2022時(shí)差成像技術(shù)在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展（全文）

1、2022時(shí)差成像技術(shù)在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展(全文)摘要隨著對(duì)體外胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)、時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)的認(rèn)知，時(shí)差成像技術(shù) (time-lapse technology , TLT )已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)快速發(fā)展的階段。TLT 能實(shí)時(shí)連續(xù)記錄胚胎從受精、卵裂、囊胚形成的各項(xiàng)細(xì)節(jié)圖像并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng) 觀(guān)察胚胎技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)節(jié)，為胚胎篩選提供依據(jù)。此外，TLT還能在 臨床應(yīng)用、實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中發(fā)揮作用。與此同時(shí)，TLT在體外胚胎發(fā)育 分析、人工智能開(kāi)發(fā)中也存在問(wèn)題，本文將對(duì)其進(jìn)行探討。時(shí)差成像技術(shù)(time-1叩se technology , TLT )融合了胚胎體外培養(yǎng)及 計(jì)算機(jī)控制的實(shí)時(shí)觀(guān)察系統(tǒng)。TLT培養(yǎng)體系可降

2、低離箱操作所引起的胚胎 應(yīng)激基因的表達(dá)；而TLT系統(tǒng)長(zhǎng)波光的照射強(qiáng)度遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)培養(yǎng)等。1997年至2010年間，TLT僅作為記錄胚胎發(fā)育基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的培養(yǎng)系統(tǒng)， 2011年后隨著體外胚胎形態(tài)學(xué)參數(shù)、時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)逐漸被認(rèn)知，TLT 進(jìn)入了一個(gè)快速發(fā)展的階段。與傳統(tǒng)體外受精(in vitro fertilization ,IVF ) 技術(shù)比較，TLT能實(shí)時(shí)連續(xù)記錄胚胎從受精、卵裂、囊胚形成的各項(xiàng)細(xì)節(jié) 圖像并發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)觀(guān)察胚胎技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)的細(xì)節(jié)，為胚胎篩選提供依據(jù)。此 外，TLT可為胚胎發(fā)育過(guò)程、胚胎碎片產(chǎn)生及非整倍體產(chǎn)生等重要問(wèn)題的 機(jī)制研究提供依據(jù)1-2 近年來(lái),隨著對(duì)TLT的持續(xù)研究,更多關(guān)于 員

3、的培訓(xùn)及管理提出了全新的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)信息處理及圖像分析提出了全新的 挑戰(zhàn)，也改變了日常的實(shí)驗(yàn)室操作流程，對(duì)管理層、醫(yī)師及胚胎學(xué)家提出 了全新的挑戰(zhàn)，也給出了更多的可能性。TLT在胚胎評(píng)估中的研究和報(bào)道相繼出現(xiàn)3-6 1-TLT的應(yīng)用現(xiàn)狀及臨床意義TLT實(shí)時(shí)記錄胚胎發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)，包括極體排出、原核形成/消失、第一次 卵裂、后續(xù)各期卵裂、桑根胚的細(xì)胞融合、囊胚腔形成、囊胚擴(kuò)張及孵出 等。TLT通過(guò)詳實(shí)的記錄，擴(kuò)展了傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)估的認(rèn)知：異常卵裂(1-3 分裂)7 、卵裂球不規(guī)則分裂8 1囊胚致密化9 等現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)離不 開(kāi)TLT的實(shí)時(shí)記錄，TLT還可用于分析細(xì)胞質(zhì)中無(wú)規(guī)則的原核運(yùn)動(dòng)3 1 原核同步性3

4、1雌原核的異常運(yùn)動(dòng)8 1卵裂溝的位置10 等細(xì)節(jié)現(xiàn) 象。Coticchio等11 提出的時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)對(duì)于TLT系統(tǒng)和IVF都具有重 要的意義，時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)成為預(yù)測(cè)臨床結(jié)局的有力工具。囊胚形成預(yù) 測(cè)參數(shù)：原核的形成與消失12 1第一次卵裂持續(xù)時(shí)間13 1第一與第 二次有絲分裂的間隔、第二與第三次卵裂間隔。胚胎著床預(yù)測(cè)參數(shù)：第 二極體排出時(shí)間(the time of the second polar body emission , tPB2 原核消失的時(shí)間(time to pronuclear fading , tPNf 二分裂時(shí)間(time of cleavage to a two-cell

