體內(nèi)藥物分析方法建立與驗證課件

1、第四章 體內(nèi)藥物分析 方法的建立與驗證8/6/20221體內(nèi)藥物分析分析方法的設(shè)計依據(jù)分析方法建立的一般步驟分析方法驗證的內(nèi)容與要求體內(nèi)藥物分析應(yīng)用示例本章內(nèi)容提要8/6/20222體內(nèi)藥物分析【大綱要求】1、掌握體內(nèi)藥物分析方法的評價2、熟悉體內(nèi)藥物分析方法建立的思路、分析方法建立的一般實驗步驟8/6/20223體內(nèi)藥物分析第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)建立分析檢測方法的主要依據(jù)待測藥物的理化性質(zhì)及在生物體內(nèi)的存在狀況分析測定的目的與要求生物樣品的類型與預(yù)處理方法實驗室條件第四章 分析方法的建立與驗證8/6/20224體內(nèi)藥物分析一、待測藥物的理化性質(zhì)及體內(nèi)存在狀況 準確測定生物樣品中的藥物或其

2、特定代謝物通過一定的生物樣品預(yù)處理使待測物從結(jié)合物或綴合物中釋放出來。故此，應(yīng)首先考慮樣品預(yù)處理方法待測藥物的理化性質(zhì)藥物在生物體內(nèi)的存在狀況藥物在生物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化(代謝)途徑第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/20225體內(nèi)藥物分析(一)待測藥物的理化性質(zhì)藥物的pKa值、親脂性、溶解度、分配系數(shù)等預(yù)處理及檢測方法具有親脂性在適當(dāng)?shù)膒H值下用溶劑萃取具有強極性或親水性沉淀蛋白、固相萃取、離子對萃取或衍生化后萃取等具有揮發(fā)性GC測定法具有光譜或電化學(xué)特性分析檢測方法藥物的穩(wěn)定性萃取濃縮技術(shù)對酸堿不穩(wěn)定避免使用強酸或強堿性溶劑 對熱不穩(wěn)定避免高溫蒸發(fā)溶劑第四章 分析方法

3、的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/20226體內(nèi)藥物分析(二)待測藥物的體內(nèi)存在狀態(tài)與血漿蛋白結(jié)合的強弱及結(jié)合率的高低分離萃取方法蛋白結(jié)合較強不宜直接采用溶劑萃取體內(nèi)濃度高低、代謝過程及其代謝產(chǎn)物分析檢測技術(shù)濃度較低（尤其有代謝產(chǎn)物共存）代謝產(chǎn)物的干擾與特定代謝產(chǎn)物的同時測定采用LC-MS等分析檢測技術(shù) 第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/20227體內(nèi)藥物分析二、分析測定的目的與要求體內(nèi)藥物分析的目的影響分析方法的應(yīng)用藥代動力學(xué)研究藥物在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄過程血漿濃度隨時間的變化過程；代謝途徑及代謝產(chǎn)物要求同時測定原形藥物和代謝產(chǎn)物檢測寬線性范圍

4、(CmaxCmax的1/20)、高靈敏度(10-9g/ml)和高專屬性(分離能力)(原形藥物及其代謝產(chǎn)物的分離)方法不必強調(diào)方法的簡便、快速，大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù)，如HPLC、LC-MS第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/20228體內(nèi)藥物分析二、分析測定的目的與要求臨床治療藥物監(jiān)測 有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度方法盡量簡便、易行；適用于長期、批量樣品的測定，大多采用UV、RIA或EIA等。中毒患者的臨床搶救 藥物濃度極高方法不必強調(diào)方法的靈敏度，強調(diào)方法的特異性和分析速度大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù)GC、GC-MS、RIA或EIA第四章 分析方法的建立與驗證

5、第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/20229體內(nèi)藥物分析三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法生物樣品的類型與預(yù)處理方法決定分析方法的應(yīng)用以血漿或血清為分析樣品采用蛋白沉淀-溶劑萃取預(yù)處理技術(shù)分析樣品較為“干凈”，可用HPLC檢測用RIA分析樣品的預(yù)處理方法可較為粗放經(jīng)過簡單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測定第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/202210體內(nèi)藥物分析四、實驗室條件在設(shè)計體內(nèi)藥物分析方法時，還應(yīng)充分考慮到實驗室現(xiàn)有的或有可能在其它實驗室使用的儀器裝備，合理選擇可行的分析方法。第四章 分析方法的建立與驗證第一節(jié) 分析方法的設(shè)計依據(jù)8/6/202211體內(nèi)藥物分析

6、第二節(jié) 分析方法建立的一般步驟 一、分析方法的選擇二、分析方法的建立(一)檢測條件的篩選(二) 分離條件的篩選第四章 分析方法的建立與驗證8/6/202212體內(nèi)藥物分析一、分析方法的選擇體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計生物樣品中的藥物濃度決定分析方法的首要因素生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低、樣品量少難以通過增加取樣量提高方法靈敏度通過選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄟm應(yīng)樣品分析需求 體內(nèi)藥物分析中常用分析方法特點見表4-1第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202213體內(nèi)藥物分析二、分析方法的建立分析方法建立之前查閱文獻資料充分了解藥物在體內(nèi)的動力學(xué)過程 避免受到代謝產(chǎn)物的干擾，

