乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法學驗證

1、.1學 號：畢業(yè)論文GRADUATETHESIS論文題目：乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法學驗證學 院：專 業(yè)：班 級：姓 名：指導教師：2021年10月31 日目 錄畢業(yè)論文 TOC o 1-3 h u HYPERLINK l _Toc31288 學 號： PAGEREF _Toc31288 1 HYPERLINK l _Toc10896 乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法學驗證 PAGEREF _Toc10896 3 HYPERLINK l _Toc1660 中 文 摘 要 PAGEREF _Toc1660 3 HYPERLINK l _Toc31030 前 言 PAGEREF

2、_Toc31030 5 HYPERLINK l _Toc29150 1. 材料與方法 PAGEREF _Toc29150 5 HYPERLINK l _Toc23117 1.1 試劑盒 PAGEREF _Toc23117 5 HYPERLINK l _Toc15252 1.2 儀器 PAGEREF _Toc15252 5 HYPERLINK l _Toc8614 1.3 方法 PAGEREF _Toc8614 5 HYPERLINK l _Toc2189 2. 結(jié)果 PAGEREF _Toc2189 7 HYPERLINK l _Toc17462 2.1 標準曲線與線性圍 PAGEREF _T

3、oc17462 7 HYPERLINK l _Toc19728 2.2 準確度回收率的驗證 PAGEREF _Toc19728 8 HYPERLINK l _Toc6197 2.3精細度的驗證 PAGEREF _Toc6197 9 HYPERLINK l _Toc25162 2.4 檢測限LOD計算 PAGEREF _Toc25162 12 HYPERLINK l _Toc4275 3. 討論 PAGEREF _Toc4275 13 HYPERLINK l _Toc12892 3.1 乙肝外表抗原定量分析的意義 PAGEREF _Toc12892 13 HYPERLINK l _Toc105

4、3.2 常用定量分析方法 PAGEREF _Toc105 13 HYPERLINK l _Toc4120 3.3 方法概述 PAGEREF _Toc4120 14 HYPERLINK l _Toc31411 3.4 方法學驗證容 PAGEREF _Toc31411 14 HYPERLINK l _Toc6236 4. 結(jié)果分析及應用評價 PAGEREF _Toc6236 15 HYPERLINK l _Toc26534 參考文獻 PAGEREF _Toc26534 16 HYPERLINK l _Toc32484 綜 述 PAGEREF _Toc32484 17 HYPERLINK l _To

5、c28680 致 PAGEREF _Toc28680 18.1乙肝外表抗原的ELISA法定量分析方法學驗證摘 要目的：隨著免疫學技術(shù)的不斷開展,抗原抗體檢測靈敏度不斷提高,使得乙肝病毒低水平的檢測成為了可能，本實驗就是對酶聯(lián)生物生產(chǎn)的乙肝外表抗原的ELISA法定量分析試劑盒進展方法學驗證，以判斷該試劑盒是否能用于臨床低濃度樣本的定量分析。方法：HBsAg的ELISA法定量分析，用濃度為8ng/ml標準品溶液做2倍稀釋的6個濃度梯度做標準曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復孔做準確度，精細度和檢測限等方法學驗證。結(jié)果：標準曲線R2=0.9979，顯示具有良好的相關(guān)性；檢測限為LOD

6、為0.167ng/ml；準確度99.03%，準確度好；板精細度和板見精細度方面都表現(xiàn)在低濃度樣品1.5ng/ml的檢測低于高濃度樣品，重復性差。故不適合低濃度樣品的檢測。結(jié)論：由于該試劑盒在低濃度樣本測量上的精細度差，故該公司生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不可以用于臨床生物低濃度樣品的分析。關(guān)鍵詞HBsAg ELISA 定量分析 方法學驗證.1The reification of the HBsAg ELISA quantitative methodologyAbstractObject: With the continuous development of immunology

7、 and technology, increasing antigen antibody detection sensitivity, makes the detection of low hepatitis b virus，to verify the quantitative methodology of Shanghai enzyme linked Biological Technology to make sure whether it ca be used to the analysis of Clinical Sample. Methods: ELISA quantitative m

8、ethodology , make an Application of the standard HBsAg kit from the concentration of 8 ng/ml do 2 times diluted si* concentration gradient to constitute a standard curve, testing With 6, 3, 1.5 ng/ml 3 a concentration gradient 5 accurately precise and detection .Results: R2 = 0.9979, standard curve

9、showed good correlation; Detection limit for LOD is 0.167 ng/ml; 99.03% accuracy, good accuracy; Precision and precision of the plate in the plate has performance in low concentration sample ( 1.5 ng/ml) detection is lower than the high concentration samples, poor repeatability. So is not suitable f