5、 embryo , t2 )、四分裂時(shí)間(time of cleavage to a four-cell embryo , t4 )、囊胚孵出時(shí)間(time to hatching blastocyst, tHN )等14-17 1在幾項(xiàng)前期的研究報(bào)告中顯示，校正超促排卵方案、患者年齡、胚胎移植類(lèi)型和獲卵數(shù)等基線(xiàn)后，研究顯示2-細(xì)胞期卵裂球不均的囊胚以及4-細(xì) 胞多核胚胎會(huì)阻礙著床18-19在一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究中，出現(xiàn)2-3分裂的胚胎著床率低于正常卵裂的胚胎(1.2%比20.2% , P0.05 ) 7 L 一項(xiàng)對(duì)243位患者的299個(gè)胚胎進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)囊胚培養(yǎng)的時(shí)差動(dòng)力學(xué)分 析顯示：受精后25

6、.9 h內(nèi)第一次分裂形成2-細(xì)胞,37.9 h內(nèi)第二次分裂 形成4-細(xì)胞的胚胎及79.9 h內(nèi)達(dá)到囊胚期的胚胎與未在此時(shí)間內(nèi)完成分 裂的胚胎相比妊娠率較高(74.6%比40.9% , P0.01 )201 Azzarello 等21 比較了活產(chǎn)與未著床胚胎的原核形態(tài)和動(dòng)力學(xué)變化，顯示活產(chǎn)組 原核消失時(shí)間更長(zhǎng)(24.90.6 ) h 比(23.30.4 ) h , P=0.022 1此 外,原核消失發(fā)生在20.8 h前與活產(chǎn)相關(guān)。Amir等22 報(bào)道，與平衡 易位染色體的胚胎相比，非平衡易位胚胎時(shí)間動(dòng)力學(xué)參數(shù)異常，自受精至 4-細(xì)胞期及囊胚形成時(shí)間延長(zhǎng)(38.24.5) h比(39.54.8)

7、h ;( 100.1 7.3 ) h比(103.79.3 ) h，均P0.05 )。此夕卜，非平衡易位胚胎在 原核消退時(shí)表現(xiàn)出顯著延遲(24.13.3 ) h比(23.43.6 ) hF=0.011 1 近年來(lái) 多項(xiàng)研究報(bào)道了不規(guī)則分裂，囊胚開(kāi)始時(shí)間(start of blastulation , tSB 1 囊胚擴(kuò)張時(shí)間(time to expanded blastocyst, tEB )、間隔時(shí)間(tEB-tSB )以及整倍體和非整倍體狀態(tài)與著床率之間相關(guān)性23-24 , 利用TLT,存在非侵入性選擇染色體正常胚胎的可能性。另有納入5個(gè)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)randomized controlled

8、 trial ,RCT洪1637 名研究對(duì)象的meta分析表明,與傳統(tǒng)培養(yǎng)和評(píng)估相比，TLT能夠提高妊 娠率(51.0%比 39.9% 0.001 )、活產(chǎn)率(44.2%比 31.3% ?=0.009 ), 降低流產(chǎn)率(15.3%比21.3% , P=0.019 )251但最近一項(xiàng)包含9個(gè) RCT共2955名研究對(duì)象的分析顯示，TLT培養(yǎng)與傳統(tǒng)培養(yǎng)胚胎結(jié)局在活 產(chǎn)率、流產(chǎn)率或臨床妊娠率上的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義尚無(wú)定論26 1 同樣，其他meta分析也無(wú)法證實(shí)TLT對(duì)胚胎結(jié)局的影響10,27-28 L 由于研究證據(jù)的質(zhì)量差異，TLT培養(yǎng)和評(píng)估體系在活產(chǎn)率、持續(xù)妊娠率、 流產(chǎn)和死產(chǎn)率或臨床妊娠率

