建立全腦缺血再灌注動物模型的實驗研究進展

1、1建立全腦缺血再灌 動物模型的實驗研 究進展建立全腦缺血再灌注動物模型的實驗研究進展作者：武 釗1,劉佩儀1,文銳玲1,林梓豪1,黎允詩1,黃偉青2,歐陽斌2作者單位：（1.廣州醫(yī)學院檢驗系，廣東 廣州 510182;2.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120）【關鍵詞】全腦缺血再灌注動物模型實驗研究進展心臟驟停（CA）是急診醫(yī)學常見的急癥之一，因其居高不下的致死率及致殘率給社會和 家庭造成嚴重威脅，所以心肺腦復蘇是現(xiàn)代醫(yī)學研究的熱點課題。心搏驟停是指心跳及呼 吸突然停止，血液循環(huán)終止。由于腦細胞對缺氧十分敏感，循環(huán)停止 46 min腦組織即可 出現(xiàn)不可逆性損害1。面對突如其來的心臟

2、驟停，目前最有效的治療方法是心肺復蘇。但 是即使復蘇后，心臟恢復了搏動，但腦功能的恢復是心肺復蘇成功的關鍵。一般心臟停止 搏動，腦缺血、缺氧立即發(fā)生，如超過 46 min就可以出現(xiàn)不可逆的大腦損害。心臟停搏 時間長，如8 min以上，大腦功能很難恢復，成功率極小。有學者研究認為，心臟停搏 后，約50%左右患者死于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害，即腦死亡。即使心、肺復蘇成功，生命保 留，仍約有20%50%左右存在著不同程度的腦功能障礙，成為植物狀態(tài)（植物人）或癡殘等2。在成功進行心月復蘇后有 20%40%的患者遺留下永久性神經(jīng)損害 3。鑒于腦保護和 腦復蘇的重要性，近年來對缺血性腦損傷的機制進行了大量的研究，

3、腦是一個血流量大、 代謝旺盛的器官，其功能幾乎全靠葡萄糖的氧化代謝。心臟驟停后引起的腦損害的病理生 理主要是缺血缺氧性腦損傷以及自主循環(huán)恢復后的大腦缺血再灌注損傷，其中涉及興奮性 氨基酸的神經(jīng)毒性、鈣離子穩(wěn)態(tài)失調、神經(jīng)元凋亡等機制4。所以心肺復蘇的最終目的是腦復蘇。大量研究旨在尋找可減輕或預防腦缺血再灌注損傷的方法或藥物，并且已經(jīng)在動物模 型上獲得一定成功，但是這些方法和藥物很少能成功用于臨床。缺血預處理對心臟和神經(jīng) 系統(tǒng)缺血再灌注損傷具有明顯的保護作用，但是在臨床實踐中預處理只適用于缺血再灌注 可預期的情況。盡快恢復灌注是減輕缺血導致的損傷和行為障礙的最有效方法，然而再灌 注也可能加重損傷。

4、在再灌注早期，大量活性氧自由基的產(chǎn)生和鈣超載導致了缺血再灌注 損傷。所以近年來圍繞心肺腦復蘇的保護機制及其方法成為專家學者們研究的熱門，而建 立有效、穩(wěn)定的全腦缺血再灌注模型是實驗研究的基礎。針對建立全腦缺血再灌注模型的實驗方法有多種，包括：二血管阻斷加低血壓法、四 血管阻斷法、三血管阻斷法、頸動脈負壓分流法。國內文獻報道用四血管阻斷法比較多 5,國外四血管阻斷法、二血管阻斷加低血壓法均有應用及報道，但更偏向于后者6。對比不同建模方法在實驗過程中所顯露出的特性，分析并總結各自的優(yōu)缺點。選擇能較好地 建立大鼠全腦缺血再灌注模型的方法，為腦復蘇的深入研究提供良好的實驗基礎。本文將 從實驗的可操作性

5、、成功率、發(fā)展前景等方面對各類建模方法進行綜述。1制作全腦缺血再灌注動物模型及效果的判定全腦缺血再灌注模型模擬心搏驟停在心肺復蘇過程中，腦損害的病理生理主要是缺血缺氧性腦損傷以及自主循環(huán)恢復后 的大腦缺血再灌注損傷，其中涉及興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性、鈣離子穩(wěn)態(tài)失調、神經(jīng)元凋 亡等機制4。心臟停搏引起完全性全腦缺血，急性缺血缺氧可造成細胞損傷，恢復血循環(huán) 后又可引起再灌注損傷。因此全腦缺血再灌注造成的結構破壞和功能障礙是腦復蘇的重要 病理生理過程。目前主要是通過全腦缺血再灌注模型來模擬心搏驟停，即將頭部的主要動 脈進行阻斷，從而導致全腦缺血，營造出腦組織缺血缺氧的狀況。全腦缺血再灌注動物模型要求手

