離子交換色譜課件

1、第 四節(jié) 離子交換色譜Lujiang YuanSchool of Pharmaceutical ScienceSouthwest University離子交換色譜的發(fā)展1903年，泡沸石（天然硅鋁酸鹽 Na2A12Si4O12nH2O)來軟化硬水。 Na2Z + Ca2+ CaZ + 2Na+1933年，合成了酚醛類型的陰陽離子樹脂。1945年，美國(guó)人，D.Alelio, 聚苯乙烯型強(qiáng)酸性陽離子樹脂，聚丙稀酸型陽離子交換樹脂的合成。此外，纖維素和多糖上引入交換基形成的離子交換劑。離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換層析的基本操作離子交換介質(zhì)的選擇原則離子交換層析的基

2、本原理 離子交換層析是以離子交換劑為固定相，以含特定離子的溶液為流動(dòng)相，利用離子交換劑上的可交換離子與溶液中離子發(fā)生交換作用，由于不同的離子交換能力不一樣，待分離的各種離子在樹脂柱中隨流動(dòng)相的移動(dòng)速度也不一樣，而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的技術(shù)。離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換劑亦稱離子交換介質(zhì)，通常是一種不溶性高分子化合物如樹脂，纖維素，葡聚糖，醇脂糖等； 含可交換離子 洗脫的可能性取決于交換反應(yīng)平衡常數(shù) 吸附的蛋白質(zhì)可以通過改變pH值，使蛋白 質(zhì)分子電性發(fā)生改變，而洗脫下來。 不同蛋白質(zhì)形成離子鍵數(shù)目有差異的，及親和力不同。離子交換樹脂的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)離子交換樹脂是具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的復(fù)雜的有機(jī)高分子

3、聚合物。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架部分一段很穩(wěn)定，不溶于酸、堿和一般溶劑。在網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的骨架上有許多可被交換的活性基團(tuán)。根據(jù)活性基團(tuán)的不同、離子交換樹脂可分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂兩大類。合成：高分子化學(xué)加聚反應(yīng)，先合成骨架，然后在骨架上添加功能基團(tuán)。如合成過程中加入致孔劑，可得大孔離子交換樹脂，否為凝膠型。在高分子離子交換樹脂中，常用的為交聯(lián)的聚苯乙烯骨架上連接不同得功能團(tuán)（可交換基團(tuán)）：離子交換劑的分類陽離子交換劑：強(qiáng)酸型和弱酸型 可電離的基團(tuán) 磺酸基（-SO3H） 磷酸基（-PO3H2） 羧酸基（-COOH） 酚羥基（-OH）陰離子交換劑：強(qiáng)堿型和弱堿型 可電離的基團(tuán) 伯胺基（-NH2） 仲胺

4、基（-NHCH3 ） 叔胺基（-N(CH3)2） 季胺基（-N+(CH3) 3 ）一、陽離子交換樹脂1 強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂 陽離子交換樹脂具有酸性基團(tuán)，如應(yīng)用最廣泛的強(qiáng)酸性磺酸型聚苯乙烯樹脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，經(jīng)濃硫酸磺化而制得的聚合物。 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，510年，耐強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化劑和還原劑,不溶于酸、堿及常見的有機(jī)溶劑。耐熱超過100C。2 弱酸型子交換樹脂甲基丙烯酸和二乙烯苯基聚合，功能基羧基(-COOH)。 根據(jù)活性基團(tuán)離解出H+能力的大小不同，陽離子交換樹脂分為強(qiáng)酸性和弱酸性兩種。例如含-SO3的為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，常用R-SO3H表示(R表示樹脂的骨架)，含-COOH

