第八章抗生素類藥物分析

1、第八章抗生素類藥物分析第一節(jié)概述抗生素的來源:多數(shù)抗生素生物合成(發(fā)酵)少數(shù)化學(xué)合成或者半合成1、抗生素類藥物一般檢查項目： 鑒別試驗: 用化學(xué)法、物理化學(xué)法以 及生物學(xué)法來確認(rèn)是哪種抗生素 毒性試驗: 控制藥品中的毒性物質(zhì) 無菌試驗: 檢查藥品中有無雜菌污染 熱源試驗: 控制藥品中的致熱物質(zhì) 水分測定: 控制水分含量 溶液澄明度檢查: 檢查不溶性物質(zhì) 溶液pH試驗: 測定pH 降壓試驗: 檢查有降壓作用的雜質(zhì) 效價測定: 有效成分測定 生物學(xué)法 物理化學(xué)法目前各國藥典仍以生物學(xué)測定法為主。2、效價測定抗生素的效價測定方法有: (1) 生物學(xué)測定法 以抗生素抑制細(xì)菌生長能力或殺菌能力作為衡量效

2、價標(biāo)準(zhǔn)優(yōu)點：原理恰好與臨床要求一致，更能 夠確定抗生素效價。靈敏度高，需要樣品量較小既適用較純精制品,也適用于純度 較差的產(chǎn)品 已知或新發(fā)現(xiàn)抗生素都能應(yīng)用 同一類型的抗生素,不需要分離, 可一次測定它們的總效價。缺點 操作步驟多，測定時間較長 誤差較大(2) 物理化學(xué)測定法 根據(jù)抗生素化學(xué)結(jié)構(gòu)利用其特有的化學(xué)或物理化學(xué)性質(zhì)及反應(yīng)進行。 優(yōu)點 操作簡單、省時、方法準(zhǔn)確 具有較高的專屬性 缺點: 對于結(jié)構(gòu)相似的抗生素，測定結(jié)果往往只能代表總的含量，并不一定能代表某一抗生素的生物效價，只有當(dāng)用物理化學(xué)法測定結(jié)果與用生物學(xué)法測定效價相一致時，才能用于效價測定。 3、本章內(nèi)容 -內(nèi)酰胺類: 青霉素類頭孢

3、菌素類氨基糖苷類:鏈霉素慶大霉素四環(huán)素類:第二節(jié)-內(nèi)酰胺類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1、化學(xué)結(jié)構(gòu) 青霉素類結(jié)構(gòu) 青霉素類: 母核: 由-內(nèi)酰胺環(huán)和氫化噻唑環(huán) 組成的雙雜環(huán)。 6-APA 6-Aminopenicillanic Acid 側(cè)鏈 : RCO- 芐青霉素（青霉素G）氨芐青霉素RR 頭孢菌素類結(jié)構(gòu)母核: -內(nèi)酰胺環(huán)和二氫噻嗪環(huán)組成的雙雜環(huán)。 （7-ACA）7-Aminocephalospoanic Acid側(cè)鏈RCO- 2、性質(zhì) 青霉素類和頭孢菌素類結(jié)構(gòu)共同特點具有-內(nèi)酰胺環(huán)。 酸性 有羧基，具有酸性 pKa值在之間 與堿成鹽 如：青霉素G鈉、青霉素G鉀等 旋光性 有手性碳原子，

4、具有旋光性3個手性碳原子2個手性碳原子 紫外吸收 青霉素類母核沒有共軛系統(tǒng)，沒有紫外吸收 但青霉素類藥物在弱酸性下水解，可以產(chǎn)生具 有共軛雙鍵的青霉烯酸，在紫外光區(qū)有吸收。 側(cè)鏈中有苯環(huán)等取代基的藥物，在紫外光區(qū)也 有吸收。像芐青霉素。頭孢菌素類分子中有共軛體系（OCNCC）在260nm處有最大吸收。 -內(nèi)酰胺環(huán)的不穩(wěn)定性 干燥、純凈青霉素類抗生素穩(wěn)定，其水溶液很不穩(wěn)定.不穩(wěn)定的部分是-內(nèi)酰胺環(huán) -內(nèi)酰胺環(huán)在酸、堿、青霉素酶、某些金屬離子的作用下，可使-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)或發(fā)生分子重排，而失去抗菌作用。 二、鑒別試驗1、羥肟酸鐵反應(yīng) 2、青霉素的各種鹽的鑒別 3、硫酸及硫酸-甲醛反應(yīng) 4、硫酸-變色