6、術操作簡便，致死率低，重復性好；缺血效果好，急、慢性缺血實驗均可應用；再灌注方便、完全、充分；盡量能夠保持顱腦的完整性；血液的流變性變化盡量要小7。二血管阻斷加低血壓法建立大鼠全腦缺血再灌注模型采用二血管阻斷加低血壓建立大鼠全腦缺血再灌注模型：10%水合氯醛（350 mg/kg）腹腔注射麻醉，分離暴露右側股動脈，行股動脈插管，接 BL-420生物機能記錄系統(tǒng)監(jiān)測動 脈血壓。頸正中切口，分離雙側頸總動脈及作側頸靜脈，經(jīng)左側頸靜脈插管，建立給藥途 徑，靜脈注射肝素 150 IU/kg 。經(jīng)左頸靜脈回抽血液，當平均動脈壓達 3540 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）時，用微型動脈夾夾

7、閉雙側頸總動脈，此為缺血期開始。期間經(jīng)頸靜 脈回抽放血或靜脈注射回輸血液保持平均動脈壓在3540 mm Hg 。 15 min缺血期后移去微型動脈夾，去除雙側頸總動脈的夾閉，回輸血液，此為再灌注期。Pulsinelli四血管法及改良的四血管法建立大鼠全腦缺血再灌注模型四血管阻斷法8,9主要是在頸前正中切口，分離雙側頸總動脈，套線備用。同時枕部 切口（頸部前傾30。，利于手術部位的暴露），借助手術顯微鏡分離暴露第一頸椎橫突翼并找 左右橫突孔（椎動脈在人腦前從此孔下通過），將灼熱的電烙鐵尖頭（直徑0.5 mm）直接插入翼突孔，深度以23 mm為宜，電凝雙側椎動脈，造成永久性閉塞10。也可采用鉆透第

8、一頸椎小孔的方法（即改良的四血管閉塞法），在直視下直接燒灼雙側椎動脈，成功率幾乎 100% o 24 h后用乙醛淺麻醉大鼠（也可在清醒狀況下手術），頸部常規(guī)消毒，打開頸前正中 切口，將套在雙側頸總動脈下的備用線結扎，根據(jù)實驗需求可阻斷血液流動1060 min ,松開結扎線后可實行再灌注研究 11。三血管阻斷法建立大鼠全腦缺血再灌注模型采用三血管阻斷法12建立全腦缺血再灌注模型：20%烏拉坦1 000 mg/kg腹腔麻醉，經(jīng)頸正中切口，分離雙側頸總動脈備用，剪去枕骨腹側面部分顱骨，用5-0絲線結扎延髓腹側面上的基底動脈，通過雙側頸總動脈的關閉和開放實現(xiàn)全腦缺血再灌流。頸動脈負壓分流法制作大鼠全腦

9、缺血再灌注模型頸動脈負壓分流法13,14制模：采用水合氯醛腹腔麻醉 （350 mg/kg）,取頸部正中切 口，分離左右頸總動脈及右頸外動脈；另取左側腹股溝部切口，分離左股靜脈并置管與輸液器相連，從左股靜脈注入肝素（180 U）后緩慢注入生理鹽水；用微動脈夾夾閉兩側頸總動脈，從右頸外動脈向近心端插入套管針至頸內動脈與頸外動脈的分叉處，取出針芯，套管 接三通與注射器相連，持續(xù)抽吸頸總動脈內血液，此為腦缺血開始，抽血速度平均為0.3mL/min左右，由于大鼠在側支循環(huán)及循環(huán)血量上的個體差異，控制抽血速度的負壓以維持 在使被抽血側的頸總動脈在直視下處于塌陷狀態(tài)為宜。在抽血的同時，間斷更換注射器， 將抽

10、出的血液從左股靜脈持續(xù)回輸，注意保持抽血速度與輸入速度相等。持續(xù)抽血30 min后停止抽吸血液，拔出套管并結扎頸外動脈，去除兩側頸總動脈上的微動脈夾，此為再灌 注開始。全腦缺血再灌注后開顱取腦組織進行觀察將完成缺血再灌注實驗的大鼠進行開顱并取其完整的大腦組織，進行形態(tài)學觀察。主 要觀察項如下：大腦組織的整體形態(tài)、腦溝腦回是否清晰、皮質的顏色、淺表血管的狀態(tài) 及血管內的血流情況。在此基礎上經(jīng)蘇木精-伊紅染色（HE）,在光鏡下觀察海馬組織及頂葉皮質，主要觀察神經(jīng)元細胞的形態(tài)及排列情況、胞質的狀態(tài)、細胞核的形狀及核仁；光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細胞密度。實驗大鼠與正常大鼠腦組織對比正常大鼠大腦無腫脹，腦