5、和-OH的弱酸性陽離子交換樹脂，分別用R-COOH和R-OH表示。 強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂應(yīng)用較廣泛，弱酸性陽離子交換樹脂的H+不易電離，所以在酸性溶液中不能應(yīng)用，但它的選擇性較高而且易于洗脫。二、陰離子交換樹脂與陽離子交換樹脂具有同樣的有機(jī)骨架，只是所聯(lián)的活性基團(tuán)為堿性基團(tuán)。季胺(-N(CH3)3) H+不易電離，強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂；伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的樹脂為弱堿性陰離子交換樹脂。 水化: R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH 和R-N(CH3)3OH ,OH-可被陰離子交換和洗脫。, 陰離子交換樹脂的化學(xué)穩(wěn)定性及

6、耐熱性能都不如陽離子交換樹脂穩(wěn)定。交聯(lián)度樹脂中所合交聯(lián)劑的百分率稱為重量交聯(lián)度。 例如強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂:苯乙烯聚合而成為長(zhǎng)的鏈狀分子,二乙烯苯把各鏈狀分子聯(lián)成立體型的網(wǎng)狀體。如果二乙烯苯在原料總量中占10%。則稱該樹脂的交聯(lián)度為10。交聯(lián)度 樹脂的交聯(lián)度越大，則網(wǎng)眼越小，交換時(shí)體積大的離子進(jìn)入樹脂便受到限制。但提高了交換的選擇性：另外，交聯(lián)度大時(shí)，形成的樹脂結(jié)構(gòu)緊密，機(jī)械強(qiáng)度高。但是如果交聯(lián)度過大則對(duì)水的膨脹性能差(一般要求1克干樹脂在水中能膨脹至1.5-2cm3為宜)，交換反應(yīng)的速度慢，因此要求樹脂的交聯(lián)度一般為4-14。交換容量每克干樹脂所含活性基團(tuán)的物質(zhì)的量，而實(shí)際交換容量是指在實(shí)驗(yàn)

7、條件下，每克干樹脂能交換離子的物質(zhì)的量。 稱取干樹脂1克，置于250mL錐形瓶中、準(zhǔn)確加入0.1mol/LNaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液100mL,振蕩后放置過夜，用移濃管吸取上層清液25mL，加酚酞指示劑1滴，用0.1mol/L標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液滴定至紅色消失，設(shè)用去標(biāo)準(zhǔn)HCl溶液14mL，樹脂的交換容量可以計(jì)算為5.6 mmol/g。離子交換親和力 離子交換反應(yīng)和其他化學(xué)反應(yīng)一樣，完全服從質(zhì)量作用定律。 樹脂對(duì)離子親合力的大小用平衡常數(shù)來代表，它與離子的水合離子半徑大小和帶電荷的多少有關(guān)。強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范

8、圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱常用的離子交換劑離子交換樹脂：離子交換纖維素：離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物，具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積，大分子可以自由通過，因而對(duì)生物大分子（如蛋白質(zhì)）的交換容量比離子交換樹脂大。陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素（CM纖維素）等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素（DEAE纖維素）離子交換纖維素 離子交換纖維素 離子交換纖維素 常用的離子交換劑離子交換葡聚糖： 離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的

9、具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物（Sephadex G）Sephadex的優(yōu)點(diǎn)如下： 親水性強(qiáng)、不會(huì)引起生物分子的變性和失活，母鏈對(duì)蛋白質(zhì)、核酸及其它生物分子的非特異性吸附能力小 電離基團(tuán)在母體上取代程度高，交換容量大，裝柱方便，流速快既有離子交換作用，又有分子篩效應(yīng) 因而Sephadex是一類廣泛應(yīng)用的色譜分離介質(zhì)在pH7時(shí)可耐120的高熱 2105的蛋白質(zhì) 適用于 常用的離子交換劑 常用的離子交換葡聚糖包括： 陽離子交換劑CM-Sephadex C-25，CM-Sephadex C-50Sephadex C-25，Sephadex C-50陰離子交換劑DEAE-Sep