7、選擇適用于實際生物樣品測定的方法第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202214體內(nèi)藥物分析8/6/202215體內(nèi)藥物分析8/6/202216體內(nèi)藥物分析8/6/202217體內(nèi)藥物分析8/6/202218體內(nèi)藥物分析Medline8/6/202219體內(nèi)藥物分析8/6/202220體內(nèi)藥物分析8/6/202221體內(nèi)藥物分析二、分析方法的建立初步擬定分析方法后進行一系列試驗工作選擇最佳分析條件同時驗證分析方法的可行性確認是否適用于實際生物樣品分析方法的建立和驗證過程是不可截然劃分的分析方法的建立步驟第一步：檢測條件的篩選第二步：分離條件的篩選第四章 分析方法的建立

8、與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202222體內(nèi)藥物分析(一)檢測條件的篩選標(biāo)準物質(zhì) 照擬定的分析方法(不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理)測定 確定最佳分析檢測條件(如色譜條件)和檢測靈敏度HPLC 調(diào)整檢測器(類型、條件) 、色譜柱(型號、牌號、填料性狀與粒經(jīng)、柱長度)、流動相(組分及其配比)及其流速、柱溫、進樣量、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度及其加入量等 使各物質(zhì)具有足夠的方法靈敏度(LOQ) 良好的色譜參數(shù)(n、R、T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r間(tR)第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202223體內(nèi)藥物分析(二)分離條件的篩選在進行分離條件篩選時，應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝

9、產(chǎn)物對分離與檢測的干擾，步驟如下：1空白溶劑試驗 溶劑(方法特異性)2空白生物基質(zhì)試驗 (方法特異性)3模擬生物樣品試驗 方法效能指標(biāo)4實際生物樣品測試 代謝產(chǎn)物(方法特異性)第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202224體內(nèi)藥物分析1空白溶劑試驗待測藥物的非生物基質(zhì)溶液（通常為水溶液）采用擬定的分析方法進行衍生化反應(yīng)、萃取分離等 樣品預(yù)處理（反應(yīng)試劑、衍生化試劑、萃取溶劑等）測定響應(yīng)信號（如HPLC峰面積或峰高）考察目標(biāo)方法的特異性空白值應(yīng)盡可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202225體內(nèi)藥物分析對色譜分析法而言可

10、通過改變反應(yīng)條件、萃取方法或萃取條件（萃取溶劑的極性、混合溶劑的配比，固相萃取填料性質(zhì)、沖洗劑與洗脫劑及其用量等），甚至檢測器類型空白試劑信號應(yīng)不干擾藥物的測定（如R1.5） 本步驟主要考察需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過程，若預(yù)處理過程僅為生物樣品的提取分離，則可不進行該步驟，直接進行空白生物基質(zhì)試驗 第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202226體內(nèi)藥物分析2. 空白生物基質(zhì)試驗空白生物基質(zhì) (blank biological matrix)如空白血漿照 “空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標(biāo)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)對測定的干擾（方法特異性）在待測藥物(或特定的活性代謝物、內(nèi)

11、標(biāo)物質(zhì)等)的“信號窗” 內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)信號第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202227體內(nèi)藥物分析8/6/202228體內(nèi)藥物分析8/6/202229體內(nèi)藥物分析3. 模擬生物樣品試驗 模擬生物樣品(質(zhì)量控制,QC樣品)空白生物基質(zhì)中加入待測藥物，照 “空白溶劑試驗” 項下方法操作考察目標(biāo)：方法的線性范圍、精密度與準確度、靈敏度藥物的萃取回收率等各項技術(shù)指標(biāo) 同時進一步檢驗生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對測定的干擾程度，即方法特異性第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202230體內(nèi)藥物分析對色譜分析法而言進一步考察

12、待測藥物(或內(nèi)標(biāo)物)與內(nèi)源性物質(zhì)(或其它藥物)的分離情況色譜峰的 tR、n 和 T 是否與水溶液的一致 色譜峰是否為單一成分（如何確定？） 標(biāo)準曲線的截距是否顯著偏離零點等內(nèi)源性物質(zhì)是否對待測藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202231體內(nèi)藥物分析Blank plasma8/6/202232體內(nèi)藥物分析Blank plasma spiked with St. and IS8/6/202233體內(nèi)藥物分析8/6/202234體內(nèi)藥物分析4. 實際生物樣品的測試空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗確定的分析方法及其條件不能完全確認是否適合于實際生物樣品

