《轉(zhuǎn)基因食品與安全》課件第五章 轉(zhuǎn)基因食品的檢測和分析

1、第五章 轉(zhuǎn)基因食品的檢測和分析轉(zhuǎn)基因食品的檢測和分析：是指對深加工食品和食品原料種的轉(zhuǎn)基因成分進行檢測。檢測主要針對其中的DNA、蛋白質(zhì)或脂肪酸等成分?；贒NA的檢測方法可分為兩類：DNA雜交法：Southern、Northern、Western基于PCR的檢測方法第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因陽性個體的分子鑒定一、PCR技術(shù)（一）標(biāo)準(zhǔn)PCR 1. 優(yōu)點 快速、靈敏、費用低，檢測僅需微量DNA，可同時檢測多個樣品。 PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR) 是體外快速擴增DNA的方法 。 PCR反應(yīng)包括三個步驟： 變性：在94-95使模板DNA的雙鏈變性成單鏈。

2、復(fù)性：兩個引物分別與單鏈DNA互補復(fù)性，復(fù)性的溫度在50-60 延伸：在引物的引導(dǎo)及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互補鏈 這三個步驟稱為一個循環(huán)，PCR反應(yīng)常有25-35個循環(huán)。2. 程序提取待測樣品DNA 設(shè)計引物、進行PCR PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測（1）提取DNA：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性（2）引物設(shè)計 外源DNA 目的基因啟動子： CaMV 35S終止子: Nos 大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物的啟動子是CaMV35s，來自花椰菜花葉病毒DNA，終止子為Nos，來自植物細菌，PCR檢測是對啟動子、終止子的檢測。（3）瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。 擴增條帶的分子量與理論上應(yīng)產(chǎn)生的

3、分子量相同，則說明被檢測對象的基因組中含有外源基因。例如：轉(zhuǎn)基因棉花選擇標(biāo)記基因NPTII編碼區(qū)段的PCR擴增結(jié)果（M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株） （二）定量PCR法可知樣品中含有多少量的外源基因。如：競爭性PCR技術(shù)。二、斑點印跡法 原位雜交：利用放射性或非放射性標(biāo)記的已知核酸探針，通過放射自顯影檢測特異DNA或RNA序列的一種技術(shù)，是一種直接、簡便的研究基因定位和表達的方法。提取DNA 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 以轉(zhuǎn)入基因的片斷作為探針 放射自顯影雜交概念：探針：用化學(xué)方法將有識別能力的物質(zhì)（如抗原、一段與目的基因互補的核酸序列）與酶或同位素結(jié)合成復(fù)合物

4、作為探針。固相載體：用于吸附生命大分子物質(zhì)的固體材料。印記：把經(jīng)凝膠電泳后的組分，通過吸附或電泳方法轉(zhuǎn)移或者直接吸附到固相載體上的過程。三、Southern 雜交提取DNA 內(nèi)切酶消化 瓊脂糖電泳 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 探針 雜交放射性自顯影如果膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會檢測到雜交帶信號。 Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。電泳Southern 雜交 1975 E. M. Southern 1977. J.C. Alwine 1

5、978. Hany Towbin 原位分子雜交 (In situ hybridization ) Southern blotNorthern blotWestern blotS.S. DNA S.S. DNA S.S. RNA S.S. DNAProtein (antigen ) antibodySouthern BlottingNorthern blotWestern Blotting FISH第二節(jié) 外源基因的表達 一、轉(zhuǎn)錄水平的檢測（一）Northern 雜交 是確定外源基因是否被轉(zhuǎn)錄的有效方法。 Northern印跡雜交（Northern blot）。是一種將RNA從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)印到

6、硝酸纖維素膜上的方法。 DNA印跡技術(shù)由Southern于1975年創(chuàng)建，稱為Southern印跡技術(shù)，RNA印跡技術(shù)正好與DNA相對應(yīng)，故被稱為Northern印跡雜交，與此原理相似的蛋白質(zhì)印跡技術(shù)則被稱為Western blot。Northern雜交是一種RNA-DNA雜交。 將提取的植物總RNA或mRNA用變性凝膠電泳分離，則不同的RNA分子將按分子量大小依次排布在凝膠上； 將它們原位轉(zhuǎn)移到固相膜上；在適宜的離子強度及溫度條件下，用探針與膜雜交； 然后通過探針的標(biāo)記性檢出雜交體。Northern雜交/v_show/id_XMTQ1NDg1NDcy.html（二）RTPCR RT-PCR

7、為反轉(zhuǎn)錄RCR或?qū)崟rPCR共同的縮寫，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。二、翻譯水平的檢測 可以檢測具有抗原性蛋白類表達產(chǎn)物的存在。（一）免疫檢測技術(shù) 1. Western雜交 是將蛋白質(zhì)電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異蛋白測定法。 從轉(zhuǎn)基因植物中提取總蛋白質(zhì)，經(jīng)純化處理后，進行SDS(十二烷基磺酸鈉)聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)按分子量大小分離，將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，按特定的程序與抗體雜交，對雜交結(jié)果進行檢測便可得知被檢植物組織內(nèi)目的蛋白表達與否及其表達量。Western雜交加入特

