對綠色熒光蛋白的了解及應(yīng)用

1、對綠色熒光蛋白的了解及應(yīng)用學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院姓名：馬宗英年級：2011學(xué)號： 2011012923刖言綠色熒光蛋白(green fluorescent protein)，簡稱GFP，是一種具有奇妙特性的“光學(xué)蛋白 質(zhì)”。這種蛋白質(zhì)從成分和結(jié)構(gòu)上來說，沒有絲毫的特殊性，它的組成單元是20種常見的氨 基酸，二級結(jié)構(gòu)也是普通的a螺旋和。片層。但是，這種蛋白質(zhì)卻具有一個(gè)非常特別的性質(zhì) 發(fā)出綠色熒光?！娟P(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白生命科學(xué)應(yīng)用一、綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白最早是由下村修等人于1962年在一種學(xué)名Aequorea victoria的水母中發(fā) 現(xiàn)的。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長范圍的光線激發(fā)下，吸

2、收藍(lán)光的部分能量，發(fā)出 綠色熒光。野生型水母GFP的一級序列已由其cDNA序列推導(dǎo)出來1，它至少存在4種同源GFP， 但這些突變并不影響GFP的基本功能，只是使突變的GFP具有了新的性質(zhì)。生色團(tuán)是GFP發(fā)出熒光的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是GFP結(jié)構(gòu)中的一個(gè)重要組成部分。GFP的生 色團(tuán)位于氨基酸序列6469位的六肽內(nèi),6567位的絲氨酸、脫氫酪氨酸、甘氨酸通過共價(jià) 鍵形成的對羥基苯甲基咪唑環(huán)酮是一個(gè)獨(dú)特的、相當(dāng)穩(wěn)定的環(huán)狀三肽結(jié)構(gòu)構(gòu)成了 GFP生色 團(tuán)的核心，見圖1。圖2為生色團(tuán)的形成機(jī)制。圖1多管水母中GFP生色團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和附近序列位的甘氨酸圖2生色團(tuán)的形成機(jī)制目前人們對GFP的熒光發(fā)光機(jī)制并不十分清楚

3、，大家只是認(rèn)為，GFP是生物發(fā)光過程 中的能量受體，并且是最終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。二、GFP在生命科學(xué)中的應(yīng)用1、作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(protein tagging)利用綠色熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，可將GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽(protein tagging)，即利 用DNA重組技術(shù)，將目的基因與GFP基因構(gòu)成融合基因，轉(zhuǎn)染到合適的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)， 然后借助熒光顯微鏡便可對標(biāo)記的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的活體觀察。由于GFP只有238個(gè)氨 基酸，相對較小，所以將其與其它蛋白質(zhì)融合后并不影響自身的發(fā)光功能。利用GFP來檢 測目標(biāo)蛋白的定位已為我們提供了一種對細(xì)

4、胞內(nèi)的一些基本的生理過程進(jìn)行更為詳盡的觀 察的新方法。如細(xì)胞分裂、染色體復(fù)制和分裂、發(fā)育和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程的研究均是借助綠色 熒光蛋白進(jìn)行標(biāo)記。GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽除用于特定蛋白質(zhì)的標(biāo)記定位外，還大量用于各種細(xì)胞成分的標(biāo) 記如細(xì)胞骨架、質(zhì)膜、細(xì)胞核等等。曾經(jīng)有人將GFP融合到大腸桿菌細(xì)胞膜表面用作標(biāo)記 蛋白，這將有助于提高多肽庫的篩選效率、疫苗的研制、構(gòu)建細(xì)胞生物傳感器用作環(huán)境監(jiān)測 以及探測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程等等，以上都可以為傳統(tǒng)生物學(xué)研究提供新思路和新方法。2、藥物篩選利用細(xì)胞表面標(biāo)記,通過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀，可以分離與純化特 殊類型的細(xì)胞;同時(shí)還可利用不同顏色GFP衍生物標(biāo)記相