10、hadex A-25，DEAE- Sephadex A-50QAE-Sephadex A-25，QAE-Sephadex A-50 常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖： 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的Sepharose CL-6B DEAE-Sepharose（陰離子型）和CM-Sepharose（陽離子型）的離子交換介質(zhì)具有硬度大、性質(zhì)穩(wěn)定，流速好，分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。尤其是介質(zhì)受pH和離子強(qiáng)度的影響所引起的膨脹和收縮效應(yīng)較小，因此具有穩(wěn)定的外形體積對(duì)pH及溫度的變化均較穩(wěn)定，可在pH310和070范圍內(nèi)使用，改變離子強(qiáng)度或pH時(shí)，床體積變化不大。 二、離子交換樹脂的選擇一般原則：酸性物

11、質(zhì)用陰離子交換劑分離堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離反離子 :強(qiáng)酸、堿性用H+，OH-,弱用Na+ Cl-氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)，可根據(jù)其pI值及離子化曲線來選擇?；钚苑肿樱河H水性基質(zhì)的交換樹脂具體：種類，離子形式、交換量、顏色、交聯(lián)度、理化性質(zhì)等。被分離物質(zhì)所帶的電荷性質(zhì) 離子交換介質(zhì)的選擇原則12346789105pH+-蛋白質(zhì)凈電荷等電點(diǎn)吸附陰離子交換劑吸附陽離子交換劑pH pI（-）對(duì)pI=5的某酸性蛋白質(zhì)在pH5.5-9.0的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陰離子時(shí)，應(yīng)首選DEAE纖維素；在pH3.5-4.5的范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為陽離子時(shí)，應(yīng)首選CM纖維素1 種類選定中性鹽體系： 陰陽離子的脫

12、除用強(qiáng)酸強(qiáng)堿樹脂 微量雜質(zhì)的脫除也要強(qiáng)型樹脂強(qiáng)堿樹脂分有I 和 II 型：I 型堿型強(qiáng)于II I型 ： 易與硅酸等弱酸作用，再生差； II型： 不與比乙酸更弱的酸作用； 交換能力強(qiáng)的離子：用弱堿性或弱酸性離子交換樹脂； 如一般有機(jī)堿交換能力都強(qiáng)，多價(jià)金屬離子、生物堿、鏈霉素等都用弱酸性離子交換樹脂，既容易吸附又容易洗脫。中性或堿性體系中：多價(jià)金屬離子與弱酸陽離子交換強(qiáng)，易洗脫，與強(qiáng)酸陽離子交換弱；弱酸通常不用弱堿樹脂，但用強(qiáng)堿樹脂； 弱堿體系中：陽離子交換用弱酸陽離子樹脂； 弱酸體系中：弱酸中的陰離子用弱堿陰離子樹脂；2 樹脂形式的選擇 中性鹽溶液，交換后生成鹽： 鹽型弱酸弱堿樹脂； 當(dāng)量相當(dāng)

13、的 游離、酸堿混合； 酸、堿條件下的離子： 游離堿或酸樹脂；鹽中除酸、堿： 弱型樹脂（強(qiáng)型會(huì)交換鹽）；3、顆粒、交聯(lián)度和穩(wěn)定性A 顏色：淺色便于看色帶，使用后色深、雜質(zhì)多色變深。B 顆粒：2080目，200400目。C 交聯(lián)度：聚苯乙烯樹脂交聯(lián)度120，常用8，交聯(lián)度高，選擇性好，交換速度小?？锥扰c交聯(lián)度關(guān)系密切。D密度：0.4-0.8g/mlE穩(wěn)定性：一般而言，聚苯乙烯樹脂穩(wěn)定 陽比陰穩(wěn)定 鹽比酸堿穩(wěn)定離子交換劑的分類強(qiáng)離子交換劑的電離率基本不受pH值影響，離子交換作用的pH范圍寬弱離子交換劑的電離率受pH影響很大，離子交換作用的pH范圍小弱酸性陽離子交換劑在pH值降低時(shí)，其電離率逐漸降低，