8、異性抗體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結(jié)合后，再加入能與一抗結(jié)合的帶標(biāo)記的二抗，最后通過二抗上帶標(biāo)記化合物（一般為辣根過氧化物酶）的特異性反應(yīng)進行檢測?？贵w（Antibody，Ab）： 是高等動物體在抗原刺激下產(chǎn)生的一類 能與抗原特異結(jié)合的活性物質(zhì)?？贵w具有雙重性（它既是抗體又是抗原），即抗體又可以作為抗原。 一種抗體作為抗原刺激機體產(chǎn)生的新抗體叫抗抗體。Western 雜交 提取待測樣品蛋白質(zhì) SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 蛋白質(zhì)印跡（將蛋白質(zhì)由凝膠轉(zhuǎn)移至固相膜上） 制備探針雜交與檢出2. ELISA法 （酶聯(lián)免疫吸附法）原理：將抗原或抗體用小分子的標(biāo)記劑如熒光素、酶、放射性同位素等

9、加以標(biāo)記，借以提高其靈敏度的一類新技術(shù)。 ELISA是一種免疫測定。加入反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進行定性或定量分析。優(yōu)點：快速、方便、重復(fù)性好。缺點：只能對某一特定蛋白進行檢測。間接免疫吸附測定法： 已知抗原吸附在微孔板內(nèi) 加待檢抗血清（含抗體） 加酶聯(lián)抗抗體，與已吸附的抗原抗體復(fù)合物相結(jié)合 加入該酶底物 反應(yīng)終止后依底物顏色深淺，可知樣品中抗體的含量。雙抗體夾心法原理酶標(biāo)板（ 96孔聚苯乙烯微孔板）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）雙抗體夾心法 ： 是測定待測樣本中是否含有抗原的方法：1） 將含已知抗體的抗血清吸附在微孔板上，形成固相抗體。

10、2） 加待測抗原，保溫反應(yīng)。形成固相抗原抗體復(fù)合物。3） 加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過比色，測知標(biāo)本中抗原的量。 樣品中土霉素的ELISA檢測 樣品 1 2 3 4 5 CK OD 1.91 1.45 1.96 1.48 1.03 2.74 OTC量 0.056 0.457 0.021 0.109 2.952 （二）生物化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性分析通過定性和定量測定表達產(chǎn)物的生物化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)活性，以鑒定表達產(chǎn)物的存在。如: 酶活力測定，受體蛋白分析，激素活性的檢測。轉(zhuǎn)基因棉花飼喂棉鈴蟲時被食用情況（左圖為轉(zhuǎn)基

11、因抗蟲棉，右圖為非轉(zhuǎn)基因棉） 第三節(jié) 基因芯片技術(shù)基因芯片：指將大量的靶基因或寡聚核苷酸片段通過機械手有序的、高密度的排列在玻璃、硅或尼龍膜上，制成芯片。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法待測樣品的制備食品中DNA的提取食品中核酸的定量轉(zhuǎn)基因食品PCR檢測體系引物的設(shè)計定性定量PCR擴增反應(yīng)結(jié)果分析傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因食品檢測方法的缺點血清學(xué)和PCR檢測技術(shù)在大部分情況下一次實驗只能檢測一種目標(biāo)分子，并且檢測過程復(fù)雜，效率較低。生物芯片（biochip）也稱微列陣（microarray）,就是在一塊玻璃片、硅片、尼龍膜等材料上放上生物樣品，然后由一種儀器收集信號，用計算機分析數(shù)據(jù)結(jié)果。生物芯片技術(shù)是隨著人類基因

12、組計劃（HGP）的進展而發(fā)展起來的，它是90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一，它融微電子學(xué)、生物學(xué)、物理學(xué)、化學(xué)、計算機科學(xué)為一體的高度交叉的新技術(shù)，具有重大的基礎(chǔ)研究價值，又具有明顯的產(chǎn)業(yè)化前景。生物芯片的種類 生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。 所有的生物芯片技術(shù)都包含四個基本要點：芯片的制作、雜交或反應(yīng)、測定或掃描、數(shù)據(jù)處理。生物芯片的技術(shù)核心是芯片的制備及反應(yīng)信號的檢測。 基因芯片基因芯片，又稱DNA芯片，包括寡聚核苷酸芯片和cDNA芯片。理論基礎(chǔ)是雜交測序，即利用核酸雜交的原理檢測未知

13、分子。在硅膠、玻片等固相載體上按特定排列方式固定大量核酸探針或基因片段，與標(biāo)記的待檢測樣品進行雜交，通過檢測標(biāo)記物信號得到雜交結(jié)果，利用計算機分析從而獲得大量信息?；蛐酒瑱z測原理 cDNA芯片可以檢測待測樣品中是否有與之互補的序列。 將待測樣品中的mRNA被提取后，通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程獲得標(biāo)記熒光的cDNA，與包含上千個基因的cDNA微陣列進行雜交反應(yīng)16h后，將玻片上未互補結(jié)合反應(yīng)的片段洗去，再對玻片進行激光共聚焦掃描，測定微陣列上各點的熒光強度，推算出待測樣品中各種基因的表達水平。轉(zhuǎn)基因食品的檢測： 把現(xiàn)有的轉(zhuǎn)入作物體內(nèi)的基因片斷制成芯片 提取待測植物的RNA 在反轉(zhuǎn)錄中標(biāo)記cDNA 與檢測芯片雜交 分析結(jié)果特點： 機械化程度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但檢測成本高，對技術(shù)要求較高。 該技術(shù)在轉(zhuǎn)基因食品檢測中有廣闊的前景。Western 雜交原理 從生物細胞中提取目的蛋白，將蛋白質(zhì)樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中