人源重組蛋白藥物安全性評價的思考

1、人源重組蛋白藥物安全性評價的思考從上世紀(jì)后半期開始，隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，生物制藥（biopharmaceuticals）行 業(yè)在世界范圍內(nèi)呈現(xiàn)出蓬勃興起的態(tài)勢，為多種疾病開辟了新的治療途徑。重組人干擾素（rhuIFN）、重組人白介素（rhuIL）、重組人胰島素（Insulin）和重組人促紅細(xì)胞生成素 （rhuEPO）等均已于上世紀(jì)末在國內(nèi)上市。與生物技術(shù)藥物研發(fā)高潮相呼應(yīng)的是，近年來 進(jìn)入臨床前安全性評價的該類新藥亦逐年遞增，但回顧多種重組蛋白/多肽的安全性研究， 都或多或少受了小分子化學(xué)藥物毒理學(xué)評價體系的影響，而忽視了重組蛋白的獨(dú)特屬性。 體外合成的人用重組蛋白/多肽在分子構(gòu)成、

2、藥效學(xué)機(jī)制和體內(nèi)代謝途徑等方面與化藥的不 同之處已有多篇文獻(xiàn)述及，新藥非臨床研究領(lǐng)域?qū)χ阎饾u形成了“具體問題具體分析（case by case）”的安評原則。筆者通過國內(nèi)外研究進(jìn)展，結(jié)合近年來在工作中遇到的問題，對該 類新藥安全性評價中的難點(diǎn)和疑點(diǎn)作如下探討。動物種屬/模型的選擇雖然動物體內(nèi)的許多受體對存在部分差異的人源性配 體有一定的寬容性，可與之結(jié)合并激活下游信號（如huEPO、huIL-1和huIL-1ra），但許多 生物技術(shù)藥物仍有一定的種屬特異性，其生物活性需在特定種屬的動物體內(nèi)才能體現(xiàn)，在化 藥毒理學(xué)研究中常用的Beagle犬和SD大鼠未必是最適宜的試驗動物：重組人生長因子-集

3、落刺激因子融合蛋白在猴和犬試驗中表現(xiàn)出毒性差異1； rhuEPO則在人、猴和大鼠體內(nèi)表 現(xiàn)出不同的生物利用度特點(diǎn)2。某一重組蛋白受試物的相關(guān)動物可通過其藥效學(xué)資料或同 類產(chǎn)品的毒理學(xué)資料獲得，但當(dāng)上述資料缺乏時，則需在毒性試驗開始前通過體內(nèi)（in vivo） 和/或體外（in vitro）途徑來證實(shí)受試物的生物活性，如我實(shí)驗室利用血糖測試儀證實(shí)重組 人胰島素可在SD大鼠體內(nèi)引起明顯的血糖下降、rhuIFN則在非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero）、犬 腎細(xì)胞（MDCK）和幼倉鼠腎細(xì)胞（BHK）顯示出抗單純皰疹病毒（SHV）的生物活性， 據(jù)此，我們分別應(yīng)用SD大鼠和食蟹猴完成了上述兩種新藥的毒理學(xué)研究。當(dāng)沒

4、有試驗數(shù)據(jù) 或文獻(xiàn)來支持某一受試物在所用實(shí)驗動物體內(nèi)的生物活性時，得出的“無毒”或“低毒”結(jié) 果更值得推敲，因為這種結(jié)果有可能是因受試物在動物體內(nèi)的生物利用度過低或根本無效所 導(dǎo)致的。給藥劑量的設(shè)置多數(shù)情況下實(shí)驗動物可耐受最大給藥量的重組蛋白，因此在 生物藥物安評早期，為避免藥審機(jī)構(gòu)的質(zhì)疑，往往將高劑量組設(shè)為最大給藥量來實(shí)現(xiàn)高暴露 量。為恰當(dāng)?shù)伢w現(xiàn)藥物的毒性作用、避免不必要的浪費(fèi)（該類新藥的生產(chǎn)成本較高），劑量 設(shè)置應(yīng)建立在對藥物活性機(jī)制充分認(rèn)識的基礎(chǔ)上：給藥途徑與分子量因胃腸道的酶活性和粘膜對水溶性大分子的吸收屏障作 用，重組蛋白類藥物通常不用口服途徑3。靜脈注射可保證受試物以最大濃度進(jìn)入生