13、的測定藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合(如血漿蛋白結(jié)合物)或代謝生成數(shù)個代謝產(chǎn)物及其進一步的結(jié)合物(或綴合物)實際生物樣品確立分析方法后，尚需進行實際生物樣品的測試考察目標(biāo)：代謝產(chǎn)物對藥物、內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的干擾情況進一步驗證方法的可行性第四章 分析方法的建立與驗證第二節(jié) 分析方法的建立步驟8/6/202235體內(nèi)藥物分析an extracted plasma sample from a healthysubject (6 h after oral administration of orphenadrine)8/6/202236體內(nèi)藥物分析8/6/202237體內(nèi)藥物分析8/6/202238體內(nèi)藥物分

14、析8/6/202239體內(nèi)藥物分析8/6/202240體內(nèi)藥物分析8/6/202241體內(nèi)藥物分析8/6/202242體內(nèi)藥物分析8/6/202243體內(nèi)藥物分析第三節(jié) 分析方法驗證的內(nèi)容與要求 基于以下原因需要對建立的分析方法學(xué)進行驗證：1、生物樣品量少2、濃度低3、內(nèi)源性物質(zhì)的干擾4、生物的個體差異較大8/6/202244體內(nèi)藥物分析用于實際生物樣品分析之前：需要驗證 (validation) 分析方法的可行性與可靠性方法驗證時應(yīng)考慮影響分析方法的所有可變因素： 采樣、樣品制備、色譜分離、檢測與數(shù)據(jù)評價使用的技術(shù)指標(biāo)效能指標(biāo)使用的樣品通常采用模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品第四章 分析方

15、法的建立與驗證8/6/202245體內(nèi)藥物分析驗證步驟首先為分析方法的驗證特異性、精密度與準確度、回收率、定量限與檢測限、溶液穩(wěn)定性其次為生物基質(zhì)中待測藥物穩(wěn)定性的驗證室溫放置、冷凍（或冷藏）、凍-融循環(huán) Freeze-and-thaw cycle第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202246體內(nèi)藥物分析驗證的效能指標(biāo)與基本要求1特異性（專屬性）避免干擾2標(biāo)準曲線與線性范圍覆蓋所有濃度范圍3準確度與實際狀況相符4精密度結(jié)果可重現(xiàn)5定量限達到峰濃度的1/101/206穩(wěn)定性確保所有樣品準確測定7提取回收率確保準確度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與

16、要求8/6/202247體內(nèi)藥物分析一、方法特異性(專屬性或選擇性)方法的特異性(specificity)又稱專屬性或?qū)Ｒ恍裕ǔＥc選擇性(selectivity)互用系指當(dāng)有內(nèi)源性物質(zhì)存在時，方法準確測定待測物質(zhì)的能力專屬性表示所檢測的信號(響應(yīng))系屬于待測藥物所特有選擇性系指將待測物質(zhì)與其代謝物及同服的其它藥物加以區(qū)分(分離)的能力特異性函蓋二者，以驗證所測定的物質(zhì)與待測藥物的同一性 考察一個分析方法是否具有特異性，應(yīng)著重考慮以下幾點：第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202248體內(nèi)藥物分析1. 內(nèi)源性物質(zhì)的干擾比較待測藥物或其活性代謝產(chǎn)物檢測信號 對照品（

17、或標(biāo)準品） 空白生物基質(zhì) 模擬生物樣品（空白生物基質(zhì)中添加對照品）如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致 及與內(nèi)源性物質(zhì)色譜峰的 R確證內(nèi)源性物質(zhì)對分析方法有無干擾第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202249體內(nèi)藥物分析2. 代謝產(chǎn)物的干擾 比較模擬生物樣品和用藥后的實際生物樣品的檢測信號與代謝產(chǎn)物的 R如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 或改變色譜條件(色譜柱)再比較來確證其它代謝產(chǎn)物對分析方法有無干擾結(jié)構(gòu)已知的特定活性代謝物的測定通過HPLC-DAD和LC-MS確證色譜峰的單純性和同一性對于結(jié)構(gòu)未知的代謝產(chǎn)物的測定采用LC-LC-NMR進行結(jié)構(gòu)的初

18、步推測后，考察其干擾情況第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202250體內(nèi)藥物分析3. 聯(lián)合藥物的干擾TDM時 還要考慮患者可能同時服用藥物的干擾 通過比較待測藥物及可能同時服用藥物的模擬生物樣品的檢測信號如HPLC色譜峰的 tR、n 和 T 是否一致來確證同時服用藥物對分析方法的干擾情況第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202251體內(nèi)藥物分析4. 與參比方法的相關(guān)性 除上述方法外，有時還可使用參比方法對照參比方法一般選用特異性強、準確度高、線性關(guān)系良好的色譜法，如在TDM中使用UV(或RIA)時, 可以HPLC(或GC)為參比 參

