肽核酸技術(shù)對(duì)禽場(chǎng)病毒持續(xù)侵染良好控制方案的研究(禽病篇)教學(xué)講義課件

1、肽核酸技術(shù)對(duì)禽場(chǎng)病毒持續(xù)侵染良好控制方案的研究(禽病篇)韓健葆 博士京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院楠森獸醫(yī)診斷技術(shù)研究中心報(bào)告人簡(jiǎn)介：韓健葆 先生 楠森集團(tuán)運(yùn)營(yíng)總監(jiān)，畢業(yè)于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，從事畜禽場(chǎng)健康管理研究和獸用肽核酸（基因）抗病毒藥物及多肽類功能性免疫調(diào)節(jié)劑研究推廣多年 ，兼任國(guó)內(nèi)多家動(dòng)物保健品企業(yè)新藥研發(fā)顧問(wèn)，常年為國(guó)內(nèi)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)提供技術(shù)培訓(xùn)及疫病診斷服務(wù)。 應(yīng)對(duì)愈漸復(fù)雜的病毒性疾病發(fā)生現(xiàn)狀，在行業(yè)內(nèi)率先提出“規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)病毒感染良好控制與凈化保健方案”的獸醫(yī)傳染病綜合控制專家。森楠生物技術(shù)研究有限公司簡(jiǎn)介 森楠生物隸屬于楠森集團(tuán)公司，專注于動(dòng)物用核酸和多肽類抗病毒免

2、疫增強(qiáng)藥物及功能性飼料添加劑研究開(kāi)發(fā)的高新技術(shù)企業(yè)，公司以“致力于推廣規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)病毒感染控制與凈化方案”為核心經(jīng)營(yíng)價(jià)值，秉承“以創(chuàng)新思路成就未來(lái)、以優(yōu)異品質(zhì)創(chuàng)造價(jià)值”的經(jīng)營(yíng)理念，以“專業(yè)、敬業(yè)、善學(xué)、奮進(jìn)”的企業(yè)文化，以服務(wù)全球畜牧業(yè)為己任，用心為客戶提供系統(tǒng)的現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)解決方案。楠森資質(zhì)與榮譽(yù)禽場(chǎng)病毒感染控制與凈化方案的創(chuàng)造 疫百特注冊(cè)商標(biāo)擁有國(guó)家發(fā)明專利，技術(shù)世界領(lǐng)先 發(fā)明創(chuàng)造名稱：禽流行性感冒病毒特異性反義核酸藥物，專利號(hào)： ZL 201010159652.1 發(fā)明人貨專利權(quán)人：韓健寶 在臨床流行性的疾病所導(dǎo)致的損失中,約有70%疾病損失是由病毒性疾病導(dǎo)致,所以病毒性疾病是影響?zhàn)B殖業(yè)

3、健康發(fā)展和盈利的關(guān)鍵因素。病毒性傳染病在養(yǎng)禽業(yè)中所扮演的角色關(guān)于病毒 病毒是一類超顯微的、不具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的、專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的實(shí)體。它由一種核酸(DNA或RNA)和蛋白質(zhì)組成,沒(méi)有酶或酶系統(tǒng)極不完全,不能進(jìn)行獨(dú)立的代謝作用,必須寄生在宿主細(xì)胞內(nèi),借助于宿主細(xì)胞的代謝系統(tǒng)復(fù)制自身的核酸和蛋白質(zhì)才能繁殖。病毒的感染機(jī)制病毒的生活史分為5個(gè)基本過(guò)程：吸附(absorption)：病毒對(duì)細(xì)胞的感染起始于病毒蛋白外殼同宿主細(xì)胞表面特殊的受體結(jié)合，受體分子是宿主細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的正常成分。因此，病毒的感染具有特異性。侵入(penetration)：病毒吸附到宿主細(xì)胞表面之后，將它的核酸注入到宿主細(xì)胞內(nèi)。復(fù)制

4、(replication)：病毒核酸進(jìn)入細(xì)胞后有兩種去向，一是病毒的遺傳物質(zhì)整合到宿主的基因組中，形成溶原性病毒；第二種情況是病毒DNA(或RNA)利用宿主的酶系進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。成熟(maturation)：一旦病毒的基因進(jìn)行表達(dá)就可合成病毒裝配所需的外殼蛋白，并將病毒的遺傳物質(zhì)包裹起來(lái)，形成成熟的病毒顆粒。釋放(release)：病毒顆粒裝配之后，它們就可從被感染的細(xì)胞中釋放出來(lái)進(jìn)入細(xì)胞外，并感染新的細(xì)胞。有些病毒釋放時(shí)要將被感染的細(xì)胞裂解，有些則是通過(guò)分泌的方式進(jìn)入到細(xì)胞外。危害養(yǎng)殖業(yè)較大的病毒分類病毒種類病毒（科）疾病RNA副黏病毒雞新城疫正黏病毒禽流感雙股RNA病毒禽法氏囊小RNA病毒