9、方面與傳統(tǒng)培養(yǎng)是否存在差異還有待繼續(xù)研 究。-TLT在實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制中的應(yīng)用以傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制指標(biāo)(key performance index , KPI)進(jìn)行日 常管理(包括培養(yǎng)箱數(shù)量/類(lèi)型、培養(yǎng)液組成、氧濃度、培養(yǎng)皿、人員操作 等)易導(dǎo)致信息延滯的困擾，如以臨床妊娠或胚胎著床考察人員或培養(yǎng)體 系需追溯28 d左右，對(duì)臨床工作及患者造成質(zhì)量控制的滯后性。之前的 實(shí)驗(yàn)表明，在培養(yǎng)液中加入過(guò)氧化異丙苯，胚胎呈現(xiàn)出與正常培養(yǎng)基不同 的時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)29 1并且在不同培養(yǎng)液、不同空氣質(zhì)量的培養(yǎng)環(huán)境 中30 ,時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)比形態(tài)學(xué)、囊胚形成率在不同培養(yǎng)液中反應(yīng)更 敏感。這些研究表明，不同的培養(yǎng)體

10、系可能造成時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)的不同。 將時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)引入質(zhì)控，在胚胎培養(yǎng)23 d就可以判斷操作培養(yǎng)體系 存在的問(wèn)題。時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)可以精細(xì)量化時(shí)間，其敏感性?xún)?yōu)于囊胚形成 率且可以縮短質(zhì)控周期，基于上述原理，TLT及時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)可能優(yōu)化 傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控流程。= TLT應(yīng)用中需要注意的問(wèn)題.安全性：胚胎暴露于一定強(qiáng)度、某些波長(zhǎng)的光源中可能影響胚胎發(fā)育。 有證據(jù)表明，光照對(duì)胚胎發(fā)育有負(fù)面影響，藍(lán)光(400-500 nm )相比紅 光、橙光等更可能導(dǎo)致氧化應(yīng)激31 ;損傷作用不僅與光譜組成相關(guān)， 與光照的強(qiáng)度和曝光時(shí)間亦呈相關(guān)性。TLT標(biāo)量輻照度、光暴露低于傳統(tǒng) 形態(tài)學(xué)評(píng)估，在將胚胎培養(yǎng)至57 d的

11、TLT系統(tǒng)觀(guān)察期，TLT曝光時(shí)間總 量明顯低于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)評(píng)估18 1與常規(guī)胚胎培養(yǎng)相比，TLT可保持關(guān) 鍵環(huán)境參數(shù)的穩(wěn)定性(如溫度、二氧化碳濃度、氧含量等)32 ,減少將 胚胎取出培養(yǎng)箱導(dǎo)致培養(yǎng)環(huán)境變化對(duì)胚胎的影響。多項(xiàng)研究報(bào)告稱(chēng)，TLT 為胚胎的觀(guān)察、研究和臨床應(yīng)用提供了目前認(rèn)為安全的環(huán)境，與傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn) 培養(yǎng)箱相比，在TLT體系中進(jìn)行胚胎培養(yǎng)有助于胚胎發(fā)育及胚胎評(píng)估，但 仍缺乏相關(guān)的RCT作為依據(jù)33-34 L.與患者的交互性：借助于TLT的記錄系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)室工作人員可為患者提 供胚胎發(fā)育的圖像，而不再是枯燥的數(shù)字及符號(hào)。但考慮到專(zhuān)業(yè)與復(fù)雜性, 與患者溝通胚胎形態(tài)動(dòng)力學(xué)相關(guān)專(zhuān)業(yè)信息時(shí)，患者可能無(wú)

12、法理解其含義, 醫(yī)生需要耐心向患者進(jìn)行解釋。需要說(shuō)明的是：TLT并不能精準(zhǔn)識(shí)別胚胎 著床發(fā)育潛能，僅能根據(jù)已有的TLT分析數(shù)據(jù)對(duì)胚胎移植順序進(jìn)行分類(lèi)； TLT能否改善臨床結(jié)局目前仍然缺乏足夠的證據(jù)35-37 I.信息化大數(shù)據(jù)與人工智能(artificial intelligence , AI):近年來(lái)，隨著 學(xué)習(xí)算法的進(jìn)步，電子醫(yī)療數(shù)據(jù)的增加和計(jì)算處理能力的提高，AI以一種 用于多參數(shù)分析的無(wú)偏倚方法參與到數(shù)據(jù)分析中。在使用TLT的前提下, 嘗試使用更強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)處理能力分析大量的圖像數(shù)據(jù)集，以確定可能與 胚胎發(fā)育能力相關(guān)的參數(shù)。AI不只是依賴(lài)于胚胎學(xué)家的訓(xùn)練來(lái)分析胚胎特 征，而是對(duì)胚胎的整個(gè)