5、酸反應(yīng) 5、紫外分光光度法及紅外分光光度法 三、含量測定 原理 青霉素在稀堿性條件下,水解生成青霉 噻唑酸衍生物,此步水解定量完成,可用 于含量測定。1、酸堿滴定法 方法() 水解前：將樣品溶液的pH調(diào)至8（加NaOH液至顯粉紅色）() 水解：加入定過量的標(biāo)準(zhǔn)堿溶液，水浴加熱使水解() 剩余滴定：水解后，過量的堿用酸標(biāo)準(zhǔn)液回滴定(至pH8，粉紅色無色)以“青霉素鈉”為例 ChP 90（2）空白試驗： 不加樣品，其余操作同上（1）主試驗 討論 () 溶劑 新沸過且用0.01M NaOH液中和的水 目的：消除水中酸性物質(zhì)影響（如CO2） () 滴定前中和 消除能消耗堿的雜質(zhì)影響（如一些酯 類雜質(zhì)）

6、() 空白試驗?zāi)康? 在加熱水解過程中，有可能會吸收CO2，對測定有影響，所以要做空白試驗校正。() 本法供試品用量較大，多用于效價高的供試品的測定2、碘量法 原理： 青霉素或頭孢菌素分子不消耗碘，其 在堿性條件下水解生成的降解產(chǎn)物 青霉噻唑酸可與碘作用，根據(jù)消耗的 碘量可以計算青霉素的含量。理論上:1mol青霉素8mol I原子;實際上: 1mol青霉素89mol I原子溫度，放置時間，pH，濃度，碘過量程度，雜質(zhì)多少等影響因素。 方法： 以“青霉素鈉”為例，ChP 二部（1）主試驗：（2）空白試驗： 討論：（1）溶液的pH值在左右 （2）溫度：2426（3）放置時間：1520（4）空白試驗

7、：做法與一般空白不同（加樣品,不加堿水解,其他操作同樣品）目的：消除樣品中預(yù)先存在的降解產(chǎn)物（青霉噻唑酸）及其他耗碘雜質(zhì)的影響（5）靈敏度高：因為1:8，所以供試液濃 度在10100g/ml即可測定3、汞量法 原理： 青霉素分子不與汞鹽反應(yīng)，但其降產(chǎn)物青霉噻唑酸及青酶胺可與汞鹽反應(yīng)，根據(jù)消耗的汞鹽量計算青霉素的含量。 青霉素分子中的氫化噻唑環(huán)含有一個硫原子，開環(huán)后形成巰基（SH），可用汞量法測定 4、可見紫外分光光度法 原理： 青霉素在弱酸性下（pH=4），不完全水解，產(chǎn)生青酶烯酸，在320360nm處有強吸收。 青霉烯酸在酸性溶液中極不穩(wěn)定，有兩種改進方法。（1）銅鹽法（JP13）： 銅離子

8、與青酶烯酸形成穩(wěn)定的螯合物，在320nm處有最大吸收。 對照品法定量。 用于氨芐青霉素的含量測定。（2）硫醇汞鹽法（BP1993,ChP95） 青霉素在咪唑的催化下，與氯化高汞定量地反應(yīng)生成青酶烯酸硫醇汞鹽，在324345nm下有最大吸收。 對照品同樣操作 用于氨芐西林鈉的含量測定 作用： 咪唑:催化劑,使水解產(chǎn)率高,生成產(chǎn)物穩(wěn)定 醋酐的乙腈溶液:乙酰化氨芐青霉素側(cè)鏈 NH2,使max=325nm 硼酸緩沖液:調(diào)pH值 HgCl2:微量Hg2+催化劑,促進反應(yīng),重現(xiàn)性好。 5、HPLC 以“頭孢唑林鈉”為例色譜條件： 柱：ODS 流動相：磷酸二氫鉀、枸櫞酸溶液 乙腈（88：12） 檢測波長：2

9、54nm 內(nèi)標(biāo)物：乙酰苯胺第二節(jié) 氨基糖甙類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)（一）鏈霉素 1、結(jié)構(gòu) 鏈霉胍N-甲基-L-葡萄糖胺鏈霉糖 2、性質(zhì)：（1）三個堿性中心： 2個強堿性胍基（） 1個甲氨基（） 可與礦酸或有機酸成鹽（2）鏈霉素在酸性或堿性條件下可變?yōu)殒溍闺液玩溍闺p糖胺（二）慶大霉素1、結(jié)構(gòu)紫素胺三個類似結(jié)構(gòu)的C1、C2、C1a組成的混合物C1：R1=R2=CH3 ;C2：R1=CH3,R2=H ;C1a：R1=R2=H,R3=HN-甲基-3-去氧-4-甲基戊糖胺脫氧鏈霉胺 2、性質(zhì)：（1）五個堿性中心PKa8 可與礦酸或有機酸成鹽（2）無UV吸收，（因為無共軛系統(tǒng)）二、鑒別試驗（一）

