蛋白質(zhì)與氨基酸的測(cè)定公共課

1、蛋白質(zhì)與氨基酸的測(cè)定教學(xué)目標(biāo) 了解蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志；掌握凱氏定氮法、雙縮脲法、茚三酮比色法、氨基態(tài)氮的測(cè)定方法及原理。 重點(diǎn)掌握：蛋白質(zhì)系數(shù)的概念；凱氏定氮中各種試劑的用途；凱氏定氮裝置的原理及操作技能；掌握PH計(jì)甲醛滴定法測(cè)定氨基態(tài)氮的原理、方法及其操作技能。 教學(xué)內(nèi)容（重點(diǎn)及難點(diǎn)）1、凱氏定氮法（蛋白質(zhì)系數(shù)，氮與蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，各種試劑的用途，各種步驟的目的及注意事項(xiàng)）2、氨基態(tài)氮的測(cè)定（甲醛固定氨基的作用；不同PH值指示的滴定意義）第一節(jié) 概述蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是食品中重要的營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)。食品中的蛋白質(zhì)種類非常復(fù)雜，蛋白質(zhì)分子量的變化范圍通常為50001000,

2、000道爾頓，它們包括氫、 碳、 氮、氧和硫等元素。測(cè)定原理食物中碳水化合物、脂肪中只含有C、H、O，不含有氮，含氮是蛋白質(zhì)區(qū)別于其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志，是存在于蛋白質(zhì)中最為特征的元素。 蛋白質(zhì)由氨基酸以不同比例構(gòu)成；氨基酸由C、H、O、N以不同方法構(gòu)成； 由于氨基酸種類不同和蛋白質(zhì)中氨基酸構(gòu)成比例不同導(dǎo)致蛋白質(zhì)的含氮量不同 不同食品中蛋白質(zhì)的含氮量為13.4%19.1% 因此，一般蛋白質(zhì)含氮量為16%， 1份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值（6.25）稱為蛋白質(zhì)系數(shù)，是一個(gè)平均值。*蛋白質(zhì)系數(shù)16%有一前提：這些氮元素都是指的是蛋白質(zhì)里的氮元素，因此，當(dāng)這些氮元素來(lái)源于氮元素含量極高的三聚

3、氰胺時(shí)，是無(wú)法用蛋白質(zhì)系數(shù)返算為產(chǎn)品中蛋白含量的。 食品中的總有機(jī)氮主要來(lái)自于蛋白質(zhì)，小部分來(lái)自于非蛋白質(zhì)組份的有機(jī)氮，會(huì)干擾蛋白質(zhì)的測(cè)定。 食品中脂類和碳水化合物可能會(huì)干擾 一些具有相似的物化性質(zhì)的組份干擾分析。干擾蛋白分析物質(zhì):凱氏定氮法包括有：常量法、微量法、經(jīng)改進(jìn)后的改良凱氏定氮法這三種方法的不同之處在于：儀器、裝置、試劑等都有了改進(jìn)二、凱氏定氮法凱氏定氮法測(cè)定的是粗蛋白的含量 因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等作蛋白質(zhì)的含氮化合物，故凱氏定氮法通常將測(cè)定結(jié)果稱為粗蛋白質(zhì)含量。2.1.2 凱氏定氮過(guò)程步驟：樣品制備(自學(xué)) 消化 蒸餾 吸收與滴定*學(xué)習(xí)中特別需要注

4、意掌握各個(gè)過(guò)程中所使用的試劑都有哪些作用2.1常量凱氏定氮法1. 原理 消化： 樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱，使蛋白質(zhì)分解，其中碳和氫被氧化為二氧化碳和水逸出，而樣品中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨與硫酸結(jié)合成硫酸銨。堿化蒸餾：然后加堿蒸餾，使氨蒸出。吸收與滴定： 用H3BO3吸收后生成硼酸氨； 再以標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定； 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的含量。2.1.2.2 濕法消化蛋白質(zhì)中的氮形成銨離子和硫酸結(jié)合成硫酸銨，硫酸氧化有機(jī)物使碳元素和氧元素被轉(zhuǎn)化成二氧化碳和水。樣品中的有機(jī)物消化至透明澄清. 加硫酸作用：濃硫酸具有脫水性，使有機(jī)物脫水并炭化為碳、氫、氮。 濃硫酸又有氧化性，使炭化后的碳氧化為