19、比方法測定結(jié)果為橫坐標(biāo)(X); 擬定方法結(jié)果為縱坐標(biāo)(Y)用最小二乘法計算回歸方程 YabX (坐標(biāo)標(biāo)度相等)、相關(guān)系數(shù)(r)表示兩種方法測得結(jié)果的一致性，若 r 1，表示擬定方法為非線性，如 RIA 中抗血清滴度選擇不當(dāng)?shù)谒恼?分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202252體內(nèi)藥物分析4. 與參比方法的相關(guān)性YabX 截距(a) 表示擬定方法受到恒定干擾的程度內(nèi)源性物質(zhì)(UV)斜率(b) 表示擬定方法受到比例干擾的程度標(biāo)記抗原不純(RIA)與參比方法的相關(guān)性比較除顯示分析方法的特異性外斜率b表示兩種方法測得結(jié)果的一致性若參比方法準確度良好，且截距a0, 則擬定方法的準確

20、度(回收率)為100b(%)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202253體內(nèi)藥物分析二、標(biāo)準曲線與線性范圍標(biāo)準曲線（standard curve） calibration curve or working curve生物樣品中所測定藥物濃度與響應(yīng)的相關(guān)性（比例的程度）通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評價除少數(shù)方法（免疫分析法）外，標(biāo)準曲線通常為線性模式回歸分析法為最小二乘法（least squares）或加權(quán)最小二乘法（weighted least squares）線性范圍（linear rang）標(biāo)準曲線的最高與最低濃度的區(qū)間模擬生物樣品的測定結(jié)果應(yīng)達到試驗

21、要求的精密度和準確度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202254體內(nèi)藥物分析二、標(biāo)準曲線與線性范圍(續(xù))標(biāo)準曲線用模擬生物樣品建立線性范圍(不包括零點)應(yīng)能覆蓋全部生物樣品中的藥物濃度不能使用外推的方法求算未知生物樣品中的藥物濃度建立標(biāo)準曲線所使用的模擬生物樣品應(yīng)使用與待測的含藥生物樣品相同的生物基質(zhì)制備第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202255體內(nèi)藥物分析標(biāo)準曲線的一般建立方法 標(biāo)準系列溶液的制備內(nèi)標(biāo)溶液的制備標(biāo)準系列模擬生物樣品的制備標(biāo)準曲線的繪制加權(quán)最小二乘法限度要求8/6/202256體內(nèi)藥物分析標(biāo)準曲線的一般建立方法

22、1. 標(biāo)準系列溶液的制備 標(biāo)準物質(zhì)對照品、標(biāo)準品溶劑水或甲醇（或其他適當(dāng)溶劑）濃度模擬生物樣品中藥物濃度的50倍以上 加入量為生物樣品總體積的2%以下 避免標(biāo)準模擬生物樣品與實際樣品存在較大差異濃度較低應(yīng)除去溶劑后再加入生物基質(zhì) 否則,在實際樣品測定時應(yīng)加入等體積的溶劑并渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202257體內(nèi)藥物分析至少含58個濃度點(不包括零點,即空白)可覆蓋全部待測生物樣品中的藥物濃度如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式比例常數(shù)約為 2)若體內(nèi)平均達峰濃度為50，其1/20為2.5設(shè)定最高濃度為100，最低濃度為1 (個

23、體差異)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202258體內(nèi)藥物分析2、內(nèi)標(biāo)溶液的制備內(nèi)標(biāo)物質(zhì)對照品、標(biāo)準品或化學(xué)試劑適宜的溶劑甲醇、水、乙腈或混合溶劑濃度與標(biāo)準系列溶液的中間濃度相當(dāng)如：某標(biāo)準溶液5、10、20、40、80、160、320 g/ml，則內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)配制成40 g/ml8/6/202259體內(nèi)藥物分析3. 標(biāo)準系列模擬生物樣品的制備 空白生物基質(zhì)(如血漿)加入標(biāo)準系列溶液適量，渦旋混勻為防止在標(biāo)準溶液加入及渦旋混合時造成的損失先加入標(biāo)準溶液 再加入空白生物基質(zhì)渦旋混勻 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202260體內(nèi)藥

24、物分析實驗中的注意事項：1、標(biāo)準模擬生物樣品的最高濃度應(yīng)高于生物體用藥后的達峰濃度，最低濃度應(yīng)低于最高濃度的105。2、應(yīng)先在離心試管中加入標(biāo)準溶液，再加入空白生物基質(zhì)后混懸3、標(biāo)準溶液加入到試管中后，應(yīng)先揮干溶劑再加入空白生物基質(zhì)。8/6/202261體內(nèi)藥物分析4. 標(biāo)準曲線的繪制以待測藥物的檢測響應(yīng)(如色譜峰面積或峰高) 或與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的檢測響應(yīng)的比值(內(nèi)標(biāo)法)(因變量, y )對模擬血藥濃度 (自變量,x)求得回歸方程( yabx )及其相關(guān)系數(shù)( )在一組由至少7個濃度(不包括零點)構(gòu)成的標(biāo)準曲線中，至多可有2個濃度點數(shù)據(jù)，可予剔除。但應(yīng)有確切原因，如：（1）樣品處理有損失；（2）色譜