5、鴨肝炎 冠狀病毒禽傳染性支氣管炎小RNA病毒豬口蹄疫黃病毒豬瘟批衣病毒豬藍(lán)耳病Taura綜合癥病毒蝦桃拉綜合癥DNA細(xì)小病毒 小鵝瘟圓環(huán)病毒豬圓環(huán)病毒病皰疹病毒豬偽狂犬病桿狀病毒 蝦白斑綜合征病YebatonTM的研發(fā)背景近年來(lái),由于從國(guó)外引種及進(jìn)口動(dòng)物源性飼料原料，飼養(yǎng)管理模式的改變等導(dǎo)致病毒性疾病發(fā)生和控制愈漸復(fù)雜,養(yǎng)殖場(chǎng)普遍面臨著新增的病毒性疾病與老病新發(fā)的病毒性疾病雙重夾擊的困擾，造成生產(chǎn)上極大的損失，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展形成了巨大的障礙。但就目前的抗病毒藥物的品種結(jié)構(gòu)而言,可供臨床使用的藥物比較有限,遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)上預(yù)防和治療病毒病的需要。尋找新的有效的抗病毒藥,特別是對(duì)病毒具有高度選

6、擇性、而對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)毒害的藥物仍是當(dāng)前迫切的需要。在這種特殊時(shí)期，疫百特TM應(yīng)時(shí)而生，將會(huì)給中國(guó)乃至世界的養(yǎng)殖場(chǎng)所遭受的病毒感染帶來(lái)新的控制方案。森楠生物SENNAN BIO. 下屬的中國(guó)新藥研發(fā)中心（NDDC）與美國(guó)Cornell University基因工程藥物研究中心技術(shù)合作，將反義技術(shù)和反義寡核苷酸藥物（YebatonTM ）這一全新的“沉默基因”治療技術(shù)引用到獸醫(yī)臨床，為當(dāng)前愈見(jiàn)復(fù)雜的病毒性疾病的藥物有效控制提供了新的途徑。有了疫百特TM，我們才能與病毒和諧共處 目前在獸醫(yī)臨床上尚無(wú)任何抗病毒化合物被許可使用，yebatonTM對(duì)于DNA病毒和小RNA病毒的控治以其良好的藥代動(dòng)力學(xué)特

7、征、廣譜的抗病毒作用、廣泛的臨床適應(yīng)癥以及良好的耐受性和無(wú)毒副作用的特點(diǎn),將會(huì)為養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和畜禽病毒性疾病的控治做出重要的貢獻(xiàn)。 SENNAN BIO. 針對(duì)豬、家禽和蝦的主要傳染病設(shè)計(jì)合成的yebatonTM（反義脫氧寡核苷酸），具有較強(qiáng)的抗病毒活性。體外實(shí)驗(yàn)表明本品對(duì)豬的（豬瘟病毒、藍(lán)耳病病毒、口蹄疫病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒）；禽的（流感病毒、新城疫病毒、傳支病毒、鴨肝炎病毒、法氏囊病毒）；對(duì)蝦的（白斑綜合征（WSS）病毒和桃拉綜合征（TS） 病毒）顯示出極強(qiáng)的抗病毒作用。 YebatonTM是指建立在反義技術(shù)（Antisense technology）的基礎(chǔ)上，采用人工合成的反義

8、脫氧寡核苷酸經(jīng)特殊工藝修飾制備的基因工程抗病毒免疫增強(qiáng)新藥，這種基因片段藥物（DNA及RNA片段）是與病毒DNA或RNA互補(bǔ)的核酸序列,能與病毒基因鏈的保守核苷酸序列（即mRNA ）雜交,形成穩(wěn)定的互補(bǔ)結(jié)構(gòu),選擇性地干擾或封閉基因表達(dá)、阻斷病毒基因正常復(fù)制，以達(dá)到治療病毒病目的的新型治療技術(shù)，被稱之為“沉默基因”或“生物導(dǎo)彈”給藥技術(shù)。什么是 YebatonTMYebatonTM的特點(diǎn)相對(duì)廣譜性（針對(duì)危害家禽主要病毒設(shè)計(jì)的反義脫氧寡核苷肽），如:NDV、AIV、IBV、IBDV等高效性（病毒性疾病良好的控制效果）最優(yōu)化的藥物設(shè)計(jì)（可以和任何化學(xué)藥物及中藥混合復(fù)配）長(zhǎng)期投藥無(wú)毒，安全。針對(duì)病毒目