5、二氧化碳，硫酸則被還原成二氧化硫加入量不能太大：否則消化體系溫度過(guò)高，生成的銨鹽發(fā)生熱分解放出氨而造成損失。也可以加入硫酸鈉、氯化鉀提高沸點(diǎn)，效果較差硫酸鉀：增溫劑，提高溶液沸點(diǎn)加速蛋白質(zhì)的分解，縮短消化時(shí)間，加入催化劑：加硫酸銅作用：加速有機(jī)物的氧化與分解有機(jī)物全部被消化完后，不再有硫酸亞銅褐色生成，溶液呈現(xiàn)清澈的二價(jià)銅的籃綠色，可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)2.1.2.3 堿化、蒸餾 消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使溶液呈堿性，加熱蒸餾，釋放出氨氣2.1.2.4吸收與滴定 4%硼酸吸收； 鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定； 指示劑為混合指示劑（甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑）。甲基紅溴甲基酚綠混合指示劑終點(diǎn)判斷：指

6、示劑在反應(yīng)過(guò)程中色澤變化: （酸性條件下為甲基紅所顯的紅色，當(dāng)體系變?yōu)榫G色時(shí)則呈現(xiàn)溴甲基酚綠所有的綠色，因此，稱為混合指示劑）指示劑先加入硼酸中，呈現(xiàn)酸性紅色，通入氨氣后呈現(xiàn)變藍(lán)綠色；用HCL一滴定，到后來(lái)又顯了稍過(guò)量鹽酸的酸性紅色定氮裝置一、1、電爐； 2、水蒸氣發(fā)生器；3、螺旋夾a；4、小漏斗及棒狀玻璃塞（樣品入口處）；5、反應(yīng)室；6、反應(yīng)室外層；7、橡皮管及螺旋夾b；8、冷凝管9、蒸餾液接收瓶。 定氮裝置二2.1.3定氮裝置的檢查與洗滌 檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發(fā)生瓶?jī)?nèi)裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。 測(cè)定前定氮

7、裝置如下法洗滌23次：從樣品進(jìn)口入加水適量（約占反應(yīng)管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產(chǎn)生的蒸汽沖洗冷凝管，數(shù)分鐘后關(guān)閉夾子a，使反應(yīng)管中的廢液倒吸流到反應(yīng)室外層，打開(kāi)夾子b由橡皮管排出，如此數(shù)次，即可使用。 本實(shí)驗(yàn)的定量以氮原子的去向?yàn)闇?zhǔn)一開(kāi)始是蛋白-氨氣-硼酸胺所以必須關(guān)注這三種物質(zhì)不能在檢測(cè)過(guò)程中的損失，無(wú)論在消化還是吸收或是滴定過(guò)程中，都要保證其不損失2.1.4 計(jì)算新鮮食品中的含氮化合物大多以蛋白質(zhì)為主體，先測(cè)定總氮量，然后乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，得到蛋白質(zhì)含量。換算系數(shù)一般為6.25（100/16 = 6.25）。 即：%N 6.25 = %蛋白質(zhì) 2.1.5消化過(guò)程操作注意事項(xiàng)： 消化時(shí)

8、不用強(qiáng)火，保持和緩沸騰，以免黏附在凱氏瓶?jī)?nèi)壁上的含氮化合物在無(wú)硫酸存在的情況下未消化完全而造成氮損失。 消化過(guò)程中應(yīng)不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏燒瓶，利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘?jiān)聪?，促進(jìn)其消化完全。 問(wèn)題1:為什么凱氏定氮所用試劑溶液應(yīng)用無(wú)氨蒸餾水配制,如何配制。 問(wèn)題二：加硫酸銅作用起催化劑的作用。 還可指示消化終點(diǎn)的到達(dá)，為清澈的藍(lán)綠色。 指示蒸餾時(shí)的堿加入量是否足夠。 問(wèn)題三：消化過(guò)程中是否有大量的泡沖到瓶頸，原因是什么，如何解決？ 樣品中若含脂肪或糖較多 開(kāi)始消化時(shí)應(yīng)用小火加熱，并時(shí)時(shí)搖動(dòng)；或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑，并同時(shí)注意控制熱源強(qiáng)度。 消化至呈透明后，繼續(xù)消化30分鐘即可，