25、圖有問題；（3）顯著偏離標(biāo)準曲線其余應(yīng)有至少5個濃度點在標(biāo)準曲線上第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202262體內(nèi)藥物分析5. 加權(quán)最小二乘法 普通最小二乘法每個濃度點絕對誤差(yiyi)賦予同等的重要性 標(biāo)準曲線上的高低濃度相差懸殊(范圍達102)低濃度區(qū)的計算值相對誤差過大，難以滿足規(guī)定要求。加權(quán)最小二乘法回歸計算時增加一個權(quán)重因子(w)各濃度的響應(yīng)值與回歸值的相對離差平方和達到最小 式中，wi為標(biāo)準曲線上第i個濃度點的權(quán)重因子第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202263體內(nèi)藥物分析1）回歸方程(y = a + b x)參數(shù)的

26、計算第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202264體內(nèi)藥物分析2）權(quán)重因子的選擇加權(quán)賦予低濃度點以更大的權(quán)重在實際工作中的一般方法（1）當(dāng)wi=1/(yi)2時，則（2）而yi與xi成正比（3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2 (通常取wi=1/C2)當(dāng)高濃度點測量值的準確度下降過大低濃度點權(quán)重過大，降低低濃度點的權(quán)重，wi=k/xi第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202265體內(nèi)藥物分析標(biāo)準曲線的限度要求藥代動力學(xué)或生物利用度研究標(biāo)準曲線至少包括5個濃度(通常為58個濃度,不包括零點)最高濃度應(yīng)高于達峰濃度(Cmax)；

27、最低濃度應(yīng)低于Cmax的10%5%，并應(yīng)為方法的LOQ(非LOD)回歸方程的截距應(yīng)接近于零，b使之具有較高的靈敏度相關(guān)系數(shù)要求 0.99(色譜法)或0.98(生物學(xué)方法)若非線性，可分為高低兩個濃度區(qū)間(每個區(qū)間不少于5個濃度)，分別加權(quán)回歸如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202266體內(nèi)藥物分析三、準確度方法準確度(accuracy)系指用該方法測得的生物樣品中待測藥物的濃度與其真實濃度的接近程度應(yīng)使用實際生物樣品測定，但實際生物樣品的濃度是未知的所以，通常使用模擬生物樣品測定一般用相對回收率(rela

28、tive recovery，RR) 或 相對誤差(relative error，RE)表示第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202267體內(nèi)藥物分析1. 測定法 取空白生物基質(zhì)（如血漿）數(shù)份，照標(biāo)準曲線項下方法操作，用標(biāo)準曲線計算 在標(biāo)準曲線范圍內(nèi)制備質(zhì)控(quality control，QC)樣品高(接近上限)、中、低(接近LOQ) 3個濃度每一濃度至少5個樣本與隨行的標(biāo)準曲線同法測定、計算，每個樣品分析測定1次 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202268體內(nèi)藥物分析2. 結(jié)果計算與限度要求計算測定值M(measured)的平均

29、值與理論濃度(加入值)A(added)比值相對回收率相對誤差限度要求相對回收率應(yīng)在85%115% (LOQ附近80%120%)RE在15% (LOQ附近為20%)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202269體內(nèi)藥物分析8/6/202270體內(nèi)藥物分析四、精密度方法精密度(precision )系指每次測定結(jié)果與多次測定的平均值的偏離程度表示該分析方法的可重復(fù)性(reproducibility)反映分析方法的可操作性，是方法驗證的基本要點之一實際生物樣品的量有限(如血漿，一般為0.52ml)使用模擬生物樣品測定 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與

30、要求8/6/202271體內(nèi)藥物分析1. 表示方法方法精密度一般用標(biāo)準偏差(standard deviation，SD)或相對標(biāo)準偏差(relative standard deviation，RSD)表示 SD=RSD= =批內(nèi)(within-run或intra-assay)RSD日內(nèi)(within-day)批間(between-run或inter-assay)RSD日間(between-day，day-to-day)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202272體內(nèi)藥物分析2. 測定法分別測定法()照準確度項下方法，取空白生物基質(zhì)(如血漿)數(shù)份，分別在同一批內(nèi)和

31、不同批間制備高、中、低 3個濃度的QC樣品，并分析測定批內(nèi)RSD每一濃度56個樣品，每個樣品測定1次，用隨行標(biāo)準曲線分別計算3個濃度及每1濃度的RSD批間RSD每1分析批內(nèi)每一濃度制備1個樣品，每個樣品測定1次；用隨行標(biāo)準曲線計算3個濃度(每一濃度56個分析批數(shù)據(jù))的RSD第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202273體內(nèi)藥物分析2. 測定法連續(xù)測定法()若實際樣品測定所用的分析批次少于5批，也可進行3個批次的連續(xù)分析(每1濃度的每1批次為56個樣本)方差分析法 批間RSD =批內(nèi)RSD = =第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202