5、物系 統(tǒng)，而經(jīng)皮注或肌注的受試物進(jìn)入血液循環(huán)的數(shù)量受制于其分子量：16KDa以上的大分子 主要被淋巴系統(tǒng)吸收，小于1KDa的則主要吸收入血液4。受試物與動物細(xì)胞的親合力及結(jié)合的可飽和性受試物只有在與其受體結(jié)合 后才能發(fā)揮藥效及與藥效相關(guān)的毒性反應(yīng)，當(dāng)受試物在相關(guān)動物體內(nèi)或來源于該種動物的體 外培養(yǎng)細(xì)胞上的親和力明顯低于人體細(xì)胞時，有必要通過增加給藥量來彌補(bǔ)暴露量的不足 5。某些受體的數(shù)量和分布有限，如EPO受體（EPOR）只存在于骨髓中的紅系細(xì)胞表面， 與EPO結(jié)合、啟動生紅細(xì)胞過程后，EPO-EPOR復(fù)合體被細(xì)胞內(nèi)化，并在溶酶體中降解6,7， 有研究表明rhuEPO在大鼠骨髓中的內(nèi)化-清除過

6、程是可飽和的8。因此，當(dāng)大量給予受體 能力有限的按受試物如促血小板生成素（TPO）9、IFN10以及白血病抑制因子11并 不能通過增強(qiáng)其生物活性來體現(xiàn)毒副反應(yīng)。受試物濃度對受體數(shù)量的影響血循環(huán)中的胰島素濃度越高，則肝、脂肪、肌 肉和血細(xì)胞的胰島素受體數(shù)目越少。胰島素濃度過高時可加速受體損失，造成原有糖代謝的 紊亂。在我實(shí)驗室完成的重組人胰島素（rhu-Ins）大鼠毒性試驗中，首次給予（s.c）120、60、20 u/kg體重rhu-Ins后在大鼠體內(nèi)降血糖的速度相似（均在給藥后55 min降至2.32.6 mmol/L）,多次給予（s.c） 50、20、8 u/kg體重rhu-Ins后，高劑量

7、組大鼠出現(xiàn)血糖紊亂（高 于20 mmol/L），并在禁食后出現(xiàn)死亡；8 u/kg rhu-Ins則在穩(wěn)定降血糖的同時不影響糖代謝， 且無不良反應(yīng)。由此可見，在50 u/kg可產(chǎn)生明顯的生物活性及其相關(guān)毒性時，沒有必要將 給藥量增至120 u/kg。人源蛋白在試驗動物體內(nèi)的免疫原性（immunogenicity） 種間差異決定了人 用重組蛋白/多肽與實(shí)驗動物體內(nèi)的同源蛋白存在不同程度的序列和構(gòu)象差異，即使是在多 種動物間有著較高保守性的EPO（人與大鼠EPO成熟肽的保守性為82%，人與猴之間有92% 的氨基酸相似性），仍可被其它種屬動物的免疫系統(tǒng)識別而誘生抗體（包括中和抗體）12-14， 這種由

8、受試物異源性引起的體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答將從不同方面影響生物藥物的臨床前安 全性評價：與藥效學(xué)無關(guān)的毒副反應(yīng)包括免疫相關(guān)組織的增生、抗藥物抗體（anti-drug antibodies, ADA）引起的免疫復(fù)合物沉積、ADA與相應(yīng)內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)引起的自身 免疫疾病、以及細(xì)胞免疫應(yīng)答導(dǎo)致的局部組織損傷等“新毒性效應(yīng)”。重組人酸性成纖維細(xì) 胞生長因子（rhaFGF）連續(xù)28 d涂抹家兔破損皮膚后發(fā)現(xiàn)免疫器官有明顯病理學(xué)改變15； 我實(shí)驗室完成的一項含血凝因子伽的生物膠在多次經(jīng)腹腔注射給予大鼠后，其脾臟發(fā)生顯著 增生（包括重量增加和組織形態(tài)學(xué)變化）；促血小板生成素抗體經(jīng)交叉反應(yīng)引起的血小板減

9、少癥、rhuEPO抗體致貧血及huGM-CSF抗體致肺泡內(nèi)蛋白沉積也已見諸報道12,16-18?？贵w性質(zhì)的鑒定越來越多的毒理學(xué)工作者已認(rèn)識到免疫原性對毒性評價的 意義，在試驗中通過監(jiān)測動物血清中的ADA來闡明受試物的免疫原性，但這里存在一個誤 區(qū)，即結(jié)合抗體和中和抗體概念的混淆，用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）得出的結(jié)合抗體（ADA）效價常被作為中和抗體滴度。事實(shí)上ADA中只有一部分為中和性抗體，它通過特 異性結(jié)合藥物的受體結(jié)合位點(diǎn)而阻斷藥物的生物學(xué)活性。中和抗體滴度須通過專門的生物活 性檢測手段來體現(xiàn)，如rhuIFN中和抗體可削弱rhuIFN在體外培養(yǎng)細(xì)胞上的抗病毒作用19； rhuIL-1

