膜片鉗實驗與技術(shù)課件

1、膜片鉗技術(shù)講座 在膜片鉗技術(shù)及應用（2003）一書的序言中寫道： 通常，一篇非常專業(yè)的科技論文公開發(fā)表后，若被其他的論文引用數(shù)次，其作者就會感到欣慰；假如被別的作者引用十次以上，就可稱得上是一篇好論文；要是有幸被引用幾十上百次，甚至幾百次，那它無疑是一篇高質(zhì)量杰作，通常發(fā)表在權(quán)威的專業(yè)期刊或者是著名的科學雜志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。 然而，你是否知道？有一篇論文，它的作者當時還不太有名，刊登的雜志也不算頂級，可是論文發(fā)表20年來，已神話般地被世界各地的科技工作者引用了一萬二千余次，遍及生物醫(yī)學的眾多領(lǐng)域，而且近年來還在以平均每年約

2、一千多篇的速度繼續(xù)被引用，它就是由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人于1981年發(fā)表在歐洲生理學雜志上的著名論文。在此之前五年，身為德國科學家的Neher和Sakmann共同發(fā)明了膜片鉗技術(shù)（1976），并于15年后共同榮獲1991年諾貝爾 生理學或醫(yī)學獎。目 錄一、離子通道的概念二、離子通道的分子結(jié)構(gòu)三、離子通道的分類四、離子通道的研究技術(shù)五、膜片鉗實驗方法六、膜片鉗改良模式及其它研究方法一、離子通道的概念 離子通道（ion channels）是鑲嵌在細胞膜脂質(zhì)雙分子層上的一種特殊整合蛋白，在特定情況下，形成具有高度選擇性的親水性孔道，允許適當大小和

3、電荷的離子以被動轉(zhuǎn)運的方式通過。 離子通道具有兩大共同特征，即離子選擇性及門控特性。選擇性包括通道對離子大小的選擇性及電荷選擇性，如安靜時神經(jīng)細胞膜離子通道對K+的通透性比Na+大100倍，而神經(jīng)興奮時，對Na+通透性又比K+大1020倍。通道閘門的開啟和關(guān)閉過程稱為門控（gating）。通道可表現(xiàn)為三種狀態(tài)，即備用、激活及失活狀態(tài)。 二、離子通道的分子結(jié)構(gòu) 隨著生物物理學和分子生物學的迅速發(fā)展，新的研究技術(shù)的應用，特別是膜片鉗片技術(shù)與分子克隆、基因突變和異體表達等技術(shù)的結(jié)合，使離子通道的研究迅速進入到分子、亞分子水平，人們已開始有能力從分子水平來確定通道的分子結(jié)構(gòu)和解釋離子通道的孔道特性。

4、電壓門控離子通道的基本結(jié)構(gòu) 經(jīng)純化、克隆和測定表明，離子通道蛋白是由多個亞基構(gòu)成的復合體。電壓門控離子通道由、等亞基構(gòu)成，但不同的離子通道的組成略有差異，如鈉通道由、1 、 2和3 、 4亞基組成，鈣通道由1、2、和亞基組成，鉀通道由和亞基組成等。在各亞基中，亞基是構(gòu)成離子通道的主要功能單位，而其它亞基則只起調(diào)節(jié)作用。 亞基是一條跨膜多肽，由1800 2000個氨基酸組成。它包括四個跨膜結(jié)構(gòu)域（），每個結(jié)構(gòu)域含有6個螺旋片段（S1S6）,除S4為親水性跨膜螺旋片段外，其余5個均為疏水性跨膜螺旋片段。位于S5和S6間的一段氨基酸序列部分貫穿膜內(nèi)，是形成親水性孔道而使離子選擇性通過的部分稱為孔道區(qū)

5、（pore region）或P區(qū)，四個結(jié)構(gòu)域圍繞一個中心對稱排列，P區(qū)在內(nèi)組成孔道內(nèi)壁。S4肽段含有一些帶正電荷的氨基酸殘基（如精、賴氨酸），對膜電位的變化敏感，起電壓感受器的作用。 當膜去極化時，每一個功能區(qū)的S4肽段做螺旋運動而使正電荷移出產(chǎn)生微弱而短暫的門控電流，導致通道構(gòu)象變化。當四個結(jié)構(gòu)域S4肽段均發(fā)生這種構(gòu)象變化時，則通道便處于激活開放狀態(tài)，因此，S4肽段又稱為激活閘門（activation gate, m閘門）在通道開放后，很快結(jié)構(gòu)域的S6與功能區(qū)的S1之間的肽鏈構(gòu)成失活閘門（inactivation gate, h閘門），形成一“活瓣”，將通道內(nèi)口阻塞，調(diào)控通道的失活過程?；瘜W