9、的基因作用，不產(chǎn)生耐藥性。 疫百特TM的空間結(jié)構(gòu)神奇的擬病毒結(jié)構(gòu) 疫百特TM運(yùn)用基因工程技術(shù)合成并以肽骨架修飾手段對(duì)反義寡核苷酸進(jìn)行修飾形成聚合物，從而彌補(bǔ)天然結(jié)構(gòu)核酸藥物抗病毒時(shí)效短暫、在機(jī)體內(nèi)生物利用度低，易被核苷酸酶降解的缺陷，不但使之在體內(nèi)的半衰期明顯延長(zhǎng)，而且使核酸藥物具有穩(wěn)定的理化性能和相對(duì)廣譜抗病毒活性。 YebatonTM的結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 我們采用低聚殼聚糖對(duì)寡核苷酸基因修飾技術(shù)將經(jīng)修飾的反義寡核苷肽制備成速溶緩釋顆粒，家禽口服YebatonTM后，經(jīng)過(guò)消化道逐步吸收有效成分（反義脫氧寡核苷酸），保證絕大多數(shù)有效藥物核酸分子的生物活性不被破壞，具備高水平的生物利用率，這種殼聚糖修飾技

10、術(shù)和緩釋制劑工藝是保證生物活性藥物經(jīng)家禽口服后不被消化道內(nèi)酶破壞的理想技術(shù)。以殼聚糖為載體的口服基因藥物（摘要）唐明青1,刁勇1,2,許瑞安1,2(1.華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所, 2.分子藥物教育部工程研究中心,福建泉州362021)人藥研究論文案例 長(zhǎng)期以來(lái),基因藥物的給藥以注射途徑為主,是因?yàn)榭诜o藥存在多種限制因素,如胃中的低pH可使DNA脫嘌呤化,消化酶易降解治療基因,常用基因載體難以被腸上皮細(xì)胞攝取等,相關(guān)釋藥技術(shù)的發(fā)展明顯滯后于基因藥物本身的發(fā)展1。 作為一種天然的陽(yáng)離子聚合物,低聚殼聚糖不僅易與帶負(fù)電荷的DNA等遺傳物質(zhì)結(jié)合而形成納米微粒,還具有無(wú)毒、易獲得、生物可降解、穩(wěn)定、生

11、物相容、能抵抗胃腸道環(huán)境(pH、核酸酶)對(duì)藥物的破壞、生物黏附性強(qiáng)、可促進(jìn)藥物滲透吸收等優(yōu)點(diǎn),日益成為口服基因藥物的優(yōu)良載體。 YebatonTM （多聚-反義寡核苷酸肽）經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)后與特異宿主細(xì)胞結(jié)合，在酶的催化作用下脫去肽骨架，經(jīng)受體導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，識(shí)別并激活2、5-寡腺苷酸合成酶，被活化的寡腺甘酸可以使?jié)摲隗w內(nèi)的內(nèi)源核酸酶（核酸內(nèi)切酶-Dicer）活化，在RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合體（RISC，RNA-induced silencing complex） 作用下，對(duì)（病毒）靶基因mRNA進(jìn)行切割，引起病毒復(fù)制環(huán)節(jié)能力喪失，從而達(dá)到抗病毒的作用。YebatonTM的作用機(jī)制(抗病毒機(jī)理)Y

12、ebatonTM的作用機(jī)制(免疫調(diào)節(jié)機(jī)理) YebatonTM所獨(dú)特的擬病毒結(jié)構(gòu)，進(jìn)入機(jī)體后可被免疫系統(tǒng)誤認(rèn)為是遭受到病毒攻擊從而激活機(jī)體的特異性和非特異性的免疫防衛(wèi)機(jī)能。 對(duì)其免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤機(jī)制的研究表明，其主要作用是激活自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、T、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性、誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種干擾素、多種細(xì)胞介素，從而達(dá)到預(yù)防和治療病毒病，修復(fù)機(jī)體免疫缺陷的作用。 YebatonTM實(shí)驗(yàn)室與臨床研究 森楠生物新藥研發(fā)中心的研究人員在長(zhǎng)達(dá)六年的實(shí)驗(yàn)室研究和眾多豬、禽場(chǎng)進(jìn)行臨床應(yīng)用性研究，結(jié)果表明：疫百特(YebatonTM)對(duì)豬、禽臨床常見(jiàn)多種病毒性疾病具有很好的預(yù)防和理想、經(jīng)濟(jì)的治療效果。Y