10、共同反應(yīng) 1、茚三酮反應(yīng) 氨基糖苷結(jié)構(gòu)，具羥基胺類和- 氨基酸的性質(zhì)，可與茚三酮縮合成藍(lán)紫色縮合物。 2. N-甲基葡萄糖胺反應(yīng): 水解產(chǎn)物N-甲基葡萄糖胺特有反應(yīng)（二）鏈霉素的特征反應(yīng)1、麥芽酚反應(yīng)： 鏈霉素在堿性溶液中，鏈酶糖經(jīng)分子重排，消除N甲基葡萄糖胺及鏈酶胍，生成麥牙酚，麥牙酚可與鐵離子在微酸性溶液中形成紫紅色配位化合物。 2、坂口反應(yīng)： 本品水溶液，加氫氧化鈉試液，水解為鏈酶胍，與8羥基喹啉作用，再加次溴酸鈉試液，生成橙紅色化合物。第三節(jié) 四環(huán)素類抗生素的分析一、化學(xué)結(jié)構(gòu) 四駢苯或萘駢萘的衍生物，氫化駢四苯環(huán)四個取代基RR1R2R3四環(huán)素(TC)HOHCH3H金霉素(CTC)ClO

11、HCH3H土霉素(OTC)HOHCH3OH四個環(huán)A環(huán)B環(huán)C環(huán)D環(huán)二甲氨基N(CH3)2酚羥基酰胺基CONH2酮基與烯醇基共軛酮基與烯醇基共軛雙鍵系統(tǒng)雙鍵系統(tǒng) 二、性質(zhì) 1、呈兩性： 弱酸性酚羥基、烯醇型羥基 弱堿性二甲胺基 所以遇酸或堿均可成鹽2、含結(jié)晶水四環(huán)素：6個結(jié)晶水占19.6%土霉素：2個結(jié)晶水占7.5% 加熱時可失去結(jié)晶水,當(dāng)含水量低于19.6%的四環(huán)素和低于7.5%的土霉素,置于空氣中要吸收水分。 3溶解度： 游離體在水中溶解度很小，溶解度與pH有關(guān)。難溶于水, pH低于4或高于8時,可以得到高濃度的水溶液.4對氧化劑不穩(wěn)定： 對各種氧化劑都不穩(wěn)定，且堿性水溶液特別易氧化，顏色很快

12、變深形成色素，干燥品較穩(wěn)定，但貯存時遇光可使顏色變深（因空氣氧化）。 三化學(xué)反應(yīng)：1. 差向異構(gòu)化反應(yīng)：（差向四環(huán)素） 弱酸性（）溶液中，A環(huán)上手性C4構(gòu)型的改變，發(fā)生差向異構(gòu)化，形成差向四環(huán)素。 差向化速度的影響因素：pH9時，差向化速度很小。高價的無機酸或有機酸根存在或陰離子濃度增加，差向化速度增大。四環(huán)素和金霉素很易差向異構(gòu)化，形成4-差向四環(huán)素、4-差向金霉素，他們的抗菌性極弱或完全消失。土霉素和強力霉素由于C5上的羥基和二甲胺基形成氫鍵，不易發(fā)生差向異構(gòu)化。 2. 酸性下降解反應(yīng):（脫水四環(huán)素類）在酸性（pH2）時，C環(huán)上C6上羥基易脫落與C5a上的氫生成水，在C6-C5a間形成雙鍵

13、。經(jīng)重排使C環(huán)芳構(gòu)化，生成脫水四環(huán)素類四環(huán)素、土霉素和金霉素可發(fā)生脫水； 3. 堿性下降解反應(yīng)：（異四環(huán)素類） 在堿性下，C環(huán)打開，生成無活性的具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的異四環(huán)素；若強堿性下加熱，可定量地轉(zhuǎn)化為異四環(huán)素，后者具有強烈熒光，可熒光法測定。 4. 與金屬離子絡(luò)合： 能與許多金屬離子（鋯Zr4+,鈾U6+,鋅Zn2+,銅Cu2+,鋁Al3+,鎂Mg2+，鈰Ce4+,鈷Co2+）形成有色絡(luò)合物。 四鑒別 1. 與濃硫酸反應(yīng)：四環(huán)素類 + 濃H2SO4 深紫色（四環(huán)素） 藍(lán)色,迅速轉(zhuǎn)變?yōu)榫G（金霉素） 朱紅色（土霉素）2. FeCl3反應(yīng)：四環(huán)素類酚羥基 + FeCl3 紅棕色（四環(huán)素） 深褐色（金霉素） 橙褐色（土霉素）3 熒光反應(yīng)： 四