11、溝腦回清晰，皮質顏色較紅潤；淺表血管豐富，充盈好，鮮紅。實驗組大腦腫脹明顯，腦溝腦回變淺，皮質顏色蒼白；表面血管塌陷，血流少，部分基本無血流。經(jīng)HE染色后在光鏡下觀察海馬組織及頂葉皮質，正常大鼠神經(jīng)元細胞排列規(guī) 則，胞質豐富，核呈圓形，核仁清楚；實驗大鼠病理改變明顯，可見大量神經(jīng)元壞死變性，排列紊亂，神經(jīng)元胞質濃縮，胞核固縮，核仁不清；光鏡下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細胞密度實驗組比正常對照組低15。2 選擇適當可行的方法建立全腦缺血再灌注模型建立全腦缺血再灌注模型的方法腦復蘇中存在全腦缺血再灌注損傷，而對腦缺血再灌注損傷的研究仍然是急診醫(yī)學中 的重點，腦缺血再灌注模型的制作則是研究工作的重要環(huán)節(jié)。全腦

12、缺血再灌注模型制作方 法有很多種：四血管阻斷法，二血管阻斷加低血壓法，三血管阻斷法，頸動脈負壓分流 法。國內文獻報道用四血管阻斷法比較多，國外四血管阻斷法、二血管阻斷加低血壓法均 有應用及報道，但更偏向于后者。簡述各種建模方法的特點二血管阻斷加低血壓法優(yōu)點：操作簡便，用一次性手術即可完成，阻斷完全可逆，可人為控制動物呼吸；可模擬臨床上休克、心功能不全、腦血管嚴重狹窄或阻塞合并血液低灌流引起的腦循環(huán)障礙， 造成不同程度的腦組織缺血損傷，對于探討人類缺血性腦損傷的發(fā)病規(guī)律，評價抗腦缺血 藥物的療效等有價值；成模效率較典型、穩(wěn)定，可重復性好。缺點：模型不能在清醒動物上復制，無法研究血管狹窄后行為學的

13、變化；常因存在側支循環(huán)而造成缺血不完全，部位不確定；腦缺血時限長，有時導致腦缺血后抽搐、癲病等并發(fā)癥的發(fā)生，且又處于低血壓狀態(tài)，會干擾其他器官、組織的供血和實驗結果。四血管阻斷法優(yōu)點：缺血完全，具有較強的可復制性；檢驗缺血是否成功的指標明確。缺點：手術復雜，缺血的穩(wěn)定性和成功率較差；個體差異大，術后存活率較低 ；被燒灼阻斷的椎動脈不可再通，改變了正常的解剖結構，影響再灌注的腦血流量，造成再灌注不 完全16,17。三血管阻斷法優(yōu)點：成功率高，缺血指標的觀察明確簡單；可根據(jù)實驗需要，通過阻斷 CCA時間的長短控制腦缺血的程度。缺點：手術難度較大，對實驗者的要求較高，故可行性不高；在手術過程中對周圍

14、組織牽拉嚴重，在恢復血流時會受影響。頸動脈負壓分流法優(yōu)點：不改變腦血管的主要解剖結構，不影響基底動脈和椎動脈的血流，腦干無明顯 缺血；實施再灌注后，不改變血流動力學方向，仍保持原來的生理狀態(tài)。缺點：實驗的操作較為復雜，很難保證其成功率。結論四血管阻斷法由于個體差異大、成功率低并且在手術過程中翼突孔的區(qū)分是完全阻斷 雙側椎動脈的關鍵，在翼突孔前上方有一小切口，若肌肉分離不完全，易將該切口誤以為 翼突孔，若在此次灼燒，不但不能完全阻斷雙側椎動脈，而且還易燒傷脊髓，甚至腦干， 引起動物的立即死亡。三血管阻斷法因其操作的復雜性和較高的手術難度，對實驗的成功 率有較大影響，使該方法的動物致死率相對有所增

