型PCR熒光分析儀演示教學(xué)課件

1、1890型PCR熒光分析儀 介紹及應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR的應(yīng)用 臨床方面的應(yīng)用 疾病的臨床早期診斷 建立病原體病分子診斷標(biāo)準(zhǔn) 療效考評 指導(dǎo)制訂感染性疾病合理治療方案 了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況 醫(yī)院、血站及防疫站的確診 新藥研究中藥物的作用效果 研究Elisa方法的漏檢率 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進(jìn)行指導(dǎo) 遺傳病診斷中的應(yīng)用 等位基因檢測 多基因遺傳病的突變檢測 基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的應(yīng)用 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測 腫瘤標(biāo)志物（肽類激素和酶） 腫瘤耐藥基因（MDR） 何謂PCR ?聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain React

2、ion)簡稱，是一項(xiàng)在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 試劑的定量原理：Taqman水解探針定量Roche雜交探針定量分子信標(biāo)定量SYBR Green 染料定量雜交探針分子信標(biāo)熒光能量共振轉(zhuǎn)移Taqman探針 Taqman探針、雜交探針、分子信標(biāo)都是通過熒光能量共振轉(zhuǎn)移直接或間接的產(chǎn)生特定波長的熒光，使儀器能檢測到PCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基按互補(bǔ)配對原則（即腺嘌呤對胸腺 嘧啶，鳥嘌呤對胞嘧啶）組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶-聚合酶合成一小段引物（）結(jié)合到模板上，最 后，合成酶以這段引物為起點(diǎn)，合成

3、與模板配對的新鏈。即是在體外模擬復(fù)制的過程，它用加熱的辦法讓所研究的片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到模板的兩端，聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。 假定我們要研究的雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 在之前，我們首先人工合成兩段有堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別，以小 寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaac

4、ctat。 把這兩段引物和模板、聚合酶、底物（四種脫氧核苷）混合 在一起，我們就可以開始做了。 PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性”，把樣品加熱到攝氏度一到數(shù)分鐘，讓 模板變性變成單鏈。第二步叫“退火”，讓樣品的溫度下降到攝氏度一到數(shù)分鐘，引物就可以結(jié)合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到攝氏度

5、一到數(shù)分鐘，聚合酶就可以從引物開始用底物復(fù)制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 這樣經(jīng)過三步一個循環(huán)，一條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條在一個由計算機(jī)控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個循環(huán)，就可以把原來的樣品精確地擴(kuò)增了

6、的次方倍，而這只需要兩三個小時。影響PCR特異性的因素 退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de

7、7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150mol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。 擴(kuò)增反應(yīng)可以無窮進(jìn)行下去嗎？ 答：不可以。因?yàn)榻?jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴(kuò)增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進(jìn) 入平坡，進(jìn)入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達(dá)0.31pmol時，由于產(chǎn)物的堆積，使原 來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進(jìn)入平坡的原因有： 引物和dNTP等消耗完畢 Taq酶失活 底物過剩 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的競爭 退火時產(chǎn)物的單鏈自己締合 變性在高濃

8、度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用（焦磷酸化，雙鏈DNA）。 總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達(dá)到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。實(shí)時熒光定量PCR 的Ct值由圖我們也可以看出，在Ct值所在處重復(fù)性驚人的好。 Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。由于所設(shè)閾值都很低，所以Ct值分析實(shí)際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性 Ct值，C代表Cycle，t代表threshold。 由圖可以看到當(dāng)擴(kuò)增越靠后定量的重復(fù)性就越差。主要

9、是因?yàn)闊晒舛考夹g(shù)要求在低濃度壞境。因?yàn)闊晒鈾z測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因?yàn)榇罅康陌行蛄卸a(chǎn)生不可控的影響。 儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)縱坐標(biāo)代Ct值利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線1890型PC

10、R熒光分析儀的特點(diǎn) 高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)采用長壽命的LED激發(fā)光源可對PCR擴(kuò)增全過程進(jìn)行實(shí)時動態(tài)監(jiān)測無需開啟PCR反應(yīng)管，可避免在PCR期間及PCR之后產(chǎn)物污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在單一反應(yīng)中取得更多信息全中文界面，靈活的程序設(shè)定、全面的分析和報告功能，全部參數(shù)可儲存可打印多個或單個樣本報告儀器主要技術(shù)規(guī)格 樣本數(shù)： 32 反應(yīng)管（光學(xué)玻璃管）長： 35mm 容積（反應(yīng)體積） 10-20ul 溫度范圍： 40-98 溫度控制： 1/S-10/S 激發(fā)光波長： 470nm（LED） 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單

