第四章-微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基課件

1、第四章 微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基 營養(yǎng)物質是微生物生存的物質基礎，而營養(yǎng)是微生物維持和延續(xù)其生命形式的一種生理過程。營養(yǎng)物質:能夠滿足機體生長、繁殖和完成各種生理活動所需要的物質.營養(yǎng):微生物獲得和利用營養(yǎng)物質的過程。第一節(jié) 微生物的6類營養(yǎng)要素 微生物有六種營養(yǎng)要素，即碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水。碳源功能 C素構成細胞及代謝產物的骨架 C素是大多數(shù)微生物代謝所需的能量來源一、碳源凡能滿足微生物生長繁殖所需碳元素的營養(yǎng)源，稱為碳源（carbon source） 細胞含碳量：干重的50%。大量營養(yǎng)物質。 微生物的碳源譜碳源譜可分為有機碳與無機碳兩大類。凡必須利用有機碳源的微生物，就是為數(shù)

2、眾多的異養(yǎng)微生物。對異養(yǎng)微生物來說，其碳源又同時兼作能源，這種碳源又稱雙功能營養(yǎng)物。凡能利用無機碳源的微生物，則是自養(yǎng)微生物。 微生物碳源有機碳源：蛋白質、氨基酸、核酸、糖類、有機酸、醇、脂等。無機碳源：CO2、NaHCO3、CaCO3等。工業(yè)上常用淀粉、飴糖、玉米粉、纖維素、豆油、麩皮、米糠等。實驗室中，常用于微生物培養(yǎng)基的碳源主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、甘油和有機酸等。 凡是能被用來構成菌體物質中或代謝產物中氮素來源的營養(yǎng)物質稱為氮源。功能： 1）提供合成細胞中含氮物，如蛋白質、核酸以及含氮代謝物等的原料。 2）少數(shù)細菌可以銨鹽、硝酸鹽等氮源為能源。2.氮源氮源譜有機氮無機氮N

3、H3銨鹽硝酸鹽N2蛋白質核酸氨基酸尿素分子態(tài)氮：固氮微生物以分子氮為唯一氮源有機氮源：蛋白質、尿素、氨基酸、核酸等無機氮源：NH3、銨鹽、硝酸鹽、N2等生產上常用的氮源：硝酸鹽、銨鹽、尿素、氨以及蛋白含量較高的魚粉、蠶蛹粉、黃豆餅粉、花生餅份、玉米漿等 實驗室培養(yǎng)微生物常用的氮源：銨鹽、硝酸鹽、蛋白胨和肉湯等氮源種類微生物的氮源譜氨基酸自養(yǎng)型生物：能利用尿素、銨鹽、硝酸鹽甚至氮氣的生物氨基酸異養(yǎng)型生物：現(xiàn)成氨基酸按氮源的不同生物可分為：3.能源能源：能為微生物的生命活動提供最初能量來源營養(yǎng)物或輻射能，稱為能源。無機物：化能自養(yǎng)菌的能源：NH4+、NO2-、S、H、H2S、Fe2+等。4.生長因

4、子生長因子：是一類調節(jié)微生物正常代謝必須，且不能用簡單的碳源或氮源自行合成的有機物。需要量一般很少。 廣義的生長因子：除維生素外，還包括堿基、卟啉及其衍生物、甾醇、胺類、C4C6的分枝或直鏈脂肪酸，以及需要量較大的氨基酸 。狹義的生長因子：一般僅指維生素。 據(jù)微生物對生長因子的需要與否，將其分為三種類型：（1）生長因子自養(yǎng)型微生物 ：不需從外界吸收任何生長因子。（2）生長因子異養(yǎng)型微生物 ：需從外界吸收多種生長因子。（3）生長因子過量合成的微生物：能合成并分泌大量維生素等生長因子。含生長因子豐富的物質：酵母膏（酵母粉或酵母汁） 、玉米漿、麥芽汁等。五、無機鹽無機鹽或礦質元素主要可為微生物提供除

