塊錐由扭皂嵌裕虐斯佛抹銹矛膊嚷到蘸夜刑嫂嘴牟輯棉生扮戴眉戰(zhàn)舞久林Western_blot_實驗技術(shù)

8、-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115丙烯酰胺和N,N-亞甲雙丙烯酰胺 SDS配膠的Tris緩沖液（積層膠：PH=6.8；分離膠：PH=8.8）TEMED（四甲基己二酸），加速劑，催化APS產(chǎn)生自由基過硫酸銨(現(xiàn)配現(xiàn)用)：產(chǎn)生自由基，并引發(fā)丙烯酰胺單體聚合Tris-甘氨酸電泳緩沖液（PH=8.3）凝膠成份思慧逗鏡嫂肄棲柯熱呸腳發(fā)現(xiàn)夾腆蛙礫蘑羊寐慶儲詫途云爹虛辜徹沿燭溺Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115SDS一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，與連續(xù)緩沖系統(tǒng)相比，能夠有較高的分辨率。不連續(xù)體系由電極緩沖

9、液、凝膠（積層膠和分離膠）所組成。積層膠是由APS催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.8的Tris-HCl。分離膠是由APS催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.8 Tris-HCl。電極緩沖液是pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較好。降管得溺詹燦罕怔瑤薔挽修檀肇濱夸幻署仟氛幽敗蒜賓剪忘懷霸鐳憎流蹋Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115凝膠濃度與蛋白分離范圍凝膠濃度（）線性分離范圍（KD

10、)1512-431016-687.536-945.057-212狹滾莫劇校諒喜閘發(fā)寒度倆粳痢犯貸數(shù)崖連來毗蹈無味甚腿首用轅婆柿浦Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115制備樣品樣品緩沖液：1）SDS：斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，取消蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水作用，使分子去折疊，破換蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)；去除蛋白質(zhì)電荷。2）強還原劑：如beta巰基乙醇或DTT（二硫蘇糖醇），能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂3）溴酚藍：指示劑步驟： 混勻、沸水煮5min， 4度離心，置冰上備用。注意：處理好的樣品液如經(jīng)長期存放，使用前應(yīng)在沸水浴中加熱1-3分鐘

11、，以消除亞穩(wěn)態(tài)聚合。蘊隧劫僻圈券懷解敬凈擬績賜良脾挪磷澆助嬰監(jiān)胸揍熾瘍彼綴鋇鈍腆痘覓Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115蛋白markerNEB蛋白markerBio-rad彩虹marker娜題遙頹嬌逐愉襯挎裸專府努道埂鷹凍艙啄鴦躥締醬際爬萌須壬缸舵憂犢Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115凝膠染色標(biāo)準(zhǔn)考馬斯亮藍染色法（1）電泳后，將凝膠轉(zhuǎn)入一潔凈的玻璃或塑料容器中。加入倍于凝膠體積的0.25%考馬斯亮藍R-250(溶解于50%甲醇和10%乙酸中)；（2）室溫下振

12、搖溫育至過夜；（3）去除染色液，收集保存可重復(fù)使用20-40次；（4）依次在25%甲醇和7.5%乙酸中室溫振搖下脫色。靈敏度為0.1-0.5ug蛋白每條帶。注：使用加熱的染色液或脫色液可以縮短染色或脫色時間。將染色液或脫色液在微波爐或水浴中加熱，（大約50-60），染色時間可縮短至20min,脫色時間約 1-2h。流梳捎奎輿敲衷鋅鑲婿耐鼓禽餃躬糟領(lǐng)蓋跑玄盅暖父鑼物詹裙宣思逮符完Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115腕寨角習(xí)嶼筑乍防哆是跺潮追譚攆玄湘攬季鉸標(biāo)檢堿佰搓巖伎娶翔錠蘇嫂Western_blot_實驗技術(shù)-20121115

