微生物方法學(xué)驗(yàn)證

1、速效心痛滴丸2.微生物限度檢查參照中國藥典2005年版一部要求，對(duì)微生物限度檢查作驗(yàn)證試驗(yàn)如下：21微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)2.1.1.驗(yàn)證用菌種：金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草桿菌CMCC(B)63501、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)980032.1.2方法：中國藥典2005年版附錄一部XIIIC微生物限度檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)。2.1.3操作方法：(1)菌液制備：取經(jīng)37C培養(yǎng)24h金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-5(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/m1)做活菌計(jì)數(shù)備

2、用。取經(jīng)25C培養(yǎng)24h的白色念珠菌肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-5(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml)做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25C培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，用5ml生理鹽水洗下霉菌抱子，吸取菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1ml+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-4(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml)做活菌計(jì)數(shù)備用。(2)供試液制備：稱取供試品10g,研細(xì)，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀，混勻，作為1:10的供試液，分別人工污染上述5種代表實(shí)驗(yàn)菌株。(3)回收率測(cè)定實(shí)驗(yàn)組：取1:10供試液1ml和1ml實(shí)驗(yàn)菌液同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，

3、待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時(shí)，觀察計(jì)數(shù)?；罹M：照上述方法測(cè)定每1菌株的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。供試液對(duì)照：測(cè)定供試品本底菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組，取稀釋液同法操作，測(cè)定，應(yīng)無菌生長。4.結(jié)果：菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表2、表3：表2菌落計(jì)數(shù)（cfu/ml）實(shí)驗(yàn)次數(shù)金黃色葡萄球菌10-5枯草桿菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大腸埃希菌10-51959010595105959510580852100110858085958575105100390959590105901009510095表3速效心痛滴丸微生物限度檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)次數(shù)人工染菌回收率金黃色匍萄球菌枯草桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃

4、希菌180859095952759085909038090959595從表3可知，玉屏風(fēng)泡騰顆粒樣品處理后，按常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查供試品對(duì)5種菌株的回收率試驗(yàn)均高于70%可采用此法檢驗(yàn)。測(cè)定方法：取供試品10g,研細(xì)，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用勻漿儀，混勻，作為1:10的供試液，取此液1ml按常規(guī)平皿計(jì)算法測(cè)定即得。經(jīng)測(cè)定，三批樣品微生物檢查結(jié)果見表4：表4微生物限度檢查結(jié)果批號(hào)05021505021605021710-110-110-1稀釋倍數(shù)322222細(xì)菌總數(shù)平均2.5平均2.0平均2.0（1000個(gè)/g）報(bào)告25個(gè)/g報(bào)告20個(gè)/g報(bào)告20個(gè)/g0111

5、11霉菌、酵母菌總數(shù)平均0.5平均1.0平均1.0（100個(gè)/g）報(bào)告5個(gè)/g報(bào)告10個(gè)/g報(bào)告10個(gè)/g大腸埃希菌未檢出未檢出未檢出活螨未檢出未檢出未檢出結(jié)論：三批樣品均符合規(guī)定。頭孢呋辛酯片微生物限度檢查方法驗(yàn)證資料一、驗(yàn)證依據(jù)：中國藥典2005年版二部附錄XIJ“微生物限度檢查法”二、品名、規(guī)格、批號(hào)、廠牌：品名：頭孢呋辛酯片規(guī)格：0.125g批號(hào)：060417、060418、060419廠牌：江蘇正大清江制藥有限公司三、培養(yǎng)基名稱、批號(hào)、來源：所用培養(yǎng)基的名稱、批號(hào)、來源見表1表1培養(yǎng)基的名稱、批號(hào)、來源培養(yǎng)基名稱批號(hào)來源營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基050524北京三藥科技開發(fā)有限公司營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基

6、030225北京三藥科技開發(fā)有限公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基051009北京三藥科技開發(fā)有限公司曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基050203北京三藥科技開發(fā)有限公司膽鈉乳糖培養(yǎng)基050402北京三藥科技開發(fā)有限公司改良馬丁培養(yǎng)基050411北京三藥科技開發(fā)有限公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基050401北京三藥科技開發(fā)有限公司四、菌種：所用菌株的名稱、批號(hào)、來源見表2表2菌株的名稱、批號(hào)、來源菌株名稱菌種傳代次數(shù)來源大腸埃希菌EscherichiacoliCMCC(B)44102第2代中國藥品生物制品檢定所金黃色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC(B)26003第3代中國藥品生物制品檢定所枯草芽孢桿