5、關(guān)蛋白質(zhì)，來觀察在單細(xì)胞內(nèi)相互 作用的靶細(xì)胞，再借助于熒光激活細(xì)胞分離器、等聚焦顯微鏡分離出目的細(xì)胞,從而可方便地 用于大規(guī)模篩選新的藥物。另一方面，利用GFP來進(jìn)行藥物篩選由于必須與遷移的信號分子相偶聯(lián)的限制，其篩 選容量相對較低，但是由于GFP在細(xì)胞內(nèi)的穿透性強(qiáng)及獨(dú)特的發(fā)光機(jī)制，因而在藥物篩選 中具有相當(dāng)大的應(yīng)用潛力。3、用于免疫學(xué)可采用基因工程的方法生產(chǎn)GFP標(biāo)記抗體，以取代傳統(tǒng)的免疫學(xué)標(biāo)記方法，建立一種 簡便、快速的免疫診斷新技術(shù)。相比于一般的標(biāo)記物，GFP對光穩(wěn)定、對抗體的標(biāo)記率可 達(dá)100%，而且因?yàn)镚FP是直接與抗體結(jié)合，所以無需添加任何底物，可以避免非抗原抗體 結(jié)合的背景干擾等

6、。線粒體中表達(dá)的GFP是研究比較成功的一種小分子抗體，因?yàn)樗梢栽谒拗骷?xì)胞內(nèi)大 量表達(dá)，易于基因工程操作，尤其易于構(gòu)架抗體融合蛋白。因融合抗體具有與抗原結(jié)合及發(fā) 射熒光兩種特性，故這一人工分子可用做免疫染色的檢測試劑，直接應(yīng)用于流式細(xì)胞儀和免 疫熒光的標(biāo)記及腫瘤的檢測等等。在制備抗體時(shí)，為便于表達(dá)蛋白的分離純化，一般在單鏈抗體的N端或C端插入一 6xHis 序列，便于用Ni-NTA親和層析柱純化目標(biāo)蛋白。但這一技術(shù)也存在一些問題，由于抗體分 子內(nèi)存在二硫鍵，而在原核表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)由于抗體不能正確折疊，容易形成包涵體，表達(dá)出來 的目標(biāo)蛋白無活性，需要在氧化還原體系中進(jìn)行復(fù)性。但近來也有報(bào)道在動(dòng)物細(xì)胞

7、細(xì)胞質(zhì)中 成功表達(dá)出具有抗原結(jié)合活性的單鏈抗體，若能成功解決融合抗體的表達(dá)問題，則在免疫染 色及腫瘤檢測這一領(lǐng)域融合抗體將扮演極為重要的角色。除了以上應(yīng)用之外，綠色熒光蛋白還普遍應(yīng)用于跟蹤觀察微生物、發(fā)育機(jī)理研究、細(xì)胞 篩選以及生物傳感器等許多生命科學(xué)研究中。三、GFP的突變及其應(yīng)用GFP作為一種新型標(biāo)記物，正受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注，而且野生型的GFP也不斷地在 被改造，著名的生物學(xué)家錢永健所完成的單點(diǎn)突變(S65T)顯著提高了 GFP的光譜性質(zhì)，其熒 光強(qiáng)度和光穩(wěn)定性也大大增強(qiáng)。突變后的GFP激發(fā)峰轉(zhuǎn)移至488 nm,而發(fā)射峰仍保持在509 nm,這和常用的FITC濾光片匹配，提高了 GFP的

8、應(yīng)用潛力。此外，GFP還存在其他的突變，如顏色突變。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了藍(lán)色熒光蛋白質(zhì) (EBFP,EBFP2,Azurite,mKalama1 青色熒光蛋白質(zhì)(ECFP, Cerulean,CyPet和黃色熒光蛋白質(zhì) (YFP,Citrine,Venus,Ypet等,它們可以使我們跟蹤不同蛋白質(zhì)的反應(yīng)4?！窘Y(jié)語】綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)作為一個(gè)具有獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的可編碼基因 的生物分子，成為了尋找藥物作用靶標(biāo)和篩選新藥的重要工具，被廣泛運(yùn)用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué) 研究等領(lǐng)域，為人類探究生命過程提供了十分寶貴的信息。參考文獻(xiàn)1 Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends Biochem Sci,1995, 20 (11):448 -455薛啟漢.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)學(xué)報(bào),1999,15 (1):52 -58Cubitt A B, Heim R, Adams S Ret al. Trends BiochemSci,1995, 20 (11