課題2　土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù) (5)

1、課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)一、課題背景1、尿素的利用尿素是一種重要的農業(yè)氮肥。尿素不能直接被農作物吸收。土壤中的細菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細菌利用尿素的原因土壤中的細菌分解尿素是因為它們能合成脲酶CO(NH2)2脲酶+ H2O+ CO2NH33、常見的分解尿素的微生物芽孢桿菌、小球菌、假單胞桿菌、克氏桿菌、棒狀桿菌、梭狀芽孢桿菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。4、課題目的從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌一.研究思路.篩選菌株.統(tǒng)計菌落數(shù)目.設置對照 1、實例：思考：科學家能從熱泉中把耐熱細菌篩選出來的原理是什么？對我們有什么啟

2、示？DNA多聚酶鏈式反應（ PCR技術）是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，此項技術要求使用耐高溫（930C）的DNA聚合酶。 .篩選菌株要分離一種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養(yǎng)、生理、生長條件等；方法：抑制大多數(shù)微生物不能生長造成有利于該菌生長的環(huán)境，結果：培養(yǎng)一定時間后，該菌數(shù)量上升，再通過平板稀釋等方法對它進行純化培養(yǎng)分離。2、實驗室中微生物的篩選原理：人為提供有利于目的菌株生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時抑制或阻止其他微生物生長。15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO47H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素的細菌

3、的分離與計數(shù)所需培養(yǎng)基：從物理性質看此培養(yǎng)基屬于哪類？固體培養(yǎng)基在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源、氮源？碳源：葡萄糖、尿素 氮源：尿素培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。5、培養(yǎng)基選擇分解尿素的微生物的原理1、顯微鏡直接計數(shù)：利用血球計數(shù)板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。.統(tǒng)計菌落數(shù)目：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運動細菌的計數(shù)；需要相對高的細菌濃度；個體小的細菌在顯微鏡下難以觀察；缺點2.間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）原理：在稀釋度足夠高時

4、，微生物在固體培養(yǎng)基上所形成的一個菌落是由一個單細胞繁殖而成的，即一個菌落代表原先的一個單細胞。常用方法：稀釋涂布平板法。每克樣品中的菌落數(shù)(CV)M其中，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(ml)，M代表稀釋倍數(shù)。注意事項為了保證結果準確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板上進行計數(shù)。為使結果接近真實值可將同一稀釋度加到三個或三個以上的平皿中，經涂布，培養(yǎng)計算出菌落平均數(shù)。統(tǒng)計的菌落往往比活菌的實際數(shù)目低。涂布平板法所選擇的稀釋度很重要，一般以三個稀釋度中的第二個稀釋度所出現(xiàn)的平均菌落數(shù)在50個左右為最好。設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實

5、驗結果的影響，提高實驗結果的可信度。.設置對照：實例：在做分解尿素的細菌的篩選與統(tǒng)計菌落數(shù)目的實驗時，A同學從對應的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個菌落，但是其他同學在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個菌落。分析其原因。原因：土樣不同，培養(yǎng)基污染或操作失誤(或者是混入了其他的含氮物質)小結：通過這個事例可以看出，實驗結果要有說服力，對照的設置是必不可少的。方案一：由其他同學用與A同學相同土樣進行實驗 方案二：將A同學配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。結果預測：如果結果與A同學一致，則證明A無誤；如果結果不同，則證明A同學存在操作失誤或培養(yǎng)基的

6、配制有問題。二.實驗的具體操作 .土壤取樣 從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。.制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基。應在火焰旁稱取土壤10g。在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁進行分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保證獲得菌落數(shù)在30300之間、適于計數(shù)的平板三樣品的稀釋為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？原因：土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不

7、同的。例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2 185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。結論：為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。.取樣涂布實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記。注明培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)時間、稀釋度、培養(yǎng)物等。如果得到了2個或2個以上菌落數(shù)目在30300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進行菌落的計數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)相差較大，表明試驗不精確，需要重新實驗。.微生物的培養(yǎng)與觀察在菌落計數(shù)時，每隔24h統(tǒng)計一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結果，以防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落