32、274體內(nèi)藥物分析3. 限度要求在藥代動力學(xué)和生物利用度研究中對g/ml級水平的RSD一般應(yīng)10%ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)15%在LOQ附近RSD應(yīng)20%。 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202275體內(nèi)藥物分析8/6/202276體內(nèi)藥物分析五、定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保證具有一定可靠性(準確度與精密度符合要求)的前提下，能測定出生物樣品中藥物的最低濃度,又稱為方法靈敏度(sensitivity)標(biāo)準曲線上的最低濃度點(最低濃度點LOQ)要求應(yīng)能滿足測定35個消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度或Cmax

33、的105)準確度在80%120%(或RE在20%的范圍內(nèi))RSD20%第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202277體內(nèi)藥物分析最低檢測限（limit of detection LOD）：是指可在噪音水平下識別樣品中藥物的最低濃度，一般認為信噪比（S/N）3，信號可被檢測，故以S/N）3時的樣品濃度作為LOD. LOQ的檢測信號至少是LOD的2倍以上，以（S/N）10作為LOQ的估計值。8/6/202278體內(nèi)藥物分析LOD TestS/N38/6/202279體內(nèi)藥物分析六、穩(wěn)定性在生物樣品的分析中，需要對樣品的存放條件和時間進行考察，以保證分析結(jié)果的準確、可靠

34、 方法穩(wěn)定性考察 生物樣品的穩(wěn)定性考察 相關(guān)穩(wěn)定性的測定方法與要求8/6/202280體內(nèi)藥物分析方法穩(wěn)定性：主要考察待測藥物的標(biāo)準品溶液在實驗室溫度、濕度、光照及空氣等條件下的穩(wěn)定性 在分析方法的建立時要考慮模擬生物樣品的預(yù)處理及待測物在室溫或冰箱中存放的穩(wěn)定性8/6/202281體內(nèi)藥物分析生物樣品的穩(wěn)定性短期穩(wěn)定性主要考察模擬生物樣品在室溫、4或20以及凍融循環(huán)條件下的穩(wěn)定性長期穩(wěn)定性主要考察生物樣品長期冰凍（20 或80）后的穩(wěn)定性8/6/202282體內(nèi)藥物分析測定方法與要求1、取高、中、低三個濃度的QC樣品，在不同條件下存放不同時間后，每個樣品重復(fù)測定三次，平均值應(yīng)為零時測定的5以

35、內(nèi)（經(jīng)衍生化處理15以內(nèi)）。若考察時間大于1天，則應(yīng)與新制QC樣品比較，若考察時間很長，可與反復(fù)在液氮中保存的樣品在相同條件下的測定值比較2、穩(wěn)定性期限要求室溫下1個工作日（1、2、4、8、24）冰箱中數(shù)個工作日（數(shù)星期、數(shù)月）8/6/202283體內(nèi)藥物分析七、萃取回收率生物樣品的預(yù)處理方法（1）方法準確度(或相對回收率，relative recovery)，操作簡便、快速（2）萃取回收率(絕對回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率與相對回收率的比較（1）萃取回收率主要考察生物樣品預(yù)處理過程造成的藥物的程度損失（2）相對回收率主要用來考察測定方法的準確度，采用標(biāo)準曲線

36、可準確計算生物樣品中藥物濃度第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202284體內(nèi)藥物分析1. 測定法取空白生物基質(zhì)(如血漿)，制備高、中、低3個濃度的QC樣品(每一濃度至少5個樣品)，每個樣品分析測定1次另取等量的相同3個濃度的標(biāo)準溶液，用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘渣的溶劑稀釋至同體積，同法測定AT經(jīng)萃取后的QC樣品的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法)AS未經(jīng)萃取的標(biāo)準溶液的檢測信號或比值(內(nèi)標(biāo)法)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202285體內(nèi)藥物分析實驗過程中的注意事項1、要考察是內(nèi)源性物質(zhì)還是提取方法對提取回收率產(chǎn)生影響2、如采用內(nèi)

37、標(biāo)法定量時，內(nèi)標(biāo)應(yīng)在提取之后，溶劑蒸發(fā)之前加入3、采用內(nèi)標(biāo)法定量時，應(yīng)同時測定內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率，只需配制一個中間濃度的QC樣品5份8/6/202286體內(nèi)藥物分析2. 限度要求在生物利用度或TDM時高、中、低濃度樣品的萃取回收率一般應(yīng)50%高、中濃度的RSD應(yīng)15%低濃度的RSD應(yīng)20%內(nèi)標(biāo)法中內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的提取回收率應(yīng)50%（RSD 15%) 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202287體內(nèi)藥物分析8/6/202288體內(nèi)藥物分析八、質(zhì)量控制該內(nèi)容主要目的是用來在實際生物樣品的測定過程中對分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進行監(jiān)控1、質(zhì)控樣品（Quality control QC