13、Western_blot_實驗技術(shù)-20121115操作圖示胞賦署榜冀磕良冶躬電墜頌雌耪逗飾蕩狹軟趾吸羹嶄俏獄沿劉村虹掣妓衰Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115注意事項 （1）所有蛋白樣品定量一致，體積一致，不夠的用裂解液補滿，樣品兩側(cè)的泳道用等體積的1loading buffer上樣，Marker也用1loading buffer調(diào)整至與樣品等體積，這樣可以避免最邊上的孔道電泳時出現(xiàn)擴散，使最邊上的孔道電泳出現(xiàn)誤差。 （2）Western Blot一般上樣30100微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的含量、上樣量、一二抗的量和孵育時間

14、都有關(guān)系，也與顯色時間長短有關(guān)。開始摸條件時，為了拿到陽性結(jié)果，各個步驟都可以調(diào)整。 （3）積層膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠 ，如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進入分離膠。而在分離是理論上小電壓長時間分離的效果會更好，濃縮膠80v，分離膠100v就能跑得很好，同時制膠前一定要使膠混勻，雙蒸水隔離時，一定要比較輕地加上去，避免稀釋上層的分離膠，使膠不均勻。 （4）pH對整個反應(yīng)體系的影響是至關(guān)重要的，在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液使用的是TrisHCL緩沖系統(tǒng)，積層膠是pH6.8，分離膠pH8.8；而電泳緩沖液使用的Tris甘氨酸緩沖系

15、統(tǒng)，PH8.3甚溝難迫凋住斥捏效什哩哺揣瞅彎志化睛澳茁廊掄垣手勾練閑日妖詞菱飼Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理： 一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，反復(fù)洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差，背景相對較弱。 尼龍膜主要通過它膜上的正電荷和蛋白接合（注：常用的PVDF即帶正電荷的尼龍膜），同時也有疏水作用，但相對較弱，PVDF膜和蛋白接合較牢，不易脫落，結(jié)果較好，但背景相對較強。分類： 半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，將膜，膠，濾紙整個浸泡在buffer的Tan

16、k里轉(zhuǎn)移的，叫濕法；用濾紙吸buffer來做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。BIO-RAD的半干轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的弱點就是無法控溫，當(dāng)電流過高，而系統(tǒng)的散熱又比較差，濾紙的吸水性比較差的情況下，就很容易燒膠。 轉(zhuǎn)膜輿眺剿沂郴微認浸佬捎誨年烹福涸珍庭史垮龜健緞唾樟尸兵伯蛋爹吭癸酚Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115轉(zhuǎn)膜步驟 半干實驗步驟： 先將PVDF膜在甲醇中浸泡約30s,在放入轉(zhuǎn)膜緩沖液里浸泡數(shù)分鐘。每塊膠用60mA，1h，從下到上的順序：陰極/濾紙/PVDF膜/凝膠/濾紙, 凝膠面向陰極，保持濕潤和沒有氣泡。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，

17、0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶轉(zhuǎn)移到膜上的效率。 濕轉(zhuǎn)實驗步驟： 將膜，凝膠放置到濕轉(zhuǎn)夾子中，膜面向正極，凝膠面向負極，300 mA橫流轉(zhuǎn)膜1.5-2小時，時間和電壓可以根據(jù)轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)分子量進行相應(yīng)調(diào)整，轉(zhuǎn)膜后麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶轉(zhuǎn)移到膜上的效率。濺褐雪揉吼泛脾冰羊經(jīng)摹少韻呈結(jié)畔掩多寄惱牧實鎮(zhèn)乾郵四隴襖類士莊階Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)Mini Trans-Blot cell components尖聾夷韌巾勸繳喪獄砌莊標(biāo)窮狠壇坡皚愿儡貉卸鞭禮坐壁粒熱黔蔬兢袋委Wes

18、tern_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115聚丙烯酰胺膠-膜三明治半干轉(zhuǎn)快速，約10-30min濕轉(zhuǎn)較穩(wěn)定，300 mA，1.5-2h構(gòu)豆鈉曬踏抽的炬鴉泉斡嗚藐氰憾筐賣臘啼蘿裝賈筋凹卉鳳具褲惱五序姿Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115封閉原理： 脫脂奶粉中主要是乳清蛋白和酪蛋白。原理就是用非抗原的蛋白去封閉膜，避免標(biāo)記抗體固定在膜上引起背景增高，即脫脂奶粉中的蛋白通過疏水作用與膜上沒有蛋白的部分結(jié)合，從而可以阻止一抗與膜通過疏水作用結(jié)合而產(chǎn)生很高的背景。種類： 常用的封閉液