6、門控離子通道的基本結(jié)構(gòu) 當各種化學物質(zhì)與化學門控離子通道相應部位結(jié)合后，會導致通道蛋白發(fā)生構(gòu)型變化，引起通道開放，產(chǎn)生離子電流。體內(nèi)這種離子通道的種類很多，主要包括各種神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道、ATP敏感鉀通道和鈣依賴性鉀通道等。 神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道又稱為離子通道受體，主要有乙酰膽堿門控離子通道、GABA門控離子通道及谷氨酸門控離了通道三大類。 乙酰膽堿門控離子通道 由12 五個亞基組成，呈五邊形排列。每個亞基有4個跨膜區(qū)段即M14，由五個亞基的M2共同構(gòu)成孔道的內(nèi)壁。在1和2亞基N端的細胞外部分各有一個ACh結(jié)合位點，當兩個ACh分子與亞基結(jié)合后，便引起通道蛋白的構(gòu)象變化和通道開放，主要引起N

7、a+內(nèi)流增多。三、離子通道的分類非門控離子通道 門控離子通道 電壓門控性通道化學門控性通道機械門控性通道 1、非門控性離子通道 有些離子通道始終處于開放狀態(tài)，離子可隨時進出細胞，并不受外界信號的明顯影響，這些通道稱為非門控離子通道。如神經(jīng)和肌肉細胞靜息電位就是由于細胞膜上的離子通道允許K+自由進出細胞，而引起的K+電化學平衡電位，此種K+通道即屬于非門控性離子通道。 2、電壓門控離子通道 電壓門控離子通道（voltage-gated ion channels）又稱電壓依賴性離子通道，這一類通道的開啟或關(guān)閉受膜電位的變化決定，具有電壓依賴性和時間依賴性。電壓門控離子通道一般以最容易通過的離子命名

8、，如鈉離子通道、鈣離子通道及鉀離子通道等。 電壓門控鈉離子通道 鈉離子通道（sodium channels，簡稱鈉通道），是選擇性地容許Na+跨膜通過的離子通道。根據(jù)其對鈉通道阻滯劑河豚毒素（tetrodotoxin, TTX）和-食魚螺毒素（-conotoxin,- CTX）的敏感性不同分為神經(jīng)類、骨骼肌類和心肌類鈉通道三類。 電壓門控鈣離子通道 鈣離子通道（calcium channels，簡稱鈣通道）是選擇性容許Ca2+跨膜通過的離子通道。根據(jù)肌細胞和神經(jīng)元電壓門控離子通道對膜電位變化的敏感性，將神經(jīng)元質(zhì)膜電壓門控鈣離子通道分為T、L及N三種類型，后來應用不同的毒素阻斷鈣電流的某種特定的

9、成分，在神經(jīng)元又增加了P、Q和R型，共6型。 電壓門控鉀離子通道 鉀離子通道（potassium channels，簡稱鉀通道）是廣泛存在、種類最多、最為復雜的一大類離子通道，僅電壓門控鉀通道就已克隆出幾十種亞型，根據(jù)其電流動力學特點可分為延遲外向整流鉀通道、瞬時外向鉀通道和內(nèi)向整流鉀通道三類。 3、化學門控離子通道 化學門控離子通道（chemically gated ion channels）又稱配體門控通道（ligand gated channels）。這一類通道的門控行為主要受其相應配體的控制，配體是包括神經(jīng)遞質(zhì)、激素等各種激動劑和阻滯劑在內(nèi)的多種化學因素。當激動劑與化學門控離子通道結(jié)合

10、后，會引起通道蛋白構(gòu)型變化，導致通道開放，產(chǎn)生離子電流。4、機械門控離子通道 機械門控離子通道（mechanically gated ion channels）是由機械牽拉激活的離子通道，主要見于觸覺和聽覺感受器，如聲波傳入內(nèi)耳后，引起內(nèi)耳毛細胞頂端纖毛發(fā)生彎曲或偏斜，從而使毛細胞頂端機械門控通道開放，陽離子內(nèi)流產(chǎn)生聽覺的感受電位。 5、其它門控離子通道除上述離子通道外，尚發(fā)現(xiàn)具有其它門控特性的離子通道存在，如細胞容積敏感的鉀通道（Kvo l）在細胞腫脹時通道開放；Na+激活鉀通道（KNa）對電壓、細胞內(nèi)ATP濃度及細胞內(nèi)鈣均不敏感，只有細胞內(nèi)Na+濃度升高到20mmol/L以上時開放；存在于