38、）：是指將已知量的待測藥物加入到空白生物基質(zhì)中配制的模擬生物樣品，用于整個分析過程中的質(zhì)量控制，一般配制高、中、低三個濃度的樣品 質(zhì)控樣品池由不負責(zé)生物樣品測試的人員在實驗開始時制備，并與實際生物樣品在相同條件下儲存8/6/202289體內(nèi)藥物分析2、質(zhì)量控制（1）測定法：在測定過程中，每批生物樣品都應(yīng)建立隨行的標(biāo)準曲線，并隨行間隔以高低或低高測定高、中、低至少3個濃度的6個QC樣品（2）限度要求：6個QC樣品中至少4個的測定結(jié)果的準確度在各自正常濃度80120，RSD 20%,允許由2個QC樣品超出各自的208/6/202290體內(nèi)藥物分析九、生物樣品測定中其它需要注意的事情1、干擾性內(nèi)源性

39、物質(zhì)的排除方法2、測定方法的再評價或交互驗證3、實際生物樣品濃度超出線性范圍的處理8/6/202291體內(nèi)藥物分析合適的空白生物基質(zhì)的制備方法：1、對生物基質(zhì)進行處理2、使用不含內(nèi)源性物質(zhì)的生物基質(zhì)3、使用替代基質(zhì)8/6/202292體內(nèi)藥物分析方法的再評價或交叉驗證：1、改變色譜條件或生物樣品的處理方法樣品的前處理方法改變后需要對效能指標(biāo)進行重新考察2、改變生物基質(zhì)不同物種的生物基質(zhì)進行同一藥物的PK實驗時，需要進行方法的再評價8/6/202293體內(nèi)藥物分析實際濃度超出標(biāo)準曲線的處理：1、濃度高于定量上限取樣品用空白基質(zhì)稀釋，同時制備高于定量上限的QC樣品，同法稀釋2、濃度低于LOQ增加生

40、物樣品的體積，應(yīng)在相同條件下制備QC樣品和增加體積后的空白生物基質(zhì)進行試驗，以確認方法的準確度、精密度和特異性符合要求。8/6/202294體內(nèi)藥物分析第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法應(yīng)用示例第三代喹諾酮類廣譜抗菌藥鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性研究一、文獻調(diào)研在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中極微溶解，在氯仿中幾乎不溶，在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中極微溶解，在稀醋酸中溶解。 第四章 分析方法的建立與驗證8/6/202295體內(nèi)藥物分析藥動學(xué)參數(shù)吸收過程空腹口服后吸收迅速、人體生物利用度約為49%70%Cmax 口服500mg后平均Cmax為2.42.6mg/LTm

41、ax 12hT1/2 血中T1/2約為4h，腎功能減退時稍有延長至6h蛋白結(jié)合率0%40%代謝口服給藥24h內(nèi)，40%50%原形、15%代謝物經(jīng)腎排出第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202296體內(nèi)藥物分析體內(nèi)分析方法RP-HPLC色譜柱ODS色譜柱流動相甲醇(乙腈)-磷酸(枸櫞酸)緩沖液(三乙胺調(diào)節(jié)pH2.33.5)，或離子對色譜: 溴化十六烷基三甲基銨(氫氧化四丁基銨)檢測紫外或熒光檢測生物樣品預(yù)處理蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進樣溶劑萃取法二氯甲烷-異丙醇、氯仿-異丙醇混合溶劑蛋白沉淀-溶劑萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-異丙醇提取 第四章 分析

42、方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202297體內(nèi)藥物分析二、分析方法設(shè)計1分析方法血漿蛋白結(jié)合率低(20%40%)、以原形從腎排泄生物等效性研究測定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度-時間曲線。初步擬定：采用RP-HPLC法2檢測方法紫外靈敏度1ng，若取血漿0.5ml，采用3倍量乙腈沉淀蛋白，取上清液100l進樣，則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在50ng/ml以上，當(dāng)Cmax在2g/ml以上(口服500mg)時基本可滿足生物等效性研究要求熒光靈敏度0.1ng，能滿足本試驗要求 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202298體內(nèi)藥物分析3樣品制備方法初步擬

43、定采用簡便、快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進樣分析預(yù)試含75%乙腈的提取液100l進樣后，色譜峰理論板數(shù)、對稱性下降(前沿峰)，進而導(dǎo)致檢測靈敏度降低(峰高降低)經(jīng)進一步試驗，確定為：血漿0.5ml乙腈1ml沉淀蛋白二氯甲烷-異丙醇(95:5)5ml萃取60氮氣流吹干流動相200l溶解20l進樣靈敏度可達2ng/ml(血漿濃度)，符合要求(Cmax2g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/202299體內(nèi)藥物分析三、實驗方案1給藥方案 20名受試者隨機分為兩組，每組10人第1次試驗第一組口服受試制劑(相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg)，第二組口服相同劑量的參比制劑