10、中和抗體可削弱rhuIL-1在體外培養(yǎng)小鼠胸腺淋巴細(xì)胞上的促增殖作用；rhuEPO中 和抗體則可降低EPO依賴性細(xì)胞HCD57 （+）的生長速率。重復(fù)給藥毒性試驗中檢測到的 ADA并不是中斷給藥的合理依據(jù)，除非能證實(shí)其中含有能中和藥物藥理和/或毒理作用的中 和抗體5。對毒代動力學(xué)（Toxicokinetics, TK）和藥效學(xué)結(jié)果的影響 中和性ADA可通 過加快藥物清除速率或屏蔽藥物的受體結(jié)合位點(diǎn)來改變TK和藥效學(xué)參數(shù)20，削弱頻繁給 藥可能導(dǎo)致的毒副反應(yīng)頻率和嚴(yán)重程度、掩蓋蓄積毒性。非中和抗體卻可能延長藥物在體內(nèi) 的半衰期21。忽視了這一點(diǎn)而將試驗結(jié)果直接外推到臨床人體試驗將帶來更大危害。免

11、疫原性結(jié)果在毒理學(xué)研究中的意義 免疫應(yīng)答檢測已成為毒理學(xué)評價中不 可回避的環(huán)節(jié)22-23，但其目的并不是將結(jié)果簡單地外推到人體反應(yīng)，而是當(dāng)出現(xiàn)“無毒性 反應(yīng)”或與藥理作用明顯無關(guān)的“新毒性效應(yīng)”時，免疫原性可用于對最終評價結(jié)果進(jìn)行合 理和必要的補(bǔ)充說明，以此為依據(jù)來判斷是否要進(jìn)行更深入的無免疫原性干擾的毒理學(xué)研 究，如利用對受試物無免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物或動物體內(nèi)的受試物同源蛋白來進(jìn)行毒性研究 24-26。毒代動力學(xué)（TK）研究 為評價重組蛋白在動物體內(nèi)的暴露（Exposure）水平， ICH建議在重復(fù)給藥毒性試驗中進(jìn)行藥物代謝動力學(xué)和毒物代謝動力學(xué)研究。我國學(xué)者袁守 軍認(rèn)為，重復(fù)給藥毒性評價結(jié)

12、合TK研究的直接好處包括：（1）實(shí)驗動物的選擇；（2）實(shí)驗動 物體內(nèi)藥物暴露狀況；（3）長期毒性試驗劑量設(shè)置合理性判斷；（4）藥物代謝酶誘導(dǎo)判斷；（5） 指導(dǎo)毒理學(xué)評價中檢測指標(biāo)的設(shè)置；（6）判斷所謂“低毒性或無毒性藥物”可靠性；（7）也能 滿足當(dāng)前新藥申報的要求，但“國內(nèi)尚沒有看到TK研究在藥物安全評價中指導(dǎo)評價研究設(shè) 計的報告” 27。包括重組蛋白在內(nèi)的生物技術(shù)藥物的TK研究歷史不長且極少見到28, 將是另一個與小分子化藥或中藥單體藥TK研究所不同的廣闊天地。給藥次數(shù)與TK參數(shù)測定的關(guān)系 在單次給藥或重復(fù)給藥試驗的首次，動物體 內(nèi)沒有針對受試物的ADA，根據(jù)不同的給藥方式，除少部分受試物被

13、抗原遞呈細(xì)胞捕獲并 加工外，其它應(yīng)以正常的速度到達(dá)各靶細(xì)胞上的受體上。但在多次給藥且體內(nèi)已有ADA存 在時，受試物將首先與循環(huán)血中的ADA結(jié)合，其與受體結(jié)合及從血漿中清除的速度在很大 程度上取決于血液中的抗體量和抗體的（非）中和性。因此，在進(jìn)行TK研究前，應(yīng)有充分 的藥效學(xué)和免疫學(xué)預(yù)試資料來支持試驗方案。而在檢出ADA后，應(yīng)以TK參數(shù)來說明生物 利用度的改變，以此作為試驗繼續(xù)或中止的依據(jù)。重組蛋白TK分析技術(shù)高效液相色譜（HPLC）及其衍生技術(shù) 高靈敏性和選擇性的HPLC或色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS/MS）在化學(xué)藥、中藥單體成分和小肽類物質(zhì)的藥代研究或蛋白 質(zhì)的氨基酸分析中發(fā)揮了重要