13、ebatonTM抑制新城疫病毒（NDV）感染細(xì)胞的試驗(yàn) 結(jié)果顯示：YebatonTM對(duì)NDV在細(xì)胞內(nèi)感染有明顯的抑制作用。對(duì)照（Control）組的細(xì)胞中形成的平均空斑數(shù)為128個(gè)。YebatonTM組的細(xì)胞中形成的平均空斑數(shù)為27個(gè)。YebatonTM與常用化學(xué)抗病毒藥物的治療對(duì)比YebatonTM對(duì)人工感染新城疫、法氏囊、傳染性支氣管炎病毒后的發(fā)病率影響 結(jié)果表明:在適當(dāng)?shù)膭┝糠秶鷥?nèi)，YebatonTM的添加量越大，控制病毒感染的效果越顯著。 YebatonTM不同劑量飲水添加后對(duì)各病毒攻毒后的保護(hù)情況YebatonTM抑制流感病毒（AIV）感染細(xì)胞的試驗(yàn) 將CEF細(xì)胞培養(yǎng)成單層，Yeba

14、tonTM轉(zhuǎn)染;以PBS液作對(duì)照.14 h后再接AIV。病毒感染48 h后通過(guò)間接免疫熒光評(píng)價(jià)YebatonTM對(duì)病毒復(fù)制的抑制效果。圖1. 未用YebatonTM轉(zhuǎn)染的感染AIV的CEF細(xì)胞（100） 圖2. 用YebatonTM轉(zhuǎn)染的感染AIV的CEF細(xì)胞（100）結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染YebatonTM可以顯著的抑制病毒對(duì)細(xì)胞的感染。禽場(chǎng)實(shí)施病毒性傳染病良好控制的原則禽場(chǎng)實(shí)施病毒性傳染病良好控制的原則系統(tǒng)的免疫檢測(cè)定期的有效產(chǎn)品保健（YebatonTM）科學(xué)的疫苗接種程序 三位一體 只有盡快實(shí)施“三位一體”的健康管理模式（系統(tǒng)的免疫檢測(cè)、科學(xué)的疫苗接種程序、定期的有效產(chǎn)品保?。?，才是禽場(chǎng)重大疾病

15、控制或清除計(jì)劃的最佳手段！“三位一體”的健康管理模式解除免疫抑制、改善免疫狀態(tài)、彌補(bǔ)免疫遺漏、減輕病毒感染壓力、結(jié)合免疫程序使用，提升滅活疫苗及活疫苗免疫效果的完美方案！YebatonTM做為免疫調(diào)節(jié)劑提高疫苗免疫效果YebatonTM抗病毒又為何提高活疫苗免疫效果1？ 活病毒感染的第一個(gè)階段是在機(jī)體的淋巴系統(tǒng)（在淋巴系統(tǒng)完成細(xì)胞免疫應(yīng)答）。弱毒苗是人工致弱的病毒，正常情況下在機(jī)體淋巴系統(tǒng)完成細(xì)胞免疫應(yīng)答后，致弱活病毒都會(huì)被抗原遞成系統(tǒng)轉(zhuǎn)化成抗體，即使有少量的弱毒在淋巴系統(tǒng)增殖后逃逸到血液循環(huán)系統(tǒng)并出現(xiàn)一過(guò)性的輕微臨床癥狀（輕微的病毒血癥）也會(huì)很快的被血液系統(tǒng)里存在的特異性抗體、巨噬細(xì)胞、NK

16、殺傷細(xì)胞等構(gòu)成非特異免疫系統(tǒng)細(xì)胞所控制住。而野毒（非致弱活病毒）往往會(huì)在淋巴系統(tǒng)內(nèi)大量的增殖并涌入血液循環(huán)系統(tǒng)，并隨著血液循環(huán)直接進(jìn)入實(shí)質(zhì)性臟器（如肺臟、腎臟、肝臟、脾臟等）并將這些臟器上的特定健康細(xì)胞作為第二宿主細(xì)胞而進(jìn)行再次的破壞，導(dǎo)致臟器的壞死、出血等病變從而引起臟器的代謝功能紊亂等一系列臨床表現(xiàn)從而發(fā)病甚至死亡。 YebatonTM抗病毒是發(fā)生在血液循環(huán)系統(tǒng)，主要在受病毒感染的宿主細(xì)胞內(nèi)阻斷病毒基因表達(dá)復(fù)制從而達(dá)到抗病毒目的。而對(duì)存在淋巴系統(tǒng)的病毒（弱毒或野毒）作用不到，所以不會(huì)影響弱毒疫苗所誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程。YebatonTM抗病毒又為何提高活疫苗免疫效果2？影響禽群免疫效果的