13、圖像進(jìn)行評(píng)估，允許對(duì)所有可用數(shù)據(jù)進(jìn)行量化，從 而識(shí)別胚胎學(xué)家人眼無(wú)法識(shí)別的形態(tài)學(xué)特征。先前的研究運(yùn)用形態(tài)動(dòng)力學(xué)分析方法36 , 38 ,基于研究胚胎發(fā)育中已知事件（如早期卵裂等）對(duì)這些已知事件進(jìn)行評(píng)分。目前，通過(guò)利用經(jīng)典機(jī)器學(xué)習(xí)方法，如支持向量機(jī)（support vector machines , SVM ）和 隨機(jī)森林以及深度學(xué)習(xí)方法，如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（convolutional neuralnetworks , CNN ） 39-40 來(lái)進(jìn)行結(jié)果預(yù)測(cè)或等級(jí)分類(lèi)，基于從數(shù)據(jù)中 的層次學(xué)習(xí)，通過(guò)多層的相互連接的神經(jīng)元處理信息41 L AI可以直接分析整個(gè)原始延時(shí)視頻，利用從TLT采集的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)

14、來(lái)進(jìn)行胚胎評(píng)估。到目前為止，已有幾種AI方法被用于評(píng)估囊胚。圖像分割和先進(jìn)的圖像 分析技術(shù)，使用具有紋理描述符的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、水平集、相位一致性和擬合 橢圓方法已經(jīng)在小鼠42 牛39 和人43 的囊胚中被證實(shí)。有研 究利用CNN的深度學(xué)習(xí)算法與胚胎學(xué)家分別對(duì)97例患者的胚胎進(jìn)行雙 盲評(píng)估，研究顯示CNN的深度學(xué)習(xí)算法選擇高質(zhì)量胚胎的準(zhǔn)確率高于胚 胎學(xué)家（單胚胎移植周期：63.9%比52.8% , P0.05 ;雙胚胎移植周期: 79.4%比72.4% , P0.05 ）,利用AI在鑒定具有高發(fā)育潛力的胚胎方面超 過(guò)胚胎學(xué)家的能力44 L在胚胎存活率評(píng)估中,Rocha等45 報(bào)道, AI能在選擇第5

15、日具有高植入潛力的胚胎以及在預(yù)測(cè)胚泡發(fā)育方面表現(xiàn) 出高度的準(zhǔn)確性。Segal等46 利用隨機(jī)森林，利用2744個(gè)胚胎進(jìn)行 形態(tài)學(xué)評(píng)估來(lái)預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育情況，準(zhǔn)確率達(dá)76.4% ,敏感度為55.0% ,特 異度為87.8%0此外Iwata等47 利用基于CNN的深度學(xué)習(xí)方法結(jié)合 TLT,對(duì)118個(gè)人類(lèi)胚胎進(jìn)行監(jiān)測(cè)，以確定質(zhì)量良好的胚胎。通過(guò)驗(yàn)證不 同的細(xì)胞階段預(yù)測(cè)胚胎質(zhì)量，數(shù)據(jù)集精確度達(dá)到70%90%。此外，AI 對(duì)體外胚胎發(fā)育時(shí)的形態(tài)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)分析預(yù)測(cè)了捐卵周期的活產(chǎn)情況，準(zhǔn) 確率超過(guò)90.0% ,預(yù)測(cè)被選擇胚胎自然流產(chǎn)的準(zhǔn)確率達(dá)77.0% 48L研 究證實(shí)整倍體胚胎和非整倍體胚胎有不同的動(dòng)力學(xué)行