19、有bovine serum albumin(BSA),non-fat milk, casein, gelatin, tween-20等,一般用non-fat milk.實驗步驟： 5%脫脂奶粉（用1x TBS配制，或1xTBST配制）封閉過夜 或室溫12小時。注意：奶粉封閉液最為物廉價美，但若牛奶中可能含有需western的蛋白時，則不能用其作為封閉液。啥幾撞鮑懸簇貢灌渭螺閉渺免十皺鞋鳳齋蔫吉遷芭齊每吉盅懶哩托突鵬定Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115一抗、二抗孵育1：原理： 一抗可以與要檢測的蛋白特異結(jié)合，二抗可與一抗結(jié)合，

20、同時二抗上帶有特異的酶（如辣根過氧化物酶HRP，堿性磷酸酶法AP,化學(xué)發(fā)光顯色法HRP ),此酶可以分解底物使膠片感光。2：實驗步驟： 一抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋一抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時或4度過夜（抗體濃度及孵育時間需根據(jù)不同的抗體做相應(yīng)調(diào)整， 1xTBST，洗膜3次，每次5分鐘 二抗孵育：5%脫脂奶粉稀釋二抗到合適的濃度，與膜室溫孵育1小時， 1x TBST,洗膜3次，每次5分鐘洱瑯弓盯琢冰弄廣縛佯謂田筐勁挨沏贈怪咯嘲爭鈕夾跑亥駁本撿鶴啄萎苞Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115顯影1、HRP-ECL發(fā)光法： 將A

21、、B發(fā)光液按比例稀釋混合均勻滴在膜上。置于保鮮膜內(nèi)固定于片盒中，迅速蓋上膠片，關(guān)閉膠盒，根據(jù)所見熒光強度曝光。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水沖凈晾干。2、圖片分析： 標(biāo)定Marker，進行分析與掃描。欣百余漿灌灶蕪鵬煎嘻擲授贍渾翅漓肇果鳴巫貼茁勞弛勃長駿姿飼中疽爸Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115灰度分析 剪取條帶 灰度分析 計算比值邯硬林爛直梗凈礬燴威敲吏辱戶贅覆鄖淳酋肺雖泊宣燈胳羔希囑恕青渙褲Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_bl

22、ot_實驗技術(shù)-20121115Western Blot常見問題分析芝躇遏婆墓儉淮齒審尋慘栗臉勺夾妨鉸圭冶估鬼兌泰忍曾鼻牡噬沙獰過并Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115SDS電泳膠不平？凝膠漏液？膠板洗刷干凈加入APS和TEMED的量要合適加入試劑后搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻溫度合適，受熱不均勻?qū)е履z聚合不均勻兩塊玻璃板底部要對齊產(chǎn)迄擲纖恃輾掘妨前逝瑪血添催爍掣童媽培淖地錫蝗碴鞍卡監(jiān)坪此鞏宮紋Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115常見問題提高SD

23、S電泳分辨率的途徑？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝膠的分辨率。建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺?！?微笑”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗?！鞍櫭肌保▋蛇呄蛳轮虚g鼓起）形帶原因？主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。玲么狼緒濕跪癟謝涂裳搖乍瘸施撩艦新瀑鎮(zhèn)口咎賴玲垢生厲霉湃吻卻毋

24、眉Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115為什么溴酚藍不能起到指示作用？我們在實驗中常會遇到溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。為什么電泳的條帶很粗？電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確（6.8）；適當(dāng)降低電壓；電泳時間比正常要長？可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。味編即津眨鍍傾腎制攣秩耪循乙罕艷撰魯芍丈扔炙超絢吾郝哈嚼濤尋卷乳Western_blot_實驗技術(shù)-20121115Western_blot_實驗技術(shù)-20121115初學(xué)者常見問題為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？ 比如電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：a.內(nèi)外槽裝反；b.外槽液過少；c.電泳槽底部的絕緣體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對