17、主要因素病毒性傳染病的控制，一直以來(lái)都是依賴疫苗的免疫接種，不可否認(rèn)，對(duì)于傳染病的控制，疫苗的免疫接種是最基礎(chǔ)的、最經(jīng)濟(jì)的、最 主動(dòng)的措施，但是面對(duì)當(dāng)前畜禽傳染病的發(fā)生現(xiàn)狀，僅僅依賴疫苗的免疫接種來(lái)控制傳染病已明顯感到不足。免疫受體（禽群）的免疫狀態(tài)（如:免疫抑制、免疫麻痹、免疫缺陷、免疫遺漏）。這種現(xiàn)象通過(guò)疫苗（特異性抗原）是消除或緩解不了的，必須要通過(guò)非特異性免疫增強(qiáng)劑參與抗原協(xié)同工作，先將免疫受體的免疫狀態(tài)調(diào)節(jié)正常，這樣機(jī)體免疫系統(tǒng)才能對(duì)抗原產(chǎn)生正常的免疫應(yīng)答。野毒的免疫干擾和免疫占位現(xiàn)象 我們雞場(chǎng)的新城疫為什么總是防不好？追究其根本原因就是雞群普遍遭受野毒持續(xù)侵染導(dǎo)致帶毒密度過(guò)大，與疫

18、苗弱毒競(jìng)爭(zhēng)宿主細(xì)胞后致使免疫狀態(tài)不穩(wěn)定。 免疫抑制性疾病的存在，是我們控制和消滅養(yǎng)殖場(chǎng)重大疫病的主要威脅和障礙，必須引起我們的高度重視。（如：IBD 、 LL（禽白血?。?、CIA（傳貧）、RE（網(wǎng)內(nèi) ）、ALV-J（雞J亞群白血?。?。免疫抑制性疾病的影響凸顯種禽場(chǎng)應(yīng)用疫百特之免疫抑制性病毒控制方案 據(jù)調(diào)查資料顯示，我國(guó)目前種雞網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥和白血病兩種免疫抑制性病毒的感染壓力很大，而且無(wú)疫苗可以防疫，大量的種雞存在不同程度的免疫障礙，由于種雞的免疫機(jī)能受損導(dǎo)致生產(chǎn)性能低下，易引起疾病的頻頻發(fā)生，種雞場(chǎng)的盈利危機(jī)四伏。在種雞場(chǎng)中有著相當(dāng)多的雞只表現(xiàn)出的接種疫苗后的免疫應(yīng)答能力下降，抗體水平紊

19、亂、產(chǎn)合格種蛋率下降等亞臨床現(xiàn)象。存在的這些現(xiàn)象中，有80%是由于種雞的長(zhǎng)期遭受免疫抑制性病毒持續(xù)感染所致。在生產(chǎn)中，采用疫百特拌料或飲水給藥的策略式病毒控制方案是解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵！ 種禽場(chǎng)產(chǎn)蛋高峰階段性控制方案 種鵝、肉種雞、蛋種雞產(chǎn)蛋高峰階段的脈沖式性投藥（間隔10-15天）連續(xù)飲水7天，可以對(duì)新城疫、流感、傳染性支氣管炎等野毒感染起到補(bǔ)充預(yù)防和凈化效果,100克/噸水。 禽場(chǎng)應(yīng)用疫百特之育雛階段病毒控制方案 禽(雞鴨鵝)群在育雛前期0-15日齡這兩周左右的時(shí)間是最容易感染病毒性疾病、死亡率最高、飼養(yǎng)技術(shù)要求最高最復(fù)雜的一個(gè)階段，目前由于種雞持續(xù)帶毒后往環(huán)境排毒，孵化房環(huán)境嚴(yán)重被病毒污染等導(dǎo)致雛禽病毒感染及先天性免疫機(jī)能低下、出生后每天承受著野毒的高感染壓力，母源抗體加速消耗、疫苗免疫程序紊亂的情況越來(lái)越嚴(yán)重，由此導(dǎo)致的育雛前期發(fā)病率、死淘率明顯增加、獸醫(yī)工作強(qiáng)度大、生產(chǎn)用藥成本高而且也解決不了問(wèn)題。在雛雞健康管理工作中，病毒感染是這一時(shí)期尤其要注重的，在雛雞（0日齡）進(jìn)場(chǎng)后開(kāi)始，疫