5、碳、氮源以外的各種重要元素。大量元素：微量元素：六、水生命系統(tǒng)存在和發(fā)展的必要條件。溶劑、維持各種生物大分子的穩(wěn)定性，參與重要生物化學反應，優(yōu)良物理性質。 生理功能：是微生物細胞重要組成部分，占70 90%；參與細胞內一系列化學反應；起到溶劑與運輸介質的作用；維持細胞膨壓，控制、調節(jié)細胞內溫度變化。 少數(shù)光合細菌利用水作為供氫體。第二節(jié) 微生物的營養(yǎng)類型 微生物的營養(yǎng)類型據(jù)能源、氫供體和基本碳源分為種類型第三節(jié)營養(yǎng)物質進入細胞的方式營養(yǎng)物質能否進入細胞取決于三個方面的因素：營養(yǎng)物質本身的性質（相對分子量、質量、溶解性、電負性等微生物所處的環(huán)境（溫度、PH等）；微生物細胞的透過屏障（原生質膜、細

6、胞壁、莢膜等）。營養(yǎng)物質進入細胞的方式有：單純擴散促進擴散主動運輸基團轉移單純擴散促進擴散一、單純擴散 單純擴散：又稱被動運送，指疏水性雙分子層細胞膜在無載體蛋白參與下，單純依靠物理擴散方式讓許多小分子、非電離分子尤其是親水性分子被動通過的一種物質運送方式。 物質在擴散過程中沒有發(fā)生任何反應；不消耗能量；不能逆濃度運輸；運輸速率與膜內外物質的濃度差成正比2促進擴散：溶質的運送過程中，必須借助于膜上底物特異性載體蛋白的參與，但不消耗能量的一類擴散性運送方式。 特點不消耗能量參與運輸?shù)奈镔|本身的分子結構不發(fā)生變化不能進行逆濃度運輸運輸速率與膜內外物質的濃度差成正比需要載體參與促進擴散模式圖細胞膜細

7、胞膜外細胞膜內恢復原構象移位再循環(huán)結合構象改變3主動運輸指一類須提供能量并通過細胞膜上特異性載體蛋白構象的變化，而使膜外環(huán)境中低濃度的溶質運入膜內的一種運送方式。 特點需要消耗代謝能；需要載體（滲透酶）參與；運輸方向是由胞外向胞內，逆濃度梯度方向進行；擴散沒有動態(tài)平衡點；對被運輸?shù)奈镔|具有高度的選擇性（立體專一性）；運輸?shù)奈镔|種類豐富，大多數(shù)氨基酸、糖類和一些離子。主動運輸模式圖細胞膜細胞膜外細胞膜內恢復原構象移位再循環(huán)結合構象改變ADP+PiATP4基團移位group translocation也是一種既需特異性載體蛋白又須耗能的運送方式，但溶質在運送前后會發(fā)生分子結構的變化，不同于上述的主

8、動運送?；鶊F轉位又稱為磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸糖轉移酶運輸系統(tǒng)（PTS），PTS 通常由五種蛋白質組成，包括酶I、酶II（包括a、b、c三種亞基）和一種低相對分子量的熱穩(wěn)定蛋白質（HPr）。細胞內高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基團把HPr激活。 酶1 PEP+HPr 丙酮酸+P-HPrHPr是一種低分子量的可溶性蛋白，結合在細胞膜上，具有高能磷酸載體的作用。運送步驟1、熱穩(wěn)載體蛋白(HPr)的激活膜外環(huán)境中的糖先與外膜表面的酶2結合，再被轉運到內膜表面。這時，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通過酶2的作用將糖-磷酸釋放到細胞內。 酶2 P-HPr+糖 糖-P +HPr2、糖被磷酸化后運