9、含有特別難以氨化的氮化合物的樣品，需適當(dāng)延長(zhǎng)消化時(shí)間。有機(jī)物如分解完全，消化液呈藍(lán)色或淺綠色，但含鐵量多時(shí)，呈較深綠色。問(wèn)題四：如何判斷消化的終點(diǎn)？ 問(wèn)題五：蒸餾前若加堿量不足會(huì)出現(xiàn)什么現(xiàn)象，為什么，如何解決？ 若加堿量充足，消化液變?yōu)樯钏{(lán)色，或產(chǎn)生黑色氫氧化銅沉淀，若加堿量不足，則消化液呈藍(lán)色而無(wú)沉淀，此時(shí)需再增加氫氧化鈉用量。 蒸餾完畢 先將冷凝管下端提離液面清洗管口 再蒸1分鐘，用表面皿接幾滴餾出液，以奈氏試劑檢查如無(wú)紅棕色物生成，表示蒸餾完畢，即可停止加熱。 （避免吸收液倒吸）問(wèn)題六：蒸餾完畢拆下裝置時(shí)的注意事項(xiàng) 不能超過(guò)40，否則對(duì)氨的吸收作用減弱而造成損失，可置于冷水浴中使用。問(wèn)題

10、七：為何要控制硼酸吸收液的溫度？問(wèn)題八：混合指示劑顏色： 在堿性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。問(wèn)題九：硫酸與鹽酸滴定的區(qū)別注意：H2SO4 與 HCL的區(qū)別1/2（H2SO4）= HCL優(yōu)點(diǎn)：1可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析。 2操作比較簡(jiǎn)單。 3實(shí)驗(yàn)費(fèi)用低。 4結(jié)果準(zhǔn)確，是一種測(cè)定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法。 5用微量法可測(cè)定樣品中微量的蛋白質(zhì)。缺點(diǎn) 1最終測(cè)定的是總氮含量，而不只是蛋白質(zhì)氮。 2實(shí)驗(yàn)時(shí)間太長(zhǎng)。 3所用試劑有腐蝕性。 本實(shí)驗(yàn)方法的優(yōu)、缺點(diǎn)2.2 微量凱氏定氮法1、原理及適用范圍同前2、與常量法不同點(diǎn)：加入硼酸量有50 ml 10 ml,滴定用鹽酸濃度由0.1 mol

11、/L 0.01 mol/L ,可用微量滴定管。2.3常量改良凱氏定氮法2.3.1 原理及適用范圍同前 在凱氏法改良中主要的問(wèn)題是： 氮的完全氮化、縮短時(shí)間、簡(jiǎn)化操作 這里主要需解決的是催化劑的種類、硫酸和鹽類的添加量等。 2.3.2 特點(diǎn)：（1）消化裝置用優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶，紅外線加熱的消化爐。（2）快速：一次可同時(shí)消化8個(gè)樣品，30分鐘可消化完畢。（3）自動(dòng)：自動(dòng)加堿蒸餾，自動(dòng)吸收和滴定，自動(dòng)數(shù)字顯示裝置?？捎?jì)算總氮百分含量并記錄，12分鐘完成1個(gè)樣。為什么在蒸汽發(fā)生瓶中要加入指示劑甲基橙和硫酸？加入數(shù)粒玻璃珠的作用是什么？凱氏定氮瓶的結(jié)構(gòu)對(duì)于定氮操作：內(nèi)層加消化液、加堿液是反應(yīng)發(fā)生器