11、多種肌細胞的靜息活化鈣通道，在沒有電壓、化學或機械刺激時，參與靜息鈣內(nèi)流，調(diào)制靜息時的細胞內(nèi)鈣濃度。 四、離子通道的研究技術(shù)1、電壓鉗技術(shù) 電壓鉗技術(shù)是1949年Cole及Marmont設計的，后經(jīng)Hodgkin、Huxley 和Katz等加以改進，并成功地應用于槍烏賊巨軸突動作電位期間離子電流的研究。 他們直接測定了膜電流并分析了電流的離子成分，推算出動作電位期間鈉電導和鉀電導的變化，其基本概念至今仍被沿用。鑒于Hodgkin、Huxley 和Eccles對通道研究的突出貢獻，獲得1963年諾貝爾醫(yī)學或生理學獎。A.L.Hodgkin 19141998A.F.Huxley 1917 電壓鉗技

12、術(shù)是通過一個反饋電路使膜電位保持在指定的水平，當離子通道開放產(chǎn)生跨膜電流，導致膜電位改變時，可通過反饋電路經(jīng)微電極向胞內(nèi)注入電流，補充的電流量正好等于跨膜流出的反向離子流，使膜通透性發(fā)生改變時膜電位保持不變，此時注入電流的變化就可反應膜電導或膜電流的改變。電壓鉗技術(shù)工作原理如示意圖：2、膜片鉗技術(shù) 1976年Neher和Sakmann完成電極與膜之間50M的封接，首次記錄到去神經(jīng)蛙肌纖維膜上的單通道電流，為證實生物膜離子單通道是以全或無規(guī)律、隨機開放關(guān)閉的假說提供了有力依據(jù)。但是，當時實驗記錄的背景噪聲較大。1980年，Neher利用負壓吸引實現(xiàn)了G封接，背景噪聲顯著減低。1991年膜片鉗技術(shù)

13、的創(chuàng)始人Neher和Sakmann榮獲諾貝爾醫(yī)學或生理學獎。Patch clamp Erwin Neher Bert Sakmann 1944 1942膜片鉗技術(shù)是用尖端直徑12m的玻璃微電極吸管與經(jīng)蛋白酶處理干凈的細胞膜接觸，通過2030cm H2O的負壓吸引造成電極尖端與細胞膜形成高阻封接（10100G），使電極尖端下的小塊膜片與膜的其它部分在電學上絕緣，并在此基礎上固定膜片電位，監(jiān)測幾個m2膜片上13個離子通道活動的方法。 膜片鉗技術(shù)可用一根玻璃微電極同時完成膜片（或全細胞）電位的監(jiān)測、鉗制及通道電流的記錄。 膜片鉗技術(shù)具有1pA的電流分辨率，10 s的時間分辨率和1 m2 的空間分辨率

14、，使其成為在活體細胞上進行電生理學研究的重要手段。 隨著該技術(shù)的逐漸完善及應用，目前已成為從功能角度探討各種生理、病理生理及藥物作用機制最直接、最理想的電生理學研究方法，也為多學科探討生命活動規(guī)律、疾病與轉(zhuǎn)歸機理及藥物作用等細胞和分子水平的研究，開辟了廣泛前景。 3、膜片鉗記錄的模式 根據(jù)研究需要及記錄膜片的不同，膜片鉗記錄可形成以下四種基本模式 1.細胞貼附式（cell attached patch） 2.內(nèi)面向外式（inside-out patch） 3.外面向外式（outside-out patch） 4.全細胞記錄式（whole cell recording） 4、膜片鉗實驗系統(tǒng)的組建