9、入膜內基團移位模式圖細胞膜外細胞膜內SSSS細胞膜Enz2Enz2Enz2Enz2SSHPrPPHPrEnz1+ PEP丙酮酸在酶的作用下HPr被激活在酶的作用下P-HPr將磷酸轉移給糖第四節(jié)培養(yǎng)基培養(yǎng)基(medium)是人工配制的，適合微生物生長繁殖或產生代謝產物的混合營養(yǎng)料。培養(yǎng)基幾乎是一切對微生物進行研究和利用工作的基礎六大營養(yǎng)要素：碳源、氮源、無機鹽、能源、生長因子、水任何培養(yǎng)基一旦配成，必須立即進行滅菌處理；常規(guī)高壓蒸汽滅菌： 1.05kg/cm2,121.315-30分鐘；0.56kg/cm2,112.615-30分鐘一、選用和設計培養(yǎng)基的原則和方法(一) 4個原則目的明確營養(yǎng)協(xié)調

10、理化條件適宜經濟節(jié)約培養(yǎng)基組分應適合微生物的營養(yǎng)特點 即根據(jù)不同微生物的營養(yǎng)需要配制不同的培養(yǎng)基。 不同營養(yǎng)類型的微生物，其對營養(yǎng)物的需求差異很大。如自養(yǎng)型微生物的培養(yǎng)基完全可以（或應該）由簡單的無機物質組成。異養(yǎng)做生物的培養(yǎng)基至少需要含有一種有機物質，但有機物的種類需適應所培養(yǎng)菌的特點。 按微生物的主要類群來說，它們所需要的培養(yǎng)基成分也不同。 當對試驗菌營養(yǎng)需求特點不清楚的時候，可以采用生長譜法進行測定。常見的培養(yǎng)四大類微生物的培養(yǎng)基細菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）：牛肉膏 3g 蛋白胨 10g NaCl 5g H2O 1000ml放線菌（高氏1號）淀粉 20g K2HPO4 0.5g NaCl

11、0.5g MgSO4.7H2O 0.5g KNO3 1g FeSO4 0.01g H2O 1000ml酵母菌(麥芽汁培養(yǎng)基)干麥芽粉加四倍水，在50-60保溫糖化3-4小時，用碘液試驗檢查至糖化完全為止，調整糖液濃度為10。巴林，煮沸后，沙布過濾，調PH為6.0。霉菌（查氏合成培養(yǎng)基）NaNO3 3g K2HPO4 1g KCl 0.5g MgSO4.7H2O 0.5gFeSO4 0.01g 蔗糖 30g H2O 1000ml營養(yǎng)物的濃度與比例應恰當對微生物細胞組成元素的調查或分析，是設計培養(yǎng)基時的重要參考依據(jù)。 要素：H2OC源(含能源)N源P、SK、 Mg生長素 含量：10-1 10-2

12、10-3 10-4 10-5 10-6培養(yǎng)基中各營養(yǎng)物質之間的濃度配比也直接影響微生物的生長繁殖和代謝產物的形成和積累，其中碳氮比（C/N）的影響較大。碳氮比指培養(yǎng)基中碳原子摩爾數(shù)與氮原子摩爾數(shù)的比值。一般地講，真菌需CN比較高的培養(yǎng)基(似動物的“素食”)細菌尤其是動物病原菌CN比較低的培養(yǎng)基(似動物的“葷食”)。物理化學條件適宜pH滲透壓和水活度氧化還原電位(1) pH培養(yǎng)基的pH必須控制在一定的范圍內，以滿足不同類型微生物的生長繁殖或產生代謝產物。通常培養(yǎng)條件：細 菌：7.08.0放線菌：7.58.5酵母菌：3.86.0霉 菌：4.05.8藻類:6.07.0 原生動物: 6.08.0在微生

13、物的生長和代謝過程中，由于營養(yǎng)物質的利用和代謝產物的形成與積累，培養(yǎng)基的初始pH值會發(fā)生改變，為了維持培養(yǎng)基pH值的相對恒定，通常采用下列兩種方式：內源調節(jié)：在培養(yǎng)基里加一些緩沖劑或不溶性的碳酸鹽；調節(jié)培養(yǎng)基的碳氮比。外源調節(jié)：按實際需要不斷向發(fā)酵液流加酸或堿液磷酸緩沖液：pH值從6.07.6之間K2HPO4+HCl KH2PO4+KClKH2PO4+KOH K2HPO4+H2O加入CaCO3：CO32 HCO3 H2CO3 CO2+H2O+H+H+H+H培養(yǎng)基中所含氨基酸、肽、蛋白質等物質也可起到緩沖作用。(2)滲透壓與水活度 滲透壓:兩不同濃度的溶液被一個半透性薄膜隔開，稀溶液中的水分子會