12、。外層加無(wú)氨蒸餾水、加熱產(chǎn)生蒸汽-蒸汽從內(nèi)外兩層連接小口處通入，對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行水蒸氣蒸餾。還有一部分是氨氣冷凝裝置。對(duì)于定氮瓶清洗操作：倒吸-需有壓力差（內(nèi)層壓力應(yīng)大，外層壓力應(yīng)小才能產(chǎn)生倒吸）-由于本實(shí)驗(yàn)裝置中無(wú)產(chǎn)生壓力裝置，是利用了大氣壓力，和冷卻水快速流過(guò)細(xì)玻璃管所產(chǎn)生的負(fù)壓之間的壓差-找尋大氣壓力入口，找尋負(fù)壓產(chǎn)生入口及負(fù)壓的封閉系統(tǒng)三、雙縮脲法原理： 堿性條件下，銅離子和多肽（至少有二個(gè)肽鍵，如多肽和所有的蛋白質(zhì)）生成的復(fù)合物呈紫紅色，吸收波長(zhǎng)為560nm，比色所得的吸光度值和樣品中蛋白質(zhì)的含量成正比。樣品的測(cè)定： 自學(xué)氨基酸態(tài)氮的測(cè)定雙指示劑甲醛滴定法電位滴定法四、氨基酸態(tài)氮的測(cè)定4

13、.1 雙指示劑甲醛滴定法原理： 氨基酸具有酸性的-COOH基和堿性的-NH2基。它們相互租用而使氨基酸成為中性的內(nèi)鹽。 當(dāng)加入甲醛溶液時(shí)，-NH2基與甲醛結(jié)合，從而使其堿性消失。 這樣就可以用強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)滴定 -COOH基，并用間接的方法測(cè)定氨基酸的總量。 吸取含氨基酸約20mg的樣品溶液于100ml容量瓶中，加水至標(biāo)線，混勻后吸取20.0ml置于200ml燒杯中，加水60ml，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.05mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示pH8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液ml數(shù)（V10），供計(jì)算總酸含量。 加入10.0ml甲醛溶液，混勻。再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至pH9.2

14、，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。而真正樣品中強(qiáng)堿標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定 -COOH基的過(guò)程是指: 此法準(zhǔn)確快速，適用于測(cè)定食品中游離氨基酸。 固體樣品應(yīng)先進(jìn)行粉碎，準(zhǔn)確稱樣后用水萃取，然后測(cè)定萃取液；液體試樣如醬油、飲料等可直接吸取試樣進(jìn)行測(cè)定。 但不適合顏色較深或渾濁的樣品測(cè)定。說(shuō)明及注意事項(xiàng)4.2 電位滴定法原理： 根據(jù)氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，將酸度計(jì)的玻璃電極及甘汞電極同時(shí)插入被測(cè)液中構(gòu)成電池，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，依據(jù)酸度計(jì)指示的pH值判斷和控制滴定終點(diǎn)。五、茚三酮比色法原理 氨基酸（酰氨鍵）在堿性溶液中能與茚三酮作用，生成藍(lán)紫色化合物（除脯氨酸外均有此反

15、應(yīng)），可用吸光光度法測(cè)定。 該藍(lán)紫色化合物的顏色深淺與氨基酸含量成正比，其最大吸收波長(zhǎng)為570nm，故據(jù)可以測(cè)定樣品中氨基酸含量。1、凱氏定氮法是通過(guò)對(duì)樣品總氮量的測(cè)定換算出蛋白質(zhì)的含量，這是因?yàn)?。2凱氏定氮法消化過(guò)程中H2SO4的作用是 ；CuSO4的作用是 。3凱氏定氮法的主要操作步驟分為消化、蒸餾、吸收、滴定；在消化步驟中，需加入少量辛醇并注意控制熱源強(qiáng)度，目的是 ；在蒸餾步驟中，清洗儀器后從進(jìn)樣口先加入 ，然后將吸收液置于冷凝管下端并要求 ，再?gòu)倪M(jìn)樣口加 入 20%NaOH至反應(yīng)管內(nèi)的溶液有黑色沉淀生成或變成深藍(lán)色，然后通水蒸汽進(jìn)行蒸餾；蒸餾完畢，首先應(yīng) ，再?；饠鄽?。凱氏定氮法共分四個(gè)步驟、。消化時(shí)還可加入、助氧化劑。消化加熱應(yīng)注意，含糖或脂肪多的樣品應(yīng)加入作消泡劑。消化完畢時(shí)，溶液應(yīng)呈顏色。凱氏定氮法加堿進(jìn)行蒸餾時(shí)，加入NaOH 后溶液呈 色。4. K2SO4在