15、 膜片鉗實驗系統(tǒng)雖然可因研究目的不同而有所區(qū)別，但其基本組成是相同的，包括膜片鉗放大器和接口，顯微鏡和視頻監(jiān)視器以及防震臺和屏蔽罩等。 視頻監(jiān)視器溫度控制系統(tǒng)倒置顯微鏡探頭微操縱器模數(shù)轉(zhuǎn)換器膜片鉗放大器數(shù)據(jù)采集及分析軟件計算機五、膜片鉗實驗方法 膜片鉗實驗方法包括：微電極的制備細胞標本的制備高阻封接的形成離子單通道電流的記錄或全細胞記錄 1、微電極的制備微電極是用拉制器由玻璃毛細管拉制而成。玻璃微電極的選材和拉制質(zhì)量直接影響封接電阻及記錄時的噪聲大小。 （1）選材 膜片鉗實驗用微電極可根據(jù)不同記錄模式選用不同的玻璃毛細管拉制。從玻璃毛細管材料方面,可分為軟質(zhì)玻璃和硬質(zhì)玻璃兩類。（2）拉制 膜片

16、鉗實驗用微電極與細胞外記錄和細胞內(nèi)記錄用微電極不同，其尖端較短，錐度較大，尖端直徑為15m，充灌林格氏液時阻抗約15M，因此一般采用兩步拉制法。第一步將玻璃軟化，拉出一個長710mm、直徑200400m的桿，第二步再從桿中央以較小電流拉出兩根尖端錐度較大的微電極。（3）處理 微電極拉制成功后，其尖端需進一步處理。這一過程包括涂硅酮樹酯（sylgard coating）和熱拋光（heat polish）。前者是將硅酮樹酯涂于微電極尖端以外部分，達到使浸入浴液中的微電極表面呈疏水性，減小電極內(nèi)部與溶液之間的電容。熱拋光是在顯微鏡下，將微電極尖端接近熱源（通電加熱的鉑絲或白金絲等），使電極尖端表面變

17、得更加寬闊和光滑，經(jīng)熱拋光處理的微電極可使高阻封接的成功率明顯提高。 （4）充灌 微電極使用前要充灌電極內(nèi)液，電極內(nèi)液需經(jīng)0.2m的濾膜或濾紙過濾。充灌時首先將電極尖端浸入電極內(nèi)液，利用虹吸作用使尖端部分充滿液體，然后再從電極尾端充灌。在充灌中應避免電極內(nèi)出現(xiàn)氣泡，如有氣泡可使電極尖端向下，輕敲管壁除去。也應避免充灌電極內(nèi)液太多，否則影響實驗噪聲基線。 2、細胞標本的制備除腦片膜片鉗和盲膜片鉗法之外，實驗所需標本均為具有生物活性的離體細胞，其來源包括急性分離、原代和傳代培養(yǎng)的細胞。從理論上來講，膜片鉗實驗用的細胞標本可來自體內(nèi)各種組織細胞，只要細胞表面光滑，能與微電極尖端形成高阻封接即可。但在

18、標本制備上，不同組織細胞間聯(lián)接牢固程度不同，采用的分離方法也不完全相同。大體上包括沖洗、酶解消化或機械分離以及清洗等步驟。3、高阻封接的形成 高阻封接形成與否是記錄細胞離子通道電流能否成功的前提，是進行膜片鉗實驗的關(guān)鍵一步。微電極尖端與細胞膜形成封接的過程，可以采用軟件或刺激器發(fā)出1mV脈沖電壓作用于微電極，造成膜兩側(cè)電位差發(fā)生變化，產(chǎn)生電極電流，再通過示波器或顯示屏，觀察電極電流幅度的變化來確定封接程度。在電極未入溶液之前，在顯示器或示波器上可見一直線。進行高阻封接時，需注意的是：在微電極未入液之前常施以正壓，防止浴液表面灰塵或溶液中粒子附著于電極尖端，影響高阻封接。電極尖端與細胞膜接觸，稍

19、加負壓后電流波形變得平坦，此時，如使電極超極化，則有助于加速形成高阻封接。電極入液后封接的成功率與入浴液后的時間呈反比，電極內(nèi)液中的肽類或蛋白質(zhì)成分也會有礙于封接形成。 4、離子通道電流的記錄 單通道電流記錄 離子單通道電流的記錄是膜片鉗技術(shù)的最大優(yōu)勢，當尖端直徑為1m的玻璃微電極與細胞膜形成高阻封接后，根據(jù)單通道電流的特征，很容易得到對某種離子有選擇性通透的單一的離子通道電流。由于單通道電流大小僅為1pA（10-12A）左右，要記錄到這一微小電流，除盡量降低膜片鉗系統(tǒng)噪聲及電極噪聲外，良好的高阻封接是獲得低噪聲記錄的先決條件。 全細胞電流記錄全細胞記錄是膜片鉗四種基本模式之一。盡管它記錄的是