16、為49 logistic 回歸分析在校正超促排卵方案、患者年齡、不孕年限、激素水平(抗苗勒 管激素、卵泡刺激素、雌二醇)、胚胎移植類(lèi)型和獲卵數(shù)等基線(xiàn)后，分析 胚胎出現(xiàn)2-細(xì)胞到5-細(xì)胞(t5-t2 3-細(xì)胞到5-細(xì)胞(cc3 )分裂情況時(shí)， 與胚胎非整倍體的相關(guān)性。以是否為整倍體胚胎為自變量，胚胎出現(xiàn)2- 細(xì)胞到 5-細(xì)胞(OR=2.85 , 95% CI=1.764.62 )、3-細(xì)胞到 5-細(xì)胞 (OR=2.10,95% Q=1.363.24 )分裂情況時(shí)，預(yù)示著胚胎為非整倍體 的可能性增大。利用TLT發(fā)現(xiàn)這些差異，結(jié)合AI可提高非侵入性選擇正 常胚胎的概率。但AI預(yù)測(cè)染色體整倍性也受置于

17、胚胎植入前非整倍性檢測(cè)(preimplantation genetic testing for aneuploidy , PGT-A )的診斷精度。嵌合體是PGT檢測(cè)里的一項(xiàng)熱點(diǎn)問(wèn)題,活檢位置決定著能否獲取 真實(shí)的結(jié)果如活檢位置可能在:正常滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞(tropheetoderm ,TE 異常TE及復(fù)合TE細(xì)胞的位置,而現(xiàn)在的AI研究對(duì)標(biāo)的結(jié)果就是PGT-A的診斷結(jié)果，因此AI研究面臨著遭遇與PGT-A假陰性結(jié)果的可能性。目前所做的AI還處于早期胚胎的研究，而胚胎在桑意胚及囊胚期存 在修復(fù)機(jī)制，是否會(huì)修復(fù)早期的非整倍體胚胎也需要相關(guān)的研究證實(shí)。未來(lái)的AI和TLT必將結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)以促進(jìn)對(duì)大型數(shù)

18、據(jù)集的復(fù)雜分析,進(jìn) 而顯示目前尚未識(shí)別的視覺(jué)標(biāo)記組合。AI與TLT結(jié)合需借助于海量人工標(biāo) 注、分辨胚胎構(gòu)成如胚胎不同發(fā)育階段及相應(yīng)的細(xì)節(jié)現(xiàn)象，對(duì)技術(shù)人員專(zhuān) 業(yè)度及工作效率也是嚴(yán)峻考驗(yàn)?，F(xiàn)有部分研究已對(duì)AI及TLT聯(lián)合運(yùn)用有 初步成果，如利用通過(guò)卷積網(wǎng)絡(luò)運(yùn)算，識(shí)別原核數(shù)、原核位置、原核大小、 卵裂模式等7 0部分結(jié)果已經(jīng)顯示出人工智能評(píng)分等與胚胎質(zhì)量的相關(guān) 性50 1但胚胎學(xué)家們尚無(wú)法根據(jù)圖像信息判斷胚胎是否異常，同樣AI也存在無(wú) 法精確識(shí)別胚胎質(zhì)量的問(wèn)題。且由于AI系統(tǒng)的暗箱算法無(wú)法鑒別參數(shù)意 義，因此標(biāo)記可能出現(xiàn)誤判或出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，臨床AI應(yīng)用仍需要進(jìn)行 大量驗(yàn)證，以評(píng)估AI利用效能。.人員配置與硬件優(yōu)化:目前TLT圖像分析由胚胎實(shí)驗(yàn)室人員一對(duì)一完成, 借助動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育存在耗時(shí)長(zhǎng)、主觀(guān)性強(qiáng)等問(wèn)題，應(yīng)建立一個(gè) 新的技術(shù)崗位，經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)后負(fù)責(zé)TLT信息采集工作。現(xiàn)階段已知TLT 能夠提供時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)及記錄胚胎發(fā)育細(xì)節(jié)，但仍缺少一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)和 軟件綜合分析TLT記錄的各項(xiàng)時(shí)差動(dòng)力學(xué)參數(shù)，無(wú)法自動(dòng)告知胚胎學(xué)家體 外培養(yǎng)胚胎的情況以選擇可