14、因水勢的推動而透過隔膜流向濃溶液，直至濃溶液所產生的機械壓力足以使兩邊水分子的進出達到平衡為止，這時由濃溶液中的溶質所產生的機械壓力，即為它的滲透壓值。 等滲溶液：適合細胞生長。 高滲溶液：質壁分離。 低滲溶液：吸水膨脹。 大多數(shù)微生物適合在等滲的環(huán)境下生長，而有的菌如Staphylococcus aureus則能在3mol/L NaCl的高滲溶液中生長。能在高鹽環(huán)境（2.86.2/L NaCl）生長的微生物常被稱為嗜鹽微生物（Halophiles）。微生物對水的需要程度（水對微生物生長的影響）常用環(huán)境（或基質）中的水活度值（water activity, w）表示。所謂w就是水的有效濃度。定

15、義：水活度為在一定的溫度條件下，溶液的蒸汽壓（材料上部蒸氣相中水濃度）與純水的蒸汽壓（即純水上部蒸氣相中水濃度）之比， 即：w=/ o 表示溶液的蒸汽壓 o表示純水的蒸汽壓在w為0.600.99的環(huán)境條件均有微生物生長，但對某種微生物而言，它對w的要求是一定的，微生物對水的需求有相當?shù)淖兓潭?。即微生物不同，其生長的最適w亦不同。幾類微生物生長最適w為了表示微生物生長與水的關系，有時也常用相對濕度（RH) 的概念（ w 100= RH ）；通常也用測定蒸氣相中相對濕度的方法得知溶液或物質的水活度。（3） 氧化還原勢氧化還原電位又稱氧化還原電勢（redox potential），是量度某氧化還原

16、系統(tǒng)中的還原劑釋放電子或氧化劑接受電子趨勢的一種指標，其單位是V（伏）或mV（毫伏）。 測量：電位計；化學指示劑。如刃天青。不同類型微生物生長對氧化還原電位的要求不同好氧性微生物：+0.1伏以上時可正常生長,以+0.3+0.4伏為宜；厭氧性微生物：低于+0.1伏條件下生長；兼性厭氧微生物：+0.1伏以上時進行好氧呼吸, +0.1伏以下時進行發(fā)酵。配制培養(yǎng)基時，應盡量考慮利用價廉并且易于獲得的原料作為培養(yǎng)基的成分，特別是在工業(yè)發(fā)酵中，培養(yǎng)基用量很大，更應該考慮到這一點，以便降低產品成本。以粗代精以野代家以廢代好以國代進以簡代繁以氮代朊以烴代糧以纖代糖 根據(jù)培養(yǎng)基的應用目的選擇原料及其來源該培養(yǎng)基

17、的應用目的：是培養(yǎng)菌體還是積累代謝產物？ 是實驗室種子培養(yǎng)還是大規(guī)模發(fā)酵？ 代謝產物是初級代謝產物還是次級代謝產物？ 用于培養(yǎng)菌體種子的培養(yǎng)基營養(yǎng)應豐富，氮源含量宜高（碳氮比低）；用于大量生產代謝產物的培養(yǎng)基其氮源一般應比種子培養(yǎng)基稍低，（但若發(fā)酵產物是含氮化合物時，有時還應提高培養(yǎng)基的氮源含量）；若代謝產物是次級代謝產物時要考慮是否加入特殊元素或特定的代謝產物；當所設計的是大規(guī)模發(fā)酵用的培養(yǎng)基時，應重視培養(yǎng)基中各成份的來源和價格，應選擇來源廣泛、價格低廉 的原料，提倡以粗代精，以廢代好。二、設計培養(yǎng)基的方法生態(tài)模擬：調查所培養(yǎng)菌的生態(tài)條件，查看“嗜好”，對“癥”下料初級天然培養(yǎng)基.參閱文獻：