20、細胞膜多個離子通道開放產(chǎn)生的宏膜電流，但由于該模式既可以對離子通道的性質(zhì)和分類進行宏觀性質(zhì)的分析，也可以對離子通道的構(gòu)造、分布與功能進行微觀性質(zhì)的分析，從而使其成為當前電生理研究中應用最廣泛的一種模式。全細胞記錄模式可用于測定在某個時間和電壓情況下，離子通道電流的大小，觀察其電壓依賴性特征，如以膜電位為橫座標，電流強度為縱座標，則可繪制出電流-電壓關(guān)系曲線（I-V曲線）。在電流為零時的膜電位被稱為反轉(zhuǎn)電位。 I-V曲線和反轉(zhuǎn)電位反映了某種通道的電壓依賴性及藥物等因素對通道電壓依賴性的影響，常作為全細胞記錄模式結(jié)果分析的指標之一。 鈉通道的激活是電壓門控的，當細胞膜去極化至-60mV左右時，即可

21、引起膜上大量鈉通道激活，產(chǎn)生一迅速激活并迅速失活的內(nèi)向電流，當去極化至-30 mV左右時達到最大，反轉(zhuǎn)電位為+30 mV左右。在參數(shù)設計上應使保持電位鉗制在-80 mV以下，此時給予不同程度的去極化階躍電壓，則可得到鈉電流，由于鈉通道激活和失活均很快，因此刺激脈沖波寬常為2050 ms。 鈉通道電流的測定 為證實所測電流為鈉電流，常借助于工具藥，如河豚素（TTX）用于細胞外液中，可以選擇性阻斷鈉通道。由于神經(jīng)與心臟中的鈉通道亞型不同。心肌鈉通道對TTX的敏感度比神經(jīng)低數(shù)百倍。 當膜電位鉗制在-80 mV，去極化中還可能引起某些鉀通道成分的激活，此時可使用鉀通道阻斷劑或?qū)㈦姌O液中KC1以CsC1

22、取代可起到抑制鉀通道激活的作用。 鈣通道電流的測定（1）L型鈣通道: 膜電位鉗制在-60 mV，這樣即較大程度的激活了L型鈣通道，又有效的抑制了鈉通道；激活與失活時間較長，因此去極化脈沖的保持時間在200500 ms之間；L型鈣通道的最大電流約在0+10 mV；反轉(zhuǎn)電位為+40+50 mV左右。 L型鈣通道除對二氫吡啶、Verapamil以及硫氮卓酮等鈣拮抗劑敏感外，對某些無機離子如Cd2+也很敏感，20M Cd2+就可使鈣通道活性抑制90%以上，常被用作全細胞膜片鉗實驗中的工具藥。值得注意的是，L型鈣通道電流測定時,可隨時間產(chǎn)生衰減,即所謂run-down現(xiàn)象。盡管許多學者進行了大量的研究，

23、但仍不能有效地防止這一現(xiàn)象，嚴重時在10分鐘之內(nèi)就可使鈣電流減少3050%。如不加以矯正，則直接影響結(jié)果的可靠性，尤其是給藥前后的對比，因此在實驗設計中，必須考慮到這一因素，并設立嚴格的對照組。（2）T型鈣通道: 激活所需的膜電位較低,通常為-100-60 mV。此差別常用來與L型鈣通道進行鑒別，如將膜電位鉗制在-40 mV時，去極化只能得到L型鈣電流，因T型通道已被完全抑制。 當有鈉通道和鉀通道拮抗劑存在時，膜電位被鉗制在-100 mV時，進行不同程度的去極化，所得到的內(nèi)向電流可分為兩種成分，即快速失活的T型鈣通道電流和緩慢失活的L型鈣通道電流。 T型鈣通道對雙氫吡啶類鈣拮抗劑均不敏感，Cd2+對其抑制也不明顯。（3）N型鈣通道則僅存在于神經(jīng)細胞和突觸部位，這種通道激活時，所需的膜電位與T型鈣通道相似，范圍在-100- 40mV。此型電流不能被二氫吡啶類鈣拮抗劑所抑制，但可被較低濃度的Cd2+所阻斷。-CTX是其具有相對特異性的拮抗劑。 鉀通道電流的測定鉀通道是亞型最多、分布最廣的一大類離子通道，現(xiàn)在已知并具有明確功能及動力學特性的鉀通道就有十多種，各種鉀通道亞型的特征電流不如鈉或鈣通道電流明顯，因此在研