14、離子交換能力逐漸減弱弱堿性陰離子交換劑在pH值升高時(shí)，其電離率逐漸降低，離子交換能力逐漸減弱三、離子交換柱的操作以強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂分離K+和Na+為例交換 R- H+ + K+ = R- K+ + H+R- H+ + Na+ = R- Na+ + H+洗脫 R- K+ H+=R- H+ + K+ R- Na+ + H+ =R- H+ + Na+ 1 樹脂的處理A 過篩分：得均一顆粒，也可溶脹后篩分； 商品樹脂2080目，可將其干燥、 粉碎 、過篩或沉降、浮選處理。 B 凈化處理：乙醇水4mol/L HCl or NaOH-蒸餾水到（pH4-5 or 7-8);強(qiáng)酸陽離子樹脂 其商品多為Na

15、型。用4倍體積56鹽酸攪拌5h, 水洗到中性。然后4倍體積56Na or NaCl交換，水洗到無Na+。必要時(shí)可重復(fù)12次。 如需使用H，接上步驟用6倍體積56HCl交換，水洗到中性。酸堿處理的次序決定了離子交換劑攜帶反離子的類型。 強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂商品型一般為Cl型。 4倍體積56NaOH, 蒸餾水洗到中性。 4倍體積56HCl,蒸餾水洗到中性。 6倍體積56NaOH, 蒸餾水洗到中性。 OH型樹脂最好現(xiàn)制現(xiàn)用，它吸附空氣中CO2。弱酸型陽離子交換樹脂商品樹脂一般為Na型。 處理可參照強(qiáng)酸型陽離子交換樹脂。弱堿型陰離子交換樹脂處理參照強(qiáng)堿型陰離子交換樹脂法。 2 柱的操作裝柱：樹脂高度一

16、般約為柱高的90%。為防止加試液時(shí)樹脂被沖起，在柱的上端亦應(yīng)鋪一層玻璃纖維（或隔板）。裝好后，再用蒸餾水洗滌（不少于2倍柱體積），備用。上樣：陽離子樹脂可達(dá)交換容量的50，陰離子一般為10-20%。小于5床體積（1分析）。洗脫：用蒸餾水洗去多余的（沒吸附的）樣品，然后用洗脫液（緩沖液，pH,離子強(qiáng)度）淋洗，方法有等度，梯度等。平衡 柱子裝好后，要用所需的緩沖液（有一定的pH和離子強(qiáng)度）平衡柱子。用恒流泵在恒定壓力下走柱子（平衡與洗脫時(shí)的壓力盡可能保持相同）。離子強(qiáng)度和pH的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。使各個(gè)待分離物質(zhì)與離子交換劑有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合 。有時(shí)柱子平衡好后，還要進(jìn)行轉(zhuǎn)型處理

17、。 補(bǔ)充離子交換層析的基本操作層析柱平衡平衡緩沖液的用量至少為柱體積的 2 倍平衡緩沖液的流速可略高于正常操作流速平衡終點(diǎn)以流出液的離子濃度、導(dǎo)電性、pH值與緩沖液一致為準(zhǔn)，其中pH值最重要 補(bǔ)充 交換 將試液加到交換柱上，用活塞控制一定的流速進(jìn)行交換。經(jīng)過一段時(shí)間之后，上層樹脂全部被交換、下層未被交換，中間則部分被交換，這一段稱為“交界層”。隨著交換的進(jìn)行，交界層逐漸下移，至流出液中開始出現(xiàn)交換離子時(shí)，稱為始漏點(diǎn)(亦稱泄漏點(diǎn)或突破點(diǎn))，此時(shí)交換柱上被交換離子的物質(zhì)的量數(shù)稱為始漏量。在到達(dá)始漏點(diǎn)時(shí)，交界層的下端剛到達(dá)交換柱的底部，而交換層中尚有未被交換的樹脂存在，所以始漏量總是小于總交換量。補(bǔ)