15、高。三血管和四血管阻斷法均是通過較 強有力的人為作用使血管血流阻斷，驟然改變了正常的生理狀況，造成了阻斷的動脈血管 內壓力的改變，引起一系列應激性生理及病理反射，增加了腦缺血因素的復雜性。對于頸 動脈負壓分流法，Bannister和Chapman18認為這種腦缺血主要是右側大腦中動脈供應 的區(qū)域缺血；然而一些學者經(jīng)實驗研究發(fā)現(xiàn)，造成這一差異的原因，可能與放血速度、頸 內動脈壓力降低程度以及動物種屬差異等因素有關。所以此方法在實驗過程中受較多不確 定的因素影響，故不 被廣泛采用。二血管阻斷法在可行性及成功率上具有顯著的優(yōu)勢，就 達到全腦缺血狀態(tài)而言，此方法完全可以滿足實驗的要求，并且按照血流動力

16、學觀點來分析，二血管阻斷加低血壓 法更符合血流動力學的要求。采用較為柔和的人為作用，在造成 腦缺血的同時，維持了全部或部分兩系血管的開放，基本保證了血液在腦部流動的方向性，能較好地建立大鼠全腦缺血再灌注模型，可為腦復蘇的深入研究提供良好實驗基礎。3二血管阻斷加低血壓法在建立大鼠全腦缺血再灌注模型的評述及展望由于心臟緊急救治和心肺復蘇(CPR)國際指南在我國的普及推廣，越來越多的CA患者經(jīng)基礎復蘇恢復了自主循環(huán)，但腦復蘇成功率仍較低。如何加強以腦復蘇為重點的后 期復蘇階段的處理，提高腦復蘇成功率，是國內外醫(yī)學界近年來研究的熱門課題。雖然目 前的研究已經(jīng)取得了階段性成果，但是僅僅只是在動物模型上獲

17、得一定的成功，要運用到 臨床實踐中還有待進一步的研究探索，這也注定了心肺腦復蘇將在未來的一定時期內保持 著較高的研究熱度和新鮮性。而作為該項研究的基礎，如何建立典型的、穩(wěn)定的動物模型 將成為影響其實驗結果的重要因素之一。本文從建立大鼠全腦缺血再灌注模型的眾多方法中，挑選出二血管阻斷加低血壓法與 四血管阻斷法兩種采用最多的方法進行研究分析?？偨Y如下：國內文獻報道用四血管阻斷 法比較多5,國外四血管阻斷法、二血管阻斷加低血壓法均有應用及報道，但更偏向于后 者6。通過分析對比兩者的操作性與成功率，可以得出二血管阻斷加低血壓法在建立大鼠 全腦缺血再灌注模型中有較大的優(yōu)越性和可行性。與此同時在中西方文化

18、密切交流的環(huán)境 中，西方被廣泛應用的技術一定會隨著雙邊文化的交流引入并推廣到中國。綜上所述，二 血管阻斷加低血壓法將憑借其較強的可行性與較高的成功率等優(yōu)勢，在建立大鼠全腦缺血 再灌注模型中得到進一步的推廣和應用，較好地建立大鼠全腦缺血再灌注模型，可為腦復 蘇的深入研究提供良好的實驗基礎?！緟⒖嘉墨I】1,郭星君.心肺腦復蘇新進展J.實用醫(yī)藥雜志，2010(5): 463-465.2,徐姜定.腦復蘇與腦死亡J.浙江臨床醫(yī)學，2008(7) : 865-866.3,孫亞新，徐巖，韓秀文.心肺復蘇后中樞神經(jīng)功能障礙與急性胃黏膜病變的關系J.世界華人消化雜志，2005,13(3) : 424-425.4

19、,Hidenori E , Hiroshi K , Chikako N , et al.Mitochondrial translocation of p53 mediates release of cytochrome c and hippocampal CA1 neuronal death after transient global cerebral ischemia in ratsJ.J Neurosci,2006,26(30): 7 974-7 983.5,歐冊華，王曉斌.兔全腦缺血動物模型復制方法的改進J.四川動物，2002(2) : 4546.6,Zhang J H , Qian

20、H , Sun H S.Rapid hypoxia preconditioning protects cortical neurons from glutamate toxicity throughdelta-opioid receptorJ.Stroke,2006,37(4): 1094-1 099.7,Brolongan C V , Wang Y , Su T P.Delta opioid peptide(D-Ala 2, D-Leu 5)enkephalin : linking hibernation and neuroprotection.J.Front Biosc i,2004,1(9): 3 392-3398.8,李文東，姜洪波，連曉清，等 .Pulsinelli四血管法大鼠全腦缺血模型制作方法的改 進J.新鄉(xiāng)醫(yī)學院學報，2010,27(3) : 237-239.9,李兵，章翔.改良四血管阻塞法建立大鼠全腦缺血模型J.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2005,4(2) : 110-113.10,周光新，高誠，徐平.