11、拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸入電源/功率： AC220V 50HZ/800VA儀器工作原理 （一） 儀器工作原理 （二） 圖一蓋中的加熱器在計算機(jī)控制下向熱室中交 替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風(fēng)扇電機(jī) 攪勻，由于空氣無有效質(zhì)量，熱室可以迅速達(dá)到 設(shè)置溫度，由此進(jìn)行PCR的溫度循環(huán)。32個樣品在周向馬達(dá)的帶動下逐一經(jīng)過信號采集的光學(xué)系 統(tǒng)，為采樣的準(zhǔn)確定位光學(xué)結(jié)構(gòu)由絲桿馬達(dá)進(jìn)行 微調(diào)。由長壽命的LED光源(470nm)激發(fā)毛細(xì) 管中的熒光，該熒光通過一組復(fù)合濾鏡和透鏡分別同時到3個接收器上(520nm,640nm,710nm)完成了儀器的實(shí)時采樣。 強(qiáng)大的軟件功能 參數(shù)設(shè)置功能

12、（包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、 升降溫速率、檢測通道選擇）樣本資料記錄功能文件運(yùn)行顯示功能（PCR熱循環(huán)數(shù)據(jù)顯示、熒 光檢測數(shù)據(jù)顯示）檢測數(shù)據(jù)分析功能分析結(jié)果輸出功能故障保護(hù)和報警功能先進(jìn)的光路系統(tǒng) 選用長壽命LED激發(fā),無需預(yù)熱，無需校正采用了先進(jìn)的非球面鏡設(shè)計，提升了儀器的光學(xué)性能，縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質(zhì)的濾光片，硬膜鍍膜技術(shù)，窄帶低背景高透過率不霉變實(shí)時三色熒光檢測，盡善盡美傳統(tǒng)96孔板和離心毛細(xì)管比較 毛細(xì)管 96孔板標(biāo)本量小，耗材成本稍高 標(biāo)本量大，耗材成本低由于離心，每個樣品孔間溫度 由于加熱模塊的邊緣效應(yīng)，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差異加熱介質(zhì)空氣與反應(yīng)體系無縫 96孔

13、板反應(yīng)面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故升降 速度慢 溫速度快 一個40個循環(huán)的實(shí)驗(yàn)只需30-45 一個40個循環(huán)的實(shí)驗(yàn)需要2小時 分鐘 光源與檢測器對每個樣品來說 每個樣品孔距離光源和檢測器 是等距離的，減少了系統(tǒng)誤 光程不同，可能對結(jié)果產(chǎn)生 差 影響 由于定量PCR必須借助于樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比實(shí)現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)的樣品架很好地解決了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品之間條件的一致性，避免了微小差別被指數(shù)級發(fā)大。優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學(xué)范圍 儀器能在7個數(shù)量級的范圍內(nèi)得到非常好的線性結(jié)果。相關(guān)系數(shù)（r）可達(dá)3個9。且有優(yōu)異的靈敏度和極佳的重復(fù)性 友好方便的操作界面 方便

14、的樣品編輯界面 方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面一目了然的運(yùn)行界面 時實(shí)反應(yīng)了當(dāng)前樣品室的溫度曲線。 指示當(dāng)前溫度曲線位置的溫度，循環(huán)數(shù)及第幾程序段。 時實(shí)反應(yīng)了當(dāng)前的熒光信號 方便的數(shù)據(jù)處理界面兩種分析方法：方差法最小二乘法 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合 ：自動標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合自動計算相關(guān)系數(shù) 個人信息輸入和打印報告格式病人檢驗(yàn)報告綜合檢測報告1890型PCR與國內(nèi)外儀器比較型號1890Light- CycleMJ Opticon2 Bio-Rad iCyclerRotor- GeneLine-GeneslanFTC-2000 種類國產(chǎn)進(jìn)口進(jìn)口進(jìn)口進(jìn)口國產(chǎn)國產(chǎn)國產(chǎn)加熱方式 空氣加熱 空氣加熱 半導(dǎo)體 半導(dǎo)體 空氣加熱 半導(dǎo)體 半導(dǎo)體 半導(dǎo)體 激發(fā)光源 LED冷光源LED冷光源 LED冷光源 鹵鎢燈光源 鹵鎢燈光源 鹵鎢燈光源 LED冷光源鹵鎢燈光源 反應(yīng)管 石英玻璃毛細(xì)管10-20ul 石英玻璃毛細(xì)管10-20ul 特殊平板樣品板和條形管25-50ul 薄