7、菌BacillussubtilisCMCC(B)63501第4代中國藥品生物制品檢定所白色念珠菌CandiadaalbicansCMCC(F)98001第2代中國藥品生物制品檢定所黑曲霉AspergillusnigerCMCC(F)98003第3代中國藥品生物制品檢定所五、驗(yàn)證內(nèi)容：1.細(xì)菌數(shù)、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：鑒于本品為頭孢類抗生素，其主要作用是抗細(xì)菌，故對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)方法及控制菌檢查方法擬采用低速離心-薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用的方法進(jìn)行驗(yàn)證，霉菌及酵母菌的計(jì)數(shù)方法采用常規(guī)方法進(jìn)行驗(yàn)證。1）細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：（1）菌液的制備：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳接種至

8、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml中含50100cfu的菌懸液。（2）供試液的制備：稱取供試品10g,研細(xì)，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,搖勻，取10ml低速（500轉(zhuǎn)/分）離心5分鐘，取上清液并補(bǔ)足10ml，搖勻，即為1：10供試液。（3）驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組：取低速離心后制備的供試液1ml，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用0.45“m微孔濾膜過濾，再用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100ml，最后一次沖洗液中加入50100cfu的試驗(yàn)菌，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于3035C

9、培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)其菌數(shù)。菌液組：按照平皿計(jì)數(shù)方法測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取低速離心后制備的供試液1ml，加到pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml中,薄膜過濾，用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次,每次100ml，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于3035C培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)其菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：取pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至10ml，置離心管中，加入5001000cfu的試驗(yàn)菌，以500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，取1ml，加到pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml中，薄膜過濾，用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100ml

10、，取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，于3035C培養(yǎng)48小時(shí)，測(cè)其菌數(shù)。上述驗(yàn)證試驗(yàn)平行獨(dú)立試驗(yàn)三次?；厥章实臏y(cè)定：根據(jù)上述試驗(yàn)測(cè)得的菌數(shù)，按照公式計(jì)算回收率，結(jié)果見表3細(xì)菌回收率測(cè)定結(jié)果菌種類型試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)組菌液組供試品對(duì)照組稀釋劑回收率對(duì)照組試驗(yàn)組稀釋劑對(duì)照組170830658478大腸埃希菌267821678082368840688181169850738186金黃色葡萄球菌270910727779367881707580165870657575枯草芽孢桿菌266850677879368860647974結(jié)論：由表可見，上述三株菌的回收率為75%84%，回收率均70%，符合要求

11、。表明此方法可用于細(xì)菌數(shù)的測(cè)定。霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證：(1)菌液的制備：取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時(shí)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml中含50100cfu的菌懸液。取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物1白金耳接種至改良馬丁培養(yǎng)基中，培養(yǎng)57天，加入35ml0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫。然后用管口帶有薄棉花的無菌吸管吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml中含50100cfu的抱子懸液。(2)供試液制備：取供試品10g，研細(xì)，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，混勻，即為1：10供試液。(3)驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組：取無菌

12、平皿4個(gè)，分別加入1：10供試液1ml，其中2個(gè)平皿各加入含50lOOcfu白色念珠菌菌懸液1ml,另2個(gè)平皿各加入含50lOOcfu黑曲霉抱子懸液1ml,分別向平皿內(nèi)注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基1520ml,凝固后倒置,于2328C培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定菌數(shù)。菌液組：取無菌平皿4個(gè)，其中2個(gè)平皿各加入含50lOOcfu白色念珠菌菌懸液lml,另2個(gè)平皿各加入含50100cfu黑曲霉抱子懸液lml,分別向平皿內(nèi)注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基1520ml,凝固后倒置，于2328C培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定菌數(shù)。供試品對(duì)照組：取無菌平皿2個(gè)，分別注入供試液1ml,立即注入玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基1520ml，凝固后倒置，于232