44、第2次試驗第1次服藥后第7天開始，兩組交換給藥第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022100體內(nèi)藥物分析2血樣的采集與處理分別口服給藥前和給藥后0.25、0.5、1.0、1.5(tmax)、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0和24.0(57個t1/2)小時由肘正中靜脈取血 4 ml立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中，靜置5分鐘后，離心15分鐘(3000rpm)，分離血漿，-20冰箱中保存待測第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022101體內(nèi)藥物分析3血樣分析法色譜條件高效液相色譜儀(包括LC-10ATvp泵，RF-530

45、熒光檢測器)；色譜柱為Kromasil ODS-AP(200mm4.6 mm，5m)流動相為乙腈-0.025mol/L磷酸溶液(86:14)，流速1.0ml/min檢測波長為ex=277nm，em=445nm柱溫為40。 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022102體內(nèi)藥物分析3血樣分析法血漿樣品的預(yù)處理取血漿0.5ml，加內(nèi)標(biāo)溶液(10g/ml諾氟沙星甲醇溶液）50 l、乙腈1.0ml，渦旋混合30s，離心5min，取上清液1ml，加二氯甲烷-異丙醇(95:5)混合溶劑5ml，渦旋振蕩1min，離心5min，棄去上層水相，吸取下層有機相，60下氮氣流吹干，殘

46、渣加流動相200l，渦旋溶解30s，離心5min，取上清液20l進樣 第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022103體內(nèi)藥物分析四、分析方法驗證1方法特異性環(huán)丙沙星峰tR=12.4min，諾氟沙星(內(nèi)標(biāo)物質(zhì))tR=10.9min，各峰均獲得完全分離，內(nèi)源性物質(zhì)峰(與空白血漿樣品一致)tR=8.6min對測定無干擾。志愿者用藥后的血漿樣品色譜圖中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰與模擬血漿樣品中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的tR、T、n和R均一致，峰形相同。故不認為代謝物有干擾第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022104體內(nèi)藥物分析2標(biāo)準曲線標(biāo)準系列溶

47、液取鹽酸環(huán)丙沙星，加水制成1、2、5、10、20和50g/ml的標(biāo)準系列溶液，冰箱保存標(biāo)準系列模擬血漿樣品取空白血漿0.5ml，加環(huán)丙沙星標(biāo)準系列溶液各50l，配制成相當(dāng)于濃度為0.1，0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 g/ml的QC樣品，冰凍(-20)測定法取QC樣品，照“血漿樣品的預(yù)處理”項下方法操作，以環(huán)丙沙星濃度C為橫坐標(biāo)，環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值Y為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法經(jīng)Excel運算，求得的直線回歸方程為：Y=1.33C-0.02583，R2=0.9951(C=0.15.0 g/ml)第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022105體內(nèi)

48、藥物分析3方法精密度與準確度QC樣品濃度為 0.1、0.5 和 2.0 g/ml分析批次3批，每批 5 樣品測得濃度0.0988、0.4537 和 2.128 g/ml準確度RE(%)-1.2%、-9.3% 和 6.4%精密度批內(nèi)(%)6.7%、4.6% 和 3.9%批間(%)8.9%、9.6% 和 12.3%第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求8/6/2022106體內(nèi)藥物分析4方法定量限受試制劑和參比制劑的Cmax分別為3.2020.496和3.3000.730 g/ml方法的LOQ為0.1 g/ml 0.16 g/ml (Cmax的1/20)準確度和精密度均符合要求：

49、RE為-1.2% 日內(nèi)RSD為 6.7% 日間RSD為 8.9%8/6/2022107體內(nèi)藥物分析第四章 分析方法的建立與驗證第三節(jié) 分析方法的驗證與要求表4-2 血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結(jié)果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457.12179.6 95.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.22 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1105.9487.82251.3 9

50、5.8456.82252.2 86.3456.82240.93 97.6450.71911.6103.8446.91993.0 99.5436.62115.7105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD 6.8 19.7 118.7RE（%）-1.2 -9.3 6.4批內(nèi)RSD（%） 6.7 4.6 3.9批間RSD（%） 8.9 9.6 12.3表4-2 血漿中環(huán)丙沙星HPLC測定法的準確度與精密度考察結(jié)果分析批次加入量（ng/ml）100.0500.020001100.8457

51、.12179.6 95.7451.02212.1105.4438.02084.9105.1447.12129.3104.3449.02190.1106.4469.42135.22 96.9465.72168.1 98.5497.92192.6 95.7468.12207.1105.9487.82251.3 95.8456.82252.2 86.3456.82240.93 97.6450.71911.6103.8446.91993.0 99.5436.62115.7105.3427.51990.5 82.4416.21847.1 93.7443.72203.6N181818（ng/ml）98.8453.72128.0SD 6.8 19.7 118.7RE（%）-1.2 -9.3 6.4批內(nèi)RSD（%） 6.7 4.6 3.9批間RSD（%） 8.9 9.6 12.3血漿冰凍血漿凍融殘渣冷藏室溫放置時間（d）As/Ai循環(huán)次As/Ai時間（d）As/Ai時間（h）As/Ai02.728604.359502.989203.4263102.911314.490212.978183.4350202.781924.313923.0595243.4