18、查閱、分析文獻，調查前人的工作資料，借鑒人家的經驗，以便從中得到啟發(fā)設計有自己特色的培養(yǎng)基配方.精心設計：借助優(yōu)選法或正交試驗設計法等方法.試驗比較：不同培養(yǎng)基配方的選擇比較 單種成分來源和數(shù)量的比較 幾種成分濃度比例調配的比較 小型試驗放大到大型生產條件的比較 pH和溫度試驗附1：配置培養(yǎng)基時應注意的幾個問題及解決方法：1、沉淀 2、膠體強度的破壞3、褐色物質的形成 4、pH發(fā)生變化高壓蒸氣滅菌 一般培養(yǎng)基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min 含糖培養(yǎng)基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min 過濾滅菌，分別滅菌，間歇滅菌的應用附2：培養(yǎng)基的

19、滅菌附圖：過濾滅菌附3：器皿的滅菌及無菌室的消毒器皿的滅菌： 干熱空氣： 160， 2 小時無菌室的消毒： 紫外光 化學藥物熏蒸（苯酚；高錳酸鉀+甲醛）二、培養(yǎng)基的種類培養(yǎng)基種類繁多，根據(jù)其成分、物理狀態(tài)和用途可將培養(yǎng)分成多種類型。（一）按成分不同劃分天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基一類利用動、植物或微生物體或其提取物制成的培養(yǎng)基，是一類營養(yǎng)成分復雜,難以說出其確切成分的培養(yǎng)基。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基化學成分完全了解的物質配制而成的培養(yǎng)基高氏1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基主要以化學試劑配制,同時還加有某種或某些天然成分的培養(yǎng)基。 馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基（二）按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基

20、在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂含量一般為1.5%-2.0%瓊脂含量一般為0.2%-0.7%不加任何凝固劑半固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基常用來進行微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏 觀察微生物的運動特征、分類鑒定及噬菌體效價滴定 大規(guī)模工業(yè)生產及在實驗室進行微生物的基礎理論和應用方面的研究 脫水培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基(solid medium) 天然固體營養(yǎng)基質制成的培養(yǎng)基，或液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑（瓊脂1.52)而呈固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。為微生物的生長提供營養(yǎng)表面。常用于微生物的分離、純化、計數(shù)等方面的研究。可依使用目的不同而制成斜面、平板等形式. （1）固化培養(yǎng)基 ：瓊脂、明

21、膠作凝固劑。（2）非可逆性固化培養(yǎng)基：血清培養(yǎng)基或無機硅膠培養(yǎng)基（3）天然固態(tài)培養(yǎng)基：天然固態(tài)基質配制而成。（4）濾膜：堅韌且?guī)в袩o數(shù)微孔的醋酸纖維薄膜。 半固體培養(yǎng)基(semi-solid medium)： 在液體培養(yǎng)基中加入0.2-0.7的瓊脂構成的培養(yǎng)基。常用來觀察細菌運動的特征，以進行菌種鑒定和噬菌體效價滴定等方面的實驗工作。1.不被微生物分解、利用、液化；2.不因消毒滅菌而被破壞；3.在微生物的生長溫度內保持固態(tài)；4.凝固點的溫度對微生物無害；5.透明度好，粘著力強理想凝固劑應具備的條件液體培養(yǎng)基(liquid medium)： 液體培養(yǎng)基不含任何凝固劑，菌體與培養(yǎng)基充分接觸，操作方便，常用于大規(guī)模的工業(yè)生產以及在實驗室進行微生物生理代謝等基本理論的研究工作?？蓳?jù)培養(yǎng)后的濁度判斷微生物的生長程度. 脫水培養(yǎng)基 （脫水商品培養(yǎng)基、預制干燥培養(yǎng)基）：含有除水以外的一切成分的商品培養(yǎng)基。成分精確、使用方便等優(yōu)點。（三）按培養(yǎng)基對微生的功能分 1、基礎培養(yǎng)基(minimum medium)： 是含有一般微生物生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質的培養(yǎng)