13、8C培養(yǎng)72小時(shí)，測(cè)定菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組：鑒于本試驗(yàn)中供試品未經(jīng)采用任何方法進(jìn)行處理來制備供試液，故此項(xiàng)省略。上述驗(yàn)證試驗(yàn)平行獨(dú)立試驗(yàn)三次。回收率測(cè)定：根據(jù)上述試驗(yàn)測(cè)得的菌數(shù)，計(jì)算回收率。結(jié)果見表4表4霉菌及酵母菌回收率測(cè)定結(jié)果菌種類型試驗(yàn)次數(shù)試驗(yàn)組菌液組供試品對(duì)照組試驗(yàn)組回收率（）15771080白色念珠菌253680783506707514560075黑曲霉2415407634459075結(jié)論：由表可見，兩株菌的回收率為75%80%,回收率均70%，結(jié)果符合驗(yàn)證要求。2.控制菌檢查方法的驗(yàn)證：1）菌液的制備：取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物1白金耳接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)182

14、4小時(shí)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml中含10100cfu的菌懸液。2）供試液的制備：稱取供試品10g,研細(xì)，加PH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，搖勻，取10ml低速（500轉(zhuǎn)/分）離心5分鐘，取上清液并補(bǔ)足10ml，搖勻，即為1：10供試液。3）驗(yàn)證方法：試驗(yàn)組：取低速離心后制備的供試液10ml，加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，用0.45“m微孔濾膜過濾，再用pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100ml，最后一次沖洗液中加入大腸埃希菌菌懸液1ml（10100cfu），取出濾膜，放入100ml膽鈉乳糖培養(yǎng)基中，于35C培養(yǎng)24小時(shí)，取上

15、述培養(yǎng)物，照微生物限度檢查法中大腸埃希菌項(xiàng)下檢查方法（中國藥典2005年版二部附錄XIJ）進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表5。表5試驗(yàn)組試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果BL增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁MUG試驗(yàn)在366nm紫外線下，培養(yǎng)物出現(xiàn)熒光靛基質(zhì)試驗(yàn)液面出現(xiàn)玫瑰紅色出現(xiàn)大腸埃希菌的典型菌落，菌落呈紫黑色，圓形，凸起，邊緣整齊，表面光滑，曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基濕潤陰性菌對(duì)照組：方法同試驗(yàn)組，用金黃色葡萄球菌代替大腸埃希菌進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表6。表6陰性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果項(xiàng)目結(jié)果BL增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)基澄清MUG試驗(yàn)在366nm紫外線下，培養(yǎng)物未出現(xiàn)熒光靛基質(zhì)試驗(yàn)液面未出現(xiàn)玫瑰紅色曙紅亞甲藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)基表面無菌生長結(jié)論：從驗(yàn)證試驗(yàn)可看出，試驗(yàn)

16、組能檢出大腸埃希菌，而陰性對(duì)照組未能檢出金黃色葡萄球菌，說明采用低速離心-薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用的方法可消除本品對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用。故本品按此供試液制備方法進(jìn)行大腸埃希菌的檢驗(yàn)是可行的。六、微生物限度檢查方法及供試品的檢驗(yàn)：取本品照微生物限度檢查法（中國藥典2005年版二部附錄XIJ）進(jìn)行檢查，細(xì)菌數(shù)的測(cè)定及控制菌的檢查可采用低速離心（500轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘）-薄膜過濾聯(lián)合應(yīng)用的方法進(jìn)行試驗(yàn)，霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定可采用平皿法進(jìn)行測(cè)定。三批樣品及市售品的測(cè)定結(jié)果見表5。表5供試品微生物限度檢查結(jié)果批號(hào)細(xì)菌總數(shù)霉菌、酵母菌總數(shù)控制菌06041710個(gè)/g10個(gè)/g未檢出06041810個(gè)/g10個(gè)/

17、g未檢出06041910個(gè)/g10個(gè)/g未檢出市售品10個(gè)/g10個(gè)/g未檢出陰性對(duì)照-陽性對(duì)照/+結(jié)論：三批樣品及市售品的檢測(cè)結(jié)果均符合微生物限度標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)規(guī)定。復(fù)方垂盆草膠囊3.1微生物限度檢查法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)3.1.1.驗(yàn)證用菌種：金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草桿菌CMCC(B)63501、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)980033.1.2方法：中國藥典2005年版附錄一部XIIIC微生物限度檢查方法驗(yàn)證試驗(yàn)。3.1.3操作方法：(1)菌液制備：取經(jīng)37C培養(yǎng)24h金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml

18、+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-5(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/mD做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25C培養(yǎng)24h的白色念珠菌肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-5(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml)做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25C培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，用5ml生理鹽水洗下霉菌抱子，吸取菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1ml+9ml生理鹽水10倍稀釋至10-4(細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/mD做活菌計(jì)數(shù)備用。(2)供試液制備：稱取供試品10g,加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml用勻漿儀，混勻，作為1:10的供試液，分別人工污染上述5種代表實(shí)驗(yàn)菌株。(3)回收率測(cè)定a.實(shí)驗(yàn)組

19、：取1:10供試液1ml和1ml實(shí)驗(yàn)菌液同時(shí)加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時(shí)觀察計(jì)數(shù)?；罹M：照上述方法測(cè)定每1菌株的實(shí)驗(yàn)菌數(shù)。供試液對(duì)照：測(cè)定供試品本底菌數(shù)。稀釋劑對(duì)照組，取稀釋液同法操作，測(cè)定，應(yīng)無菌生長。4.結(jié)果：菌落計(jì)數(shù)結(jié)果，回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表3菌落計(jì)數(shù)（cfUmD實(shí)驗(yàn)次數(shù)金黃色葡萄球菌10-5枯草桿菌10-5白色念珠菌10-5黑曲霉10-4大腸埃希菌10-51909610694102989610580862110115868086958878105100390929295105901009510095表4復(fù)方垂盆草膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)次

20、數(shù)人工染菌回收率金黃色匍萄球菌枯草桿菌白色念珠菌黑曲霉大腸埃希菌175859098952808589969038180909596從表4可知，復(fù)方垂盆草膠囊樣品處理后，按常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查，供試品對(duì)5種菌株的回收率試驗(yàn)均高于70%可采用此法檢驗(yàn)。測(cè)定方法：取供試品10g,加pH7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀，混勻，作為1:10的供試液，取此液lml按常規(guī)平皿計(jì)算法測(cè)定即得。經(jīng)測(cè)定，三批樣品微生物檢查結(jié)果如下：表5微生物限度檢查結(jié)果批號(hào)050321050322050323稀釋倍數(shù)10-110-110-1細(xì)菌總數(shù)(1000個(gè)/g)121221平均1.5平均2.0平均1

21、.0報(bào)告15個(gè)/g報(bào)告20個(gè)/g報(bào)告10個(gè)/g霉菌、酵母菌總數(shù)(100個(gè)/g)001111平均0.5平均0.5平均1.0報(bào)告5個(gè)/g報(bào)告5個(gè)/g報(bào)告10個(gè)/g大腸埃希菌未檢出未檢出未檢出活螨未檢出未檢出未檢出結(jié)論：三批樣品均符合規(guī)定。華蟾素軟膠囊3、微生物限度檢查1、樣品華蟾素軟膠囊批號(hào)(041010041012041014)2、驗(yàn)證用菌種枯草桿菌CMCC(B)63501、金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003、大腸埃希菌CMCC(B)44102、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003。3、方法照中國藥典一部有關(guān)微生物限度檢查法方法驗(yàn)證試驗(yàn)。4、具體操作方法4.1菌

22、液制備：取經(jīng)37C培養(yǎng)24h，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌的肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水，10倍稀釋至105107，細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25C培養(yǎng)24h的白色念珠、菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至105107,細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)備用。取經(jīng)25C培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加5ml鹽水洗下霉菌抱子，吸取菌液，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，然后取1ml+9ml鹽水，逐管10倍稀釋為104,細(xì)菌數(shù)約為50100cfu/ml,做活菌計(jì)數(shù)備用。4.2供試液的制備稱取樣品10g,加無菌聚山梨酯805g,加45C0.1%蛋白胨氯化鈉稀釋液100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法混勻制成1:10的供試液,分別人工污染上述5種代表試驗(yàn)菌株。4.3回收率測(cè)定(1)活菌組取上述制備的活菌液1ml,再加1520ml瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度培養(yǎng)