18、充 洗脫 當(dāng)交換完畢之后，一般用蒸餾水洗去殘存溶液，然后用適當(dāng)?shù)南疵撘哼M(jìn)行洗脫。在洗脫過程中、上層被交換的離子先被洗脫下來，經(jīng)過下層未被交換的樹脂時(shí)，又可以再度被交換。因此最初洗脫液中被交換離子的濃度等于零，隨著洗脫的進(jìn)行，洗出液離子濃度逐漸增大，達(dá)到最大值之后又逐漸減小，至完全洗脫之后，被洗出之離子濃度又等于零。 對(duì)于陽離子交換樹脂常采用HCl溶液作為洗脫液，經(jīng)過洗脫之后樹脂轉(zhuǎn)為氫型；陰離子交換樹脂常采用NaCl或NaOH溶液作為洗脫液，經(jīng)過洗脫之后，樹脂轉(zhuǎn)為氯型或氫氧型。因此洗脫之后的樹脂已得到再生，用蒸餾水洗滌干凈即可再次使用。補(bǔ)充離子交換層析的基本操作樣品洗脫恒定洗脫階段洗脫梯度洗脫1

19、02030405060708090離子強(qiáng)度pH值CC2（C2C1）（1V）A2/A1A1 C1 V為流出體積對(duì)總體積之比 A2 C2 當(dāng)A1A2時(shí)為線性梯度，當(dāng)A1A2時(shí)為凹形梯度，A1A2時(shí)為凸形梯度。 洗脫速度 洗脫速度通常要保持恒定 洗脫速度慢比快的分辨率要好，但峰過寬洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度 產(chǎn)品的濃縮、脫鹽 離子交換層析得到的樣品往往鹽濃度較高，而且體積較大，樣品濃度較低。所以一般離子交換層析得到的樣品要進(jìn)行濃縮、脫鹽處理。 3 再生樹 脂要求離子型式再生劑強(qiáng) 酸H+Na+HClNaCl弱 酸H+Na+HClNaCl強(qiáng) 堿OH-NaOH弱 堿OH-Cl-NaOHHCl若有脂溶

20、性物質(zhì)則可用非離子型去污劑洗柱后再生，也可用乙醇洗滌，其順序?yàn)椋?.5mol/L NaOH-水-乙醇-水-20NaOH-水。保存離子交換劑時(shí)要加防腐劑。 陰離子交換劑: 0.002氯已定（洗必泰）， 陽離子交換劑: 乙基硫柳汞（0.005）。 有些產(chǎn)品用0.02疊氮鈉。影響離子交換的主要因素流動(dòng)相的酸度：離子交換樹脂就是固體酸堿，對(duì)于強(qiáng)型而言pH影響不大，弱型則顯著。 強(qiáng)酸型陽離子，pH2 弱酸型陽離子，pH6 強(qiáng)堿型陰離子， pH12 弱堿型陰離子， pH7樣品濃度： 濃度高樹脂的解離減??； 影響吸附順序及選擇性； 改變樹脂表面結(jié)構(gòu)，影響離子 進(jìn)入。溫度：對(duì)稀溶液的交換影響不大; 溶液濃度高時(shí)，溫度升高，易水合 的離子易吸附； 對(duì)弱堿、弱酸，溫度升高，吸附速 加快，但溫度太高會(huì)破壞樹脂；溶劑：一般情況在水溶液中進(jìn)行，可加入某些有極性機(jī)溶劑來改變選擇性，但必須特別注意，這可能會(huì)使某些離子的交換無法進(jìn)行。四 離子色譜的應(yīng)用1 純水的制備氫型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，除去各種陽離子 2R-SO3H+Ca2+(R-SO3)2Ca+2H+氫氧型強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，除去各種陰離子。 RN(CH3)3OH+C1-RN(CH3)3Cl+OH-去離子水裝置示意水質(zhì)檢測(cè)化學(xué)法：pH值 離子（Cl,Fe, Ca Mg,硫酸根等） 可溶性硅，氧化物 不揮發(fā)物物理法：測(cè)定電阻率 超