10、or detection of low concentration samples. Conclusion: Because the kit on the low concentration sample measurement precision is poor，so the ELISA quantitative analysis kit of HBsAg cannot be used for the analysis of Clinical Sample.Key words:HBsAg; Quantitative analysis; Verification; Methodology.1乙

11、肝外表抗原的ELISA法定量分析方法學驗證前 言根據(jù)流行病學調(diào)查,我國人群乙型肝炎病毒感染率為10%左右,乙型肝炎病毒(HBV)感染是最常見的傳染病之一。實驗室診斷乙型肝炎對其治療和預防有重要的參考意義而HBsAg是乙肝病毒感染最早的血清標志物,因此乙肝外表抗原檢測是一個重要的乙型肝炎病毒感染的診斷的依據(jù)。隨著免疫學技術(shù)的不斷開展,抗原抗體檢測靈敏度不斷提高,使得乙肝病毒低水平的檢測成為了可能,對于臨床診斷和流行病學具有重要意義1。ELISA方法具有靈敏度高、特異性強、重復性好和定性測定的優(yōu)點,可以在酶免疫分析儀進展批量檢測。目前臨床上多傾向于做定量分析，假設(shè)想得到準確的檢驗結(jié)果，必須要經(jīng)過實

12、驗室的驗證，本實驗對酶聯(lián)生物生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進展準確度，精細度和檢測限等方法學驗證，現(xiàn)將實驗結(jié)果報告如下：材料與方法1.1 試劑盒乙肝外表抗原ELISA法定量分析試劑盒，酶聯(lián)生物出品。1.2 儀器 酶標儀：EL*800光吸收酶標儀；洗板機：DN*-9620A電腦洗板機；超純水系統(tǒng)：Millipore Eli* ；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)精宏實驗設(shè)備；振蕩器管械，KJ-201A；移液器；Tip頭；EP管。1.3 方法1.3.1溶液配置 磷酸緩沖液的配備:稱取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml

13、蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，最后加蒸餾水定容至1L即可。在15lbf/in2(1034105Pa)標準品的配備：原始標準品濃度為8 ng/ml。取6支2 mlEP管，分別標記為A1-A6。50ul/well, 共1孔需50ul，每孔配置60ul留作備用，稀釋方案詳見表一。編號終濃度 ng/ml預加磷酸緩沖液標記取ul剩余ulA180標準品12060A2460A16060A3260A26060A4160A36060A50.560A46060A60.2560A56060表一 標準品的稀釋方案質(zhì)控品的配置：50ul/well, 共5復孔需250ul，配置300ul留作備用，取3支2m

14、lEP管，分別標記為C1，C2，C3，質(zhì)控品稀釋方案見表二。編號終濃度 ng/ml預加磷酸緩沖液標記取ul剩余ulC16150標準品450300C23300C1300300C31.5300C2300300表二 質(zhì)控品的稀釋方案1.3.2鋪板方案 取出試劑盒中已包被酶標板，取出板條，在相應孔中依次參加系列標準品、質(zhì)控品及空白對照，每孔50ul?？瞻讓φ諈⒓恿姿峋彌_液緩沖液。鋪板方案見表三。序號標準品質(zhì)控1質(zhì)控2質(zhì)控3空白組1A1C1C2C3磷酸緩沖液2A2C1C2C3磷酸緩沖液3A3C1C2C3磷酸緩沖液4A4C1C2C3磷酸緩沖液5A5C1C2C3磷酸緩沖液6A6表三 鋪板方案1.3.3加樣步

15、驟 參加酶標抗體，50 ul/well，震蕩。37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min，取出后洗板4次， 參加A、B液, 50 ul/ well，37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15 min。參加終止液，50 ul/ well。酶標板放入酶標儀，蓋上蓋子，在電腦上翻開Microplate Manager 5.2軟件，選擇450nm波長參照波長630nm，設(shè)置layout和報告模式，測定各孔吸收值。結(jié)果2.1 標準曲線與線性圍序號123456HBsAg(ng/ml)84210.50.25吸光度值1.670.990.630.400.310.26表四 標準品理論濃度對應的實測OD值以標準品實際濃度為橫坐標，所測吸光度

16、值值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關(guān)系，結(jié)果顯示R2=0.998，顯示具有良好的相關(guān)性。表五 標準曲線2.2 準確度回收率的驗證質(zhì)控品理論稀釋濃度對應實測濃度值見表六。HBsAg(ng/ml)1234566.514.945.676.086.1233.573.073.293.082.951.51.271.361.541.211.59表六 實測濃度值質(zhì)控品做了3個濃度梯度，每個濃度做了5個復孔，見表七。HBsAg(ng/ml)測定值ng/ml回收率%平均回收率RR%3個濃度的平均回收率66.51108.597.7299.03%4.9482.35.6794.56.08101.36.12102.0