14、作用（王文艷等，2006；劉莎 等，2006），但從其工作原理 來看，并不適合以完整大分子形式發(fā)揮生物學(xué)活性的重組多肽藥物的TK分析。酶聯(lián)免疫吸附方法（ELISA） 該法基于重組蛋白分子的免疫學(xué)活性，多通過 雙抗體夾心法、即“固著于固相載體上的捕獲抗體-待測血漿-特異性抗體-酶標(biāo)或熒光標(biāo)記的 第二抗體”這一 ELISA過程來滴定血漿中的重組蛋白含量。此法因高度特異性、精確性及 相對簡便的操作而被廣泛用于生物產(chǎn)品的定量。但是基于抗原表位特異性的ELISA法并不 能區(qū)別已降解/變性的無活性蛋白質(zhì)和具生物活性的天然蛋白質(zhì)29,30，而將凡是具有該表 位并可結(jié)合在捕獲抗體上的蛋白分子或多肽片段均視作完

15、整的分子。由此可見，蛋白質(zhì)的免 疫反應(yīng)性并不能完全代表其生物活性的質(zhì)和量。熒光偏振免疫分析法（FPIA） 該法依據(jù)熒光標(biāo)記抗原和其抗原抗體結(jié)合物 之間熒光偏振程度的差異，用競爭性方法直接測量生物樣本中受試物分子的含量。熒光標(biāo)記 的小分子抗原在溶液中旋轉(zhuǎn)速度快，熒光偏振光強(qiáng)度小，當(dāng)與相應(yīng)抗體結(jié)合后，所形成的大 分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度變慢，熒光偏振光強(qiáng)度增大。作為一種均相標(biāo)記免疫分析技術(shù)，F(xiàn)PIA 具有顯著的優(yōu)點(diǎn)之一是樣品分子的測定在溶液中進(jìn)行，避免了固相標(biāo)記過程中反復(fù)多次的洗 滌步驟，實(shí)現(xiàn)自動化控制和高通量分析31。但這種方法更適于小分子量的抗原，如苯巴 比妥、丙米嗪、甲狀腺素和黃體脂酮等，且仍存

16、在如ELISA 一樣的多肽片段帶來的干擾。放射免疫分析法（RIA） 有學(xué)者將放射性同位素外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)于目標(biāo)蛋白的氨 基酸，通過RIA來定量重組蛋白的血漿濃度和組織分布28，但該法須在證實(shí)“放射標(biāo)記的 受試物質(zhì)仍保持了與非標(biāo)記物質(zhì)相當(dāng)?shù)幕钚院蜕飳W(xué)性質(zhì)” 5的前提下進(jìn)行，同時也存在“脫鹵”或因放射性鹵素通過代謝摻入內(nèi)源蛋白中而影響檢測結(jié)果的可能32,33，因此，ICH 在生物技術(shù)藥物的臨床前安全性評價指導(dǎo)原則中也明確指出，“解釋特定的放射性示蹤氨基 酸試驗時應(yīng)謹(jǐn)慎，因為氨基酸可進(jìn)入與藥物無關(guān)的蛋白質(zhì)或多肽的再循環(huán)” 5。結(jié)語重組蛋白類藥物是模擬人體蛋白質(zhì)在體外培養(yǎng)細(xì)胞中合成的分子，與化學(xué)合成藥相比

17、，是一 種歷史較短的藥物。最初人們認(rèn)為既然該類藥物源自人體，就應(yīng)該是安全的，但事實(shí)并非如 此。雖然國內(nèi)外藥審機(jī)構(gòu)針對這類新藥頒布了一系列臨床前研究指導(dǎo)原則，但具體研究方案 仍需要針對受試物特性來制定，廣大毒理學(xué)工作者在多年實(shí)踐中不斷深化和完善著這一領(lǐng)域 的研究，為人類的安全用藥做出了不朽的貢獻(xiàn)。參考文獻(xiàn)Keller P, Smalling R. Granulocyte colony stimulating factor: animal studies for risk assessment. Int Rev Exp Pathol, 1993, 34 Pt A: 173-88Woo S, Jus

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