8、的數(shù)目。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細菌：3037培養(yǎng)12d放線菌：2528培養(yǎng)57d霉菌：2528的溫度下培養(yǎng)34d。微生物的培養(yǎng)與觀察三.結果分析與評價1.通過對照實驗，若培養(yǎng)物有雜菌污染，菌落數(shù)偏高；若培養(yǎng)物混入其他氮源，則菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高，難以選擇出分解尿素的微生物。2.提示：選擇每個平板上長有30300個菌落的稀釋倍計算每克樣品的菌數(shù)最合適。同一稀釋倍數(shù)的三個重復的菌落數(shù)不能相差懸殊，如相差較大，表示實驗不精確。四、操作提示 無菌操作 做好標記 規(guī)劃時間 五.課外延伸 在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說明該細菌

9、能夠分解尿素。測定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細菌過濾器過濾后，將濾膜放到 伊紅美藍 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)黑色，通過記述得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。大腸桿菌呈 黑色中心 ,有或無金屬光澤大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂(EMB)上典型特征 本課題知識小結:六、例題解析 例1對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是A在液體培養(yǎng)基上進行 B至少接種一種細菌 C接種一個細菌 D及時補充消耗的營養(yǎng)物質 解析：細菌群體生長規(guī)律的測定是人們在一定條件下進行的。這些條件是：一種細菌、恒定容積的培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基、定時測定細菌總數(shù)。在這些條件下，才能測定出細菌的生長規(guī)律。測定時只能用一種細菌的子細胞群

10、體的變化規(guī)律表達微生物的生長；恒定容積是給微生物提供一定的生存環(huán)境；液體培養(yǎng)基才能通過樣品推測細菌總數(shù)。若接種多種細菌，則會發(fā)生種間斗爭而不能測定一種微生物的生長規(guī)律。在接種時，要保證一定的接種量。答案：A例2在微生物群體生長規(guī)律的測定中，種內斗爭最顯著最激烈的時期是A調整期 B對數(shù)期 C穩(wěn)定期 D衰亡期解析：種內斗爭是一種生態(tài)因素。種內斗爭反應了種內生物對生存空間和生活資源的爭奪。在生活空間充裕，營養(yǎng)充足的時候，種內斗爭的程度是比較低的。隨著微生物個體數(shù)目的增加，每個個體的生存空間越來越少，營養(yǎng)物質也越來越少，每個個體對生存空間和資源的爭奪也越來越激烈，種內斗爭就越來越激烈。由此可知，在穩(wěn)定

11、期的種內斗爭最激烈。在衰亡期，微生物的數(shù)目已經開始減少，pH已經極度不適于微生物的生存，次級代謝產物積累到很高的程度，這時的微生物的生存斗爭主要是與無機環(huán)境的斗爭。答案：C1.對細菌群體生長規(guī)律測定的正確的表述是（ ） A.在液體培養(yǎng)基上進行 B.至少接種一種細菌 C.接種一個細菌 D.及時補充消耗的營養(yǎng)物質 2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.培養(yǎng)細菌 B.培養(yǎng)真菌 C.使需要的微生物大量繁殖 D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀與其他微生物加以區(qū)別3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( ) A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素實踐訓練A CD4.下列說法不正確的是（ ） A.科學家從7080度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNA聚合酶 B.統(tǒng)計某一稀釋度的5個平板的菌落數(shù)依次為M1、M2、M3、M4、M5，以M3作為該樣品菌落數(shù)的估計值 C.設置對照實驗的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響，提高實驗結果的可信度 D.同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類最多。5.為培養(yǎng)和分離出酵母菌并淘汰雜菌，常在培養(yǎng)基中加入（） A.較多的氮源物質 B.較多的碳源物質 C.青霉素類藥物 D.高濃度食鹽BC例3（2005年江蘇）抗生素作為治療細菌感染的藥物，其高效性和巨大的經濟價值使抗生素工業(yè)經久不衰。其中青霉素的