17、33.57119.0106.403.07102.33.29109.73.08102.72.9598.31.51.2784.792.961.3690.71.54102.71.2180.71.59106.0表七 回收率結(jié)果顯示HBsAg 6ng/m的平均回收率為97.72%，3ng/ml的平均回收率為106.40%和1.5ng/ml的平均回收率為92.96%，滿足限度要求在85%-115%的圍，3個濃度梯度的平均回收率為99.03%，顯示準確性好。2.3精細度的驗證2.3.1板內(nèi)精細度的驗證HBsAg(ng/ml)12345RSD(%)66.514.945.676.086.125.860.6010

18、.2433.573.073.293.082.953.190.247.521.51.271.361.541.211.591.390.1712.23表八 板內(nèi)精細度測定值表八中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標準偏差，也就是變異系數(shù)CV值，HBsAg 6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為10.24%，1.5ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.23%，顯示孔間差異較大，精細度不高，但是符合ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求，其中有一孔濃度為4.94和1.21，與其它孔比較差異較大，可能是由于操作不當引起。而3ng/ml的變異系數(shù)CV為7.52%，符合顯示孔間重復性好，符合ng/ml級

19、RSD水平的一般應15%的要求，精細度高。2.3.2板間精細度的驗證從同一實驗室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù)，做板間精細度驗證。HBsAg(ng/ml)84210.50.25第二組OD 值1.981.420.860.580.400.31第三組OD 值1.310.770.360.170.090.03表九 實測OD值以標準品實際濃度為橫坐標，所測吸光度值值為縱坐標作圖，繪制標準曲線觀察線性關(guān)系。表十 標準曲線以上標準曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2=0.967，第三組數(shù)據(jù)R2=0.991。第三組有一些數(shù)據(jù)偏差較大，但考慮到隨機抽樣和人為操作的偏差在，還是可以應用到統(tǒng)計分析中。下面對3組數(shù)據(jù)做板間分析。HBsA

20、g(ng/ml12345RSD(%)66.234.555.736.086.396.040.559.106.105.786.086.646.845.995.396.346.495.9633.363.283.553.283.473.060.3712.063.362.933.533.072.992.592.712.812.492.521.51.241.271.171.161.191.340.2316.781.461.501.731.711.761.191.241.251.211.11表十一 板間精細度測定值 從表十一中3組的數(shù)據(jù)比較可以知道，HBsAg 6ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為9.1

21、0%，3ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為12.06%，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求，表示精細度高。而HBsAg1.5ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為16.78%，不符合ng/ml級RSD水平的一般應LOD，此標準曲線上最低濃度點為0.25，大于LOD0.167，故此標準曲線線性好。3. 討論3.1 乙肝外表抗原定量分析的意義乙肝外表抗原HBsAg是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標志。它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、淚水、鼻咽分泌物、精液及陰道分泌物中。在感染乙肝病毒后26個月，當丙氨酸氨

22、基轉(zhuǎn)移酶升高前28周時，可在血清中測到陽性結(jié)果。急性乙肝患者大局部可在病程早期轉(zhuǎn)陰，慢性乙肝患者該指標可持續(xù)陽性。乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的篩檢試驗、診斷、狀態(tài)監(jiān)測、臨床效果觀察起到了一定作用。但隨著臨床醫(yī)學的開展,乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠遠不能滿足臨床及患者的要求,特別是在療效觀察和乙肝疫苗的抗體產(chǎn)生上具有明顯的短缺。隨著檢驗醫(yī)學的開展,乙肝兩對半定量測量變得可行,大大彌補了乙肝兩對半定性檢測的缺乏。乙肝兩對半檢測和HBV DNA熒 光測定相互補充綜合評價患者病情與藥物療效，為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)【2】。這在目前的臨床治療中應用十分廣泛。3.2 常用定量分

23、析方法 此次實驗只是對一種試劑盒的可用性進展方法學驗證,而目前常用的定量方法已有很多，如酶聯(lián)免疫吸附試驗方法ELISA法和化學發(fā)光微粒子免疫分析法CMIA法TRFIA法對受檢標本進展乙肝外表抗原HBsAg的檢測是近十年開展起來的一種微量分析方法。全自動酶免分析儀目前也廣泛應有，自動化、標準化的操作手段使實驗到達了全過程控制和全過程標準化分析，大大提高了實驗的精細度【3】，使檢測結(jié)果更趨穩(wěn)定，從而保證了實驗結(jié)果的可靠性。3.3 方法概述酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 即將的抗原或抗體吸附在固相載體外表，使酶標記的抗原抗體反響在固相外表進展的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速

24、、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體，并且使包被抗體、酶.標抗體的結(jié)合位點盡可能的遠。以防止競爭抑制，最大程度地解決鉤狀效應HOOK的問題【4】。本次實驗是對實驗室的一種試劑盒，即酶聯(lián)生物生產(chǎn)的HBsAg的酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)定量分析試劑盒進展的方法學驗證，以判斷該試劑盒是否能用于臨床樣本分析。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗往預先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中，測定時，將待測樣品(含待測抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按一定程序與結(jié)合在固相載體上的抗原或抗體反響形成抗原抗體復合物;反響終止時，固相載體上酶標

25、抗原或抗體被結(jié)合量(免疫復合物)與待測標本中待檢抗體或抗原的量呈一定比例;經(jīng)洗滌去除反響液中其他物質(zhì)，參加底物進展顯色，顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度OD值，從而計算樣品濃度。 應用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8，4，2，1, 0.5 ，0.25ng/ml 6個濃度梯度做標準曲線，以6，3，1.5ng/ml 3個濃度梯度5復孔做質(zhì)控，進展準確度，精細度和檢測限等方法學驗證。選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是:因為絕大多數(shù)患者外周血中可出現(xiàn)HBsAg，含量在5ng/ml 600ug/ml之間，高者可達2000ugml以上【5】，滿足了現(xiàn)階段

26、文獻報道的最低濃度值。3.4 方法學驗證容 方法學驗證一般包括標準曲線，準確度，精細度和檢測限。標準曲線指樣品所測定的濃度值與吸光度的關(guān)系，以樣品濃度為*軸，以吸光度為Y軸，繪制回歸曲線，用回歸方程及R值來評件曲線的可信度，該實驗所用了6個濃度點建立標準曲線。方法準確度指待測濃度與真實濃度的符合程度，一般用相對回收率表示，要求在85%115%的圍。精細度則表示分析方法的可重復性，是對同一樣品每次測定結(jié)果的一致性，用標準偏差和相對標準偏差表示，可做板和板間的驗證，對于ug/ml級水平的相對標準偏差一般應10%, ng/ml級水平的相對標準偏差一般應15%。檢測限則表示分析低濃度樣品的能力，又稱靈

27、敏度，通常為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標準差。4 結(jié)果分析及應用評價 第一組數(shù)據(jù)標準曲線R2=0.9979，顯示具有良好的相關(guān)性，HBsAg 濃度為6ng/ml和3ng/ml 的回收率分別為為97.72%和106.40%，符合限度要求在85%115%的圍。但是HBsAg 濃度為1.5ng/ml的回收率為92.96%，顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測準確度不太好。在精細度方面，HBsAg 6ng/ml和1.5ng/ml的5個復孔的變異系數(shù)CV值為10.24%和12.23%，顯示孔間差異較大，精細度不高，但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求，其中有一孔濃度為4.55和1.21，與

28、其它孔比較差異較大，可能是由于操作不當引起。而3ng/ml的變異系數(shù)CV為7.52%，符合顯示孔間重復性還好，符合ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求，故可以認為此試劑盒批精細度尚可。在做3組數(shù)據(jù)的板間精細度分析時，發(fā)現(xiàn)6，3，1.51.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為9.10%，12.06%，16.78%，呈遞增趨勢，前兩個濃度滿足對ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求。1.5ng/ml的CV值為16.78%，不滿足ng/ml級RSD水平的一般應15%的要求，顯示低密度的孔間重復性差，精細度不高。 綜上分析，該試劑盒對于高濃度生物樣品的檢測具有良好的準確性和精細度，而對于低濃度樣品

29、的檢測在準確性和精細度方面都低于高濃度樣品，且與實際值有一定差值，因此不適合低濃度樣品的檢測。而目前絕大多數(shù)乙肝感染者外周血HBsAg濃度都很低，因此該試劑盒不能全面檢測出此類人群，故該試劑盒不能用于臨床標本的定量檢測。參考文獻【1】來，其敏努力規(guī)肝臟疾病的免疫學診斷中華檢驗雜志，2003，26：6971【2】曉梅，世蘭HBsAg陰性結(jié)果的慢性乙型肝炎患者病毒血癥水平與臨床的關(guān)系J】臨床檢驗雜志，2004，22(5)：381-382【3】 Weber B, Dengler T, Berger A .Evaluation of two new autom ated assays for hepatitis B virus surface HBsAg detection IMMUIITE HBsAg_and IMMUlITE 2000 HBsAg J J .Clin